表达单克隆抗体的CHO细胞无蛋白培养基的优化

在自主研发无蛋白培养基的基础上,考察了氨基酸、维生素和葡萄糖对CHO细胞生长、代谢与抗体合成的影响。结果表明,对培养过程中消耗较多的氨基酸进行补充,虽然不能促进细胞生长,但有利于培养后期细胞活性维持与抗体合成;B族维生素的添加能促进细胞生长并延长培养时间;作为重要的碳源和能源,葡萄糖浓度较高时会抑制细胞生长,而浓度较低时不能有效支持细胞生长与抗体合成,维持其在适当浓度有利于细胞生长并能延长培养时间,从而有利于提高抗体产量。通过合理调整各营养物的浓度配比形成了优化的无蛋白培养基,CHO细胞在该培养基中的最高密度达到52.6×105cells mL 1,抗体产量达到274 mg L 1,与初始培养基相比分别提高了33%和63%。总之,在细胞培养过程中应维持充足且平衡的营养物成分,以有效供应细胞生长与抗体合成的需求。     

Plackett-Burman与响应面法相结合优化化学成分明确的MDCK细胞无血清无蛋白培养基

目的采用Plackett-Burman与响应面法相结合优化化学成分明确的MDCK细胞无血清无蛋白培养基。方法在自主研发的含蛋白无血清培养基的基础上,通过Plackett-Burman试验和响应面试验设计考察23组营养物质对MDCK细胞生长的影响,以细胞比生长速率、维持时间及最大活细胞密度作为响应值进行筛选和定量优化。以最优化的因子浓度配制化学成分明确的无血清无蛋白培养基,分别于细胞培养板和搅拌瓶中培养MDCK细胞,考察细胞比生长速率、维持时间和最大活细胞密度3个响应值的大小。结果通过Plackett-Burman试验筛选出4种对MDCK细胞生长具有显著性促进作用的因子:半胱氨酸、苏氨酸、亮氨酸和葡萄糖,苏氨酸和亮氨酸有助于提高细胞比生长速率,半胱氨酸和葡萄糖有利于提高最大活细胞密度;该化学成分明确的无血清无蛋白培养基能很好地支持MDCK细胞悬浮生长,单细胞悬浮培养MDCK细胞时,细胞比生长速率可达0.058/h,最大活细胞密度可达32.65×105个/ml,分别比基础培养基提高了2.15和3.09倍。结论采用Plackett-Burman与响应面法相结合优化了化学成分明确的MDCK细胞无血清无蛋白培养基,为采用MDCK细胞大规模工业化生产流感疫苗奠定了基础。     

生物反应器无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞工艺的建立

目的建立无血清无蛋白无动物源性培养基BD001悬浮培养MDCK-siat7e细胞的工艺,为MDCK-siat7e细胞的生物反应器规模化培养及病毒性疫苗的研制提供依据。方法采用BD001驯化MDCK-siat7e细胞,建立无血清无蛋白无动物源性MDCK-siat7e细胞库,对细胞库进行常规检定,观察MDCK-siat7e细胞的生长形态;比较不同起始接种密度(4.0×10~5、8.0×10~5、1.6×10~6 cells/ml)悬浮培养,MDCK-siat7e细胞达到平台期的时间、平台期细胞密度及活率;比较不同规模生物反应器(3、15、60 L)无血清无蛋白无动物源性培养MDCK-siat7e细胞对数生长期的比生长速率(μ)、分裂次数(Cd)、葡萄糖比消耗速率(q_(gluc))、乳酸对葡萄糖的转化率(Y_(lac)/g_(luc)),观察细胞的生长和代谢情况。结果建立的无血清无蛋白无动物源性MDCK-siat7e细胞库复苏后细胞平均活率为(96.20±2.95)%。MDCK-siat7e细胞在BD001培养基中复苏传代后生长状态良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第6天进入平台期,第8天达最大细胞密度(6.2×10~6 cells/ml),维持至第12天细胞密度和活率开始下降,进入衰亡期。MDCK-siat7e细胞在无血清培养基中生长良好;不同起始接种密度MDCK-siat7e细胞达到平台期的时间差异有统计学意义(P0.05),平台期细胞密度及活率差异无统计学意义(P0.05);不同规模生物反应器培养的MDCK-siat7e细胞的μ、Cd、q_(gluc)、Y_(lac/gluc)差异均无统计学意义(P0.05),细胞生长代谢良好。结论建立了生物反应器无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞的工艺,为病毒性疫苗生产中采用无血清无蛋白、无动物源性培养基,生物反应器规模化培养MDCK-siat7e细胞提供了一定的实验依据。     

