浓香型大曲中产香微生物的筛选及鉴定

本研究从传统浓香型大曲微生物资源中筛选产香功能性微生物,研究其与大曲香味物质之间的联系,并对产香功能菌株进行分子生物学鉴定。采用传统微生物分离法从不同发酵阶段的浓香型大曲中分离纯化获得细菌22株,酵母6株。以小麦固体培养基为底物对各细菌、酵母菌株进行单菌产香实验,经闻香评价,菌株X19和J3发酵后能产生浓郁的香味。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对这两株菌的发酵产物进行挥发性成分检测,发现菌株X19和J3的发酵产物中香味物质种类丰富,其中吡嗪类物质、苯乙醇、愈创木酚等香味物质为浓香型大曲的重要香味成分。因此,可初步认定菌株X19和J3为浓香型大曲的产香功能菌。经形态学观察和分子生物学鉴定,菌株X19为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),菌株J3为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。     

浓香型大曲复合功能酵母菌的筛选及鉴定

从浓香型大曲分离的酵母菌中,筛选出发酵力、酯化力和脂肪酶活力复合功能较高的菌株,为构建浓香型大曲复合功能菌群提供重要资源。以从浓香型大曲中筛选得到的10株酵母菌为研究对象,利用脂肪酶平板鉴定法初步确认10株酵母均具有脂肪酶功能,并对这10株酵母进行单菌小麦固体培养基发酵,测定发酵产物发酵力、酯化力和脂肪酶活力,复筛出一株复合功能性突出的菌株J17,该菌株的发酵力为2.02 g/(g·72 h),酯化力为114.13 U,脂肪酶活力为6.37 U/g。结果发现,J17发酵后能产生较为丰富的风味物质,经扫描电镜观察结合分子生物学鉴定,J17为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。     

中高温大曲发酵过程酿酒酵母的筛选与鉴定

为了确立一种简单且高效筛选中高温大曲发酵过程中酿酒酵母的方法,利用TTC显色实验对中高温大曲发酵过程中的22株酵母菌进行了产酒精能力初筛,并联合酵母菌麸曲发酵力和液态酒精发酵实验对初筛到的酵母菌株进行复筛和三级筛,最后通过分子生物学鉴定,确定4#和8#酵母菌株均为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。首次对中高温大曲发酵全过程酵母菌的变迁做了较为细致的研究,将鉴定结果比对中高温大曲发酵过程酵母菌变迁表1可知,两株菌均分离自主发酵阶段。4#菌来自于主发酵2d曲心,8#菌分离于主发酵4d的曲皮。     

大曲中产香兼性厌氧细菌的筛选及挥发性成分分析

从浓香型大曲中分离筛选兼性厌氧细菌,研究该类菌在制曲工艺环境中种群分布的可行性,并进一步探索该类群微生物的产香特性及其挥发性组分,为提高大曲质量奠定基础。采用二氧化碳培养法对大曲样品进行菌株的筛选及分离纯化,最终获得9株兼性厌氧细菌。其中编号为X3菌株产香性能突出,经初步鉴定属于棒状杆菌属。进一步通过顶空固相微萃取—气相色谱—质谱联用分析X3菌株固态发酵产物的挥发性物质,结果表明,其挥发性物质中的吡嗪类物质、苯乙醇、愈创木酚、苯甲醛等,与浓香型大曲产香物质相符。     

高产乙酸乙酯酵母菌的筛选及其在清香型小曲白酒生产中的应用

该研究利用WL营养琼脂培养基从浓香型大曲中分离纯化酵母菌,采用形态学观察和分子生物学技术对其进行鉴定,经过高粱汁培养基发酵初筛、高粱固态培养基发酵复筛,获得高产乙酸乙酯的酵母菌,并将其应用于清香型小曲白酒工业生产。结果表明,从浓香型大曲中分离得到2株酵母菌,编号为Y87和Y88,经鉴定分别为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,其中菌株Y87乙酸乙酯产量最高,高粱汁液态发酵和高粱固态发酵乙酸乙酯产量分别达到1.13 g/L、1.14 g/L,菌株Y87强化曲酿造的白酒乙酸乙酯含量提高36.6%,杂醇含量降低7.1%,正丙醇含量降低16.1%,感官评分为90.7分,该白酒具有清香型小曲白酒的典型特征,入口醇甜,清香纯正,说明菌株Y87可显著提高小曲白酒的品质。     

一株耐酸性酿酒酵母的筛选鉴定及特性

基于浓香型白酒回糟酸度高、残糖含量高的生产现状,通过平板划线纯化、WL培养基形态观察及显微镜观察对中高温大曲中酵母菌进行初步鉴定,再通过TTC培养基染色筛选、差异酸度培养基筛选适用于回糟发酵耐酸性产酒精能力强的酵母菌,并进行分子生物学鉴定、生物学特性及回糟发酵小试研究。结果表明：中高温大曲中筛选得到的菌株dq1在pH 3.0时生长活性较强,产酒精能力为0.87%vol,鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,具有耐受pH 3.0、高温（48 ℃）、酒精度6%vol 的酿酒特性,发酵小试中回糟还原糖利用率提高了14.9%,有效提高了糟醅中酒精含量和回糟出酒率,为浓香型白酒回糟发酵提供优势酵母菌。     

高温大曲中产吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵产物分析

该试验从高温大曲中筛选产吡嗪芽孢杆菌（Bacillus）,通过形态观察及磷脂脂肪酸（PLFA）分析对其进行鉴定,并采用发酵试验分析其代谢产物。共筛选出3株芽孢杆菌,即菌株B1、B2、B3。经分析鉴定后得出：菌株B1为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）;菌株B2和B3为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。3株菌发酵产物分析结果表明,在液态发酵条件下3株菌发酵产吡嗪,其中菌株B2和B3发酵产物中吡嗪相对含量较高,均＞60%;固态发酵条件下生成吡嗪前体物质3-羟基-2-丁酮,且发酵产物中相对含量均＞75%。表明这3株芽孢杆菌对酱香型白酒风味物质的产生有着一定的影响。     

中高温大曲中酵母菌的分离及其在小曲酒中发酵性能初探

从中高温大曲中分离出酵母菌,通过制作米曲酿造小曲酒初步探究了大曲中的酵母菌在小曲酒中的发酵能力。采用稀释平板涂布法从大曲中分离纯化出酵母菌,经形态学和分子生物学鉴定确定了酵母菌的种属,并优化了米曲制作过程中原料的含水量和制曲时间。结果表明,从中高温大曲中共分离出4株酵母菌(Y1、Y2、Y3和Y4),经鉴定Y1为异常威克汉逊酵母(Wickerhamomyces anomalus),Y2为东方假丝酵母(Candida odintsovae),Y3和Y4为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。米曲的最佳制作工艺为在原料含水量为46%(质量分数)下培养7 d。以高粱为原料,米曲和糖化酶为糖化发酵剂发酵产酒发现,4种酵母的产酒能力依次为酿酒酵母Y3酿酒酵母Y4异常威克汉逊酵母Y1东方假丝酵母Y2。该研究为提高小曲酒质量和开发大曲中微生物资源提供了一条有效途径。     

基于酶学特性筛选大曲来源芽孢杆菌用于强化酿酒

通过分析来源于清香型、浓香型和酱香型大曲的105 株芽孢杆菌的产淀粉酶和蛋白酶的能力,优选出1 株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）B.L-1和1 株枯草芽孢杆菌（B. subtilis）B.S-