同时扩增与收获脐带血来源造血干细胞及间充质干细胞的研究

目的为利用生物反应器,实现脐带血(Umbilical cord blood,UCB)来源的造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)与间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的同时扩增与收获。方法为在不添加血清、只添加细胞因子组合(SCF15ng·mL-1,FL5ng·mL-1,TPO6ng·mL-1,IL-315ng·mL-1,G-CSF1ng·mL-1,GM-CSF5ng·mL-1)及海藻酸钙壳聚糖胶珠包被基质细胞支持的条件下,采用玻璃包被的聚苯乙烯(Glass coated styrene copolymer,GCSC)微载体与生物反应器相结合的策略,考察了UCB-HSCs与UCB-MSCs在转瓶及旋转壁式生物反应器(Rotating wall vessel bioreactor,RWVB)内的共培养。结果RWVB中的扩增效果最佳,12天内有核细胞(Nuclear cells,NCs)扩增了3.7±0.3倍;集落形成细胞(Colony-forming units in culture,CFU-Cs)扩增了5.1±1.2倍;CD34+CD45+CD105-(HSCs)细胞扩增了5.2±0.4倍;CD34-CD45-CD105+(MSCs)细胞扩增了13.9±1.2倍。培养结束后,通过自由沉降的方法分离UCB-HSCs和粘附在GCSC微载体表面的UCB-MSCs。同时,细胞多向诱导分化及免疫表型分析结果显示,粘附在GCSC微载体表面上的细胞能够向骨、软骨及脂肪细胞分化;并能够表达间质细胞相关表面标志CD13,CD44,CD73和CD105,而不表达造血细胞的相关表面标志CD34,CD45及HLA-DR,与骨髓MSCs相一致。结论为添加细胞因子、基质细胞及微载体支持的条件下,在生物反应器内能够实现UCB-HSCs和UCB-MSCs的同时扩增与收获。     

表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞无血清培养基的优化及生物反应器培养

目的优化表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的重组CHO细胞的无血清培养基,并进行生物反应器高密度培养。方法通过对现有重组CHO细胞无血清培养基SFMB的氨基酸、蛋白类激素、蛋白水解物等的优化,建立针对表达HBsAg的重组CHO细胞无血清低蛋白(<10mg/L)培养基SFMC。并利用此培养基在生物反应器中分批、流加、灌注悬浮培养重组CHO细胞,通过最大细胞密度和HBsAg产率评价不同的培养模式。结果 SFMC与原培养基SFMB相比,使重组CHO细胞的最大细胞密度提高了20%,HBsAg表达量提高了25%。在生物反应器培养过程中,灌注培养的重组CHO细胞表达的HBsAg产率为0.70mg/(L·d),较分批和流加培养的0.30mg/(L·d)提高了约133%。结论通过无血清培养基优化及生物反应器高密度培养,可显著提高重组CHO细胞表达HBsAg的效率。     

红螺菌科光合细菌液体培养基的优化

红螺菌科光合细菌液体培养基由乙酸钠、氯化铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母膏等5种原料组成.采用L16(45)正交表,得到液体培养基的优化配方为:乙酸钠3.3 g·L-1、氯化铵0.6 g·L-1、磷酸二氢钾0.9 g·L-1、硫酸镁0.5 g·L-1、酵母膏1.5 g·L-1,细菌在光照3000 lx、温度(32±2)℃条件下,培养3 d即可达到生长峰值,细菌总数从1.63×109 cfu·mL-1提高到3.68×109 cfu·mL-1.     

表达IFNα2b-HSA融合蛋白的CHO细胞培养基优化及发酵放大

毕赤酵母表达的干扰素与白蛋白融合蛋白虽然避开了干扰素单体半衰期短的缺陷,但毕赤酵母对药物的糖基化修饰与人体的糖基化修饰差异性导致了药物的毒副作用。目前药物在CHO系统的表达得到了广泛应用。本研究室首次构建了能表达干扰素α2b和人血清白蛋白融合蛋白（IFNα2b-HSA）的CHO细胞株。在此基础上,本研究通过对12种国产商业化基础无血清培养基和5种流加培养基进行优化筛选,获得最适培养方案：基础培养基选择最适于生长的5号培养基（M2：M4=1：1）,流加培养基选择最有适于表达的F4培养基。在此基础上,进行5L生物反应器的发酵放大,pH为6.9～7.4,DO为40%～60%,细胞密度达到7.0×10⁶cells/mL时,温度由37℃降温至34℃,细胞活率降至80%时停止发酵,最终融合蛋白表达量达到137mg/L。初步实现了IFNα2b-HSA融合蛋白在CHO细胞中的高密度发酵。     

以CHO细胞为基质的重组单克隆抗体生产中无血清培养基的优化

重组单克隆抗体药物特异性高且疗效显著,是近年来研究的热点药物之一,在肿瘤的诊断与治疗、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等方面具有广阔的应用前景。抗体药物治疗的特点是所需剂量大且治疗周期长,因此市场需求量巨大。基于大规模生物反应器的哺乳动物细胞(特别是CHO细胞)培养技术已逐渐成为生产单抗药物的核心技术。哺乳动物细胞培养技术包括工程细胞株的筛选、无血清培养基的开发与优化、生物反应器培养工艺的优化等环节。本文重点介绍无血清培养基的发展、分类及优化策略,旨在为建立经济高效的单抗体药物生产工艺提供参考。     

表达长效重组人生长激素-Fc融合蛋白的CHO细胞培养工艺的优化及放大

目的优化表达长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的CHO细胞培养工艺,并进行初步工艺放大。方法采用7 L生物反应器培养表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞,操作参数:转速200 r/min,温度37℃,pH 7.2±0.1,溶氧值(DO)40%。通过改变对数增长期的pH(7.2±0.1降至6.9±0.1)及平台期降温幅度(37℃降至30及33℃),检测培养过程中细胞密度、细胞活率、培养液渗透压、葡萄糖及乳酸水平、以蛋白表达量为指标,优化7 L生物反应器培养工艺。应用优化的最佳工艺进行14 L线性放大,通气量分别设置为0.5、0.1及0.03 SLPM,检测蛋白表达量。结果 7 L生物反应器培养工艺最佳pH为6.9±0.1,最佳温度为33℃,该工艺下蛋白表达量高达1 200 mg/L;14 L生物反应器培养工艺最佳通气量为0.03 SLPM,该工艺下蛋白表达量为880 mg/L。结论成功优化了表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞7 L生物反应器的培养工艺,并实现了14 L生物反应器的放大,本实验为后续rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了基础。     

Sf9细胞的高效扩增及类病毒颗粒高效自组装的培养工艺

目的优化SFX-Insect培养基及类病毒颗粒(virus like particles,VLPs)的自组装培养工艺,提高Sf9细胞的扩增效率及VLPs的自组装效率。方法以SFX-Insect培养基作为基础培养基,添加不同营养物(HyPep~(TM) 1510及葡萄糖),优化培养基。分别在摇瓶及WAVE生物反应器中培养Sf9细胞,同时补加不同倍数(1、2、5、8倍)的补料浓缩液,观察细胞培养效果;将重组戊型肝炎杆状病毒分别加入SFX-Insect及优化培养基培养的Sf9细胞中,分析目的蛋白表达量;根据细胞的不同生长阶段、接毒时是否补料及不同接毒MOI值,将优化培养基培养的Sf9细胞进行分组,分析各组细胞中目的蛋白的表达量并观察VLPs的形成。结果 SFX-Insect基础培养基中同时添加10 g/L葡萄糖和10 g/L HyPep~(TM)1510为Sf9细胞最佳培养基。优化培养基摇瓶培养Sf9细胞,活细胞密度高达2×10~7个/ml以上;在细胞对数生长中后期进行1及2倍补料可延长细胞平台生长期至20 d以上;将摇瓶培养的细胞放大至WAVE生物反应器中培养,密度高达107个/ml以上,且传代培养后,可维持10 d以上的平台生长期。优化培养基培养的Sf9细胞目的蛋白的表达量比SFX-Insect培养基提高了6倍;优化培养基培养Sf9细胞至对数生长中前期,进行补料接毒(MOI=2),VLPs的组装效率大幅提高,镜下可见形态均一的VLPs。结论成功优化了SFX-Insect培养基及VLPs的自组装培养工艺,提高了Sf9细胞的扩增效率及VLPs产量。     

运用DOE法优化表达抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体细胞用培养基

目的运用实验设计(design of experiments,DOE)方法优化表达抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单克隆抗体细胞用培养基,以提高抗体表达量。方法利用Minitab软件进行DOE,考察不同基础培养基、补料培养基对工程细胞株(CHO-DG44)的细胞密度和抗HER2单克隆抗体表达的影响。结果经过DOE方法优化,在最优培养基组合中工程细胞株的最高活细胞密度(peak viable cell density,PVCD)达296×105个/ml,抗体表达量最高达2.07 g/L,比DOE优化之前最高试验组表达量(1.20 g/L)提高了72%,所表达抗体的质量与原研对照品非常一致。结论得到1组较优的基础培养基与补料培养基配比与组合,该培养基组合提高了细胞密度与抗体表达量,且其适合抗HER2单克隆抗体生产使用,表明DOE是一种短期快速提高抗体表达行之有效的方法。     

一株产聚乙烯醇降解酶的紫色杆菌的发酵条件研究

从聚乙烯醇(PVA)污染环境中筛选出一株产聚乙烯醇降解酶活力较高的菌株WSH04-01,该菌株能够利用聚乙烯醇作为唯一碳源进行生长.通过一系列生理生化试验和16S rDNA序列分析结果,鉴定该菌株属于紫色杆菌属(Janthinobacterium sp.),实验室编号WSH04-01.这是目前国内外有关紫色杆菌产生PVA降解酶的首例报道.首先对菌株合成PVA降解酶的营养条件进行了考察,通过单因素试验和正交试验确定了菌株最优培养条件为PVA10 g·L-1,葡萄糖3 g·L-1,酵母膏6 g·L-1,K2HPO4 2 g·L-1,KH2PO4 0 25 g·L-1,MgSO4 0.05 g·L-1,CaCl2 0.05 g·L-1,FeSO4·7H2O0.02 g·L-1,NaCl 0.02 g·L-1.最适发酵温度为30℃,培养基初始pH为7.2,装液量为30 mL培养基(250mL摇瓶)-1,接种量为8%.在最优条件下,PVA降解酶酶活可以达到4.94 U·mL-1,略高于正交试验中的最高酶活(4.83 U·mL-1).同时利用凝胶渗透色谱得到分子量分布图,对最优发酵条件下发酵过程中聚乙烯醇的降解进行了验证.     

CHO-DG44细胞瞬时转染条件的优化

目的优化CHO-DG44细胞瞬时转染的条件。方法采用TubeSpin一次性生物反应器,以绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)为报告基因,氯醚酰亚胺(Polyether imide,PEI)为转染试剂,将质粒pIRESneo3-eGFP瞬时转染CHO-DG44细胞,优化瞬时转染的基本条件[细胞密度、DNA浓度和DNA:PEI比例(w/w)]以及其他条件(换液、渗透压和温度),采用优化的条件转染质粒pIRESneo3-eGFP,流式细胞术检测细胞转染效率,生物发光仪检测相对荧光强度。结果 CHO-DG44细胞瞬时转染的最佳条件为:采用XLG-P8培养基进行转染,细胞密度为2×106个/ml,DNA浓度为6.25μg/5 ml,DNA∶PEI(w/w)比例为1∶5;转染后4 h更换新鲜培养基,添加30 mmol/L NaCl,并于31℃继续培养。在此条件下,CHO-DG44细胞的瞬时转染效率可达81.45%,相对荧光强度可达9×105RFU/106cells。结论优化了CHO-DG44细胞瞬时转染的条件,为下一步药物蛋白的研发奠定了基础。     

蝴蝶兰叶片组织快速繁殖工艺和方法

蝴蝶兰叶片组织在无菌条件下接种于添加1.8 mg·L-1 6-BA和1.5 mg·L-1 NAA的MS培养基(细胞诱导分生培养基)中,培养7 d,叶片细胞逐渐增殖培养生成芽苗;将芽苗切割分离接种于添加1.0 mg·L-1 6-BA和1.0 mg·L-1 NAA的MS培养基(芽苗增殖培养基)中,无菌培养9 d后,蝴蝶兰芽苗诱导生成幼苗;将蝴蝶兰幼苗转接入添加激素0.1 mg·L-1 NAA的MS培养基(生根培养基)中,培养15 d后,幼苗诱导生根,形成完整的蝴蝶兰小植株.     

人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白重组CHO细胞生产工艺及质控方法的建立

目的 利用国产无血清培养基T22,建立人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)重组CHO细胞大规模生产工艺及质控方法。方法用500 L生物反应器培养重组CHO细胞,通过深层过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水层析等方法纯化表达上清中的目的 蛋白,超滤浓缩制成原液,并按照《中国药典》三部(2010版)及现有的质控方法和标准建立相应的质控方法。结果重组CHO细胞在500 L生物反应器中培养15 d左右,细胞密度最高可达8.6×106个/ml,收获时细胞活力为70%左右,rhTNFR:Fc蛋白表达量可达3.3 g/L;纯化的目的 蛋白纯度可达98%以上,总收率超过30%;各项质量指标均符合新药申报标准。结论建立的rhTNFR:Fc重组CHO细胞生产工艺及质控方法稳定可靠,使用国产培养基大大降低了生产成本。     

DOE法优化筛选表达胰高血糖素样肽-1融合蛋白的CHO细胞用培养基

目的运用实验设计(Design of Experiment,DOE)方法优化筛选表达胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)融合蛋白的CHO细胞用培养基,以提高细胞生长密度及目的蛋白表达量。方法采用Minitab软件对实验进行DOE优化筛选。考察不同基础培养基、流加培养基及其策略优化对CHO活细胞密度(viable cell density,VCD)与GLP-1融合蛋白表达的影响,确定最适培养基组合。结果从15种基础培养基中筛选出3组基础培养基,从5种流加培养基中筛出1种流加培养基,并在此基础上优化了相关流加补料策略。经最适培养基组合验证,试验组CHO细胞的VCD最高为(19. 90±0. 78)×10~6个/mL,对照组最高为(14. 30±0. 60)×10~6个/mL;试验组GLP-1融合蛋白表达最高为2. 51 g/L,对照组小于1. 51 g/L,目的蛋白表达量优化后较优化前提高了80%以上。结论优化后的培养基组合显著提高了CHO细胞生长密度及目的蛋白产量,DOE方法是一种短期快速提高蛋白表达的有效方法。     

无血清培养Vero细胞及其传代稳定性分析

目的建立无血清无动物源性培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞的工艺,并分析其传代稳定性。方法采用VP-SFM适应培养Vero细胞,建立无血清无动物源性Vero细胞库,对细胞库进行常规检定;绘制VP-SFM培养Vero细胞的生长曲线;比较140、150、160代Vero细胞在VP-SFM中培养的比生长速率(μ)和分裂次数(Cd);比较142、147、153代Vero细胞在VP-SFM中培养的狂犬病病毒滴度;比较无血清与含血清培养140、150、160代Vero细胞的μ和Cd值;分别在250 ml spinner flask中加入2 g/L cytodexⅠ、在3 L生物反应器中加入3 g/L cytodexⅠ培养Vero细胞,观察细胞贴壁和生长情况。结果建立的无血清无动物源性Vero细胞库,细胞密度为4×10~6个/ml,冻存前细胞活率为100%,复苏后细胞平均活率为(94.20±3.95)%,无菌检查和支原体检查合格;细胞在VP-SFM中复苏传代后生长良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第8天进入平台期,第12天达最大细胞密度20.5×10~5个/ml,并维持至第14天,活细胞数开始下降,最大μ值为0.025 4 h~(-1)。Vero细胞在无血清培养基中传代稳定性较好,140、150、160代Vero细胞在VP-SFM培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P0.05);142、147、153代Vero细胞在VP-SFM培养的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P0.05);140、150、160代Vero细胞在无血清和含血清培养基培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P0.05)。在生物反应器微载体系统中,采用无血清培养基培养Vero细胞,细胞贴壁及生长状态良好。结论初步建立无血清、无动物源性物质的Vero细胞库,采用方瓶静置培养或微载体搅拌培养,细胞生长状态均良好,传代稳定性也较好。     

微胶囊固定化培养重组盘基网柄菌提高人类可溶性Fas配体的表达

首先研究了应用于液芯羧甲基纤维素钠-海藻酸钙(CMC-ALG)微胶囊制备中的各种化学组分对重组盘基网柄菌生长的影响,然后考察不同组分浓度制备而成的各种CMC-ALG微胶囊内重组盘基网柄菌的生长情况,从而得到较适的微胶囊制备的组分配比(CMC 12 g·L-1,SA 8 g·L-1,CaCl2 100 g·L-1).结果表明,在以上较适条件下制备的微胶囊内重组盘基网柄菌的生长得到了极大的改善,最大的细胞密度比游离培养时提高了4倍,达到了8.0×107 mL-1;相应的人类可溶性Fas配体(FasL)的表达水平也提高了1.5倍,达到了315 μg·L-1.最后,开展了微胶囊化重组盘基网柄菌的二次重复发酵FasL的研究,结果表明,经过二次重复批次培养,最大细胞密度可达到1.24×108 mL-1,为游离培养的8～10倍,而且FasL的表达水平还能维持高水平(280 μg·L-1),为游离培养时的2倍.     

不同碳源对水产养殖固体颗粒物生物絮凝效果的比较

通过添加葡萄糖和醋酸钠2种碳源进行生物絮凝的培养,比较了2种碳源生物絮凝效果的差异.试验设添加葡萄糖碳源,添加醋酸钠碳源和不添加碳源3个反应器,分别将10 g饲料溶解于10L水中,培养过程中添加碳源反应器维持碳氮比大于10.经过33 d培养,葡萄糖碳源反应器絮体蛋白含量为30.4％,累积氨氮质量浓度在第5天达到最大值104.25 mg·L-1.醋酸钠碳源反应器絮体蛋白含量为34.6％,累积氨氮质量浓度在第6天达到最大值1 12.15 mg·L-1.无添加碳源反应器絮体蛋白含量为26.3％,累积氨氮质量浓度在第7天达到最大值117.89 mg·L-1.试验表明葡萄糖碳源生物絮凝反应器对水质的处理效果要优于醋酸钠,但在形成絮体的蛋白质含量上要小于醋酸钠.     

表达GLP-1融合蛋白的重组大肠杆菌分批补料培养工艺优化

人胰高血糖素样肽-1(Glucagon Like Peptide-1,GLP-1)是一种有潜在应用价值的治疗糖尿病的药物。今以一株表达GLP-1融合蛋白的重组大肠杆菌为研究对象,在分批培养条件下,通过流加甘油并在诱导前0.5h添加氮源使菌体密度、融合蛋白表达水平、融合蛋白体积得率和融合蛋白细胞得率分别提高了138.0%、29.5%、216.9%和29.6%。在此基础上,进一步考察了甘油补加策略、氮源补料方式以及补氮液浓度等过程因素对菌体生长以及GLP-1融合蛋白表达的影响,发现氮源流加过程是提高融合蛋白表达水平的关键因素。进而通过对补料过程的优化,建立了高密度高表达的分批补料培养工艺,最终使菌体密度、融合蛋白表达水平、融合蛋白体积得率和融合蛋白细胞得率分别达到51.93g·L-1、34.6%、2.937g·L-1和0.057g·g-1cell,较分批培养分别提高了314.5%、100.0%、784.6%和111.1%。研究结果对GLP-1融合蛋白的产业化开发有一定的指导意义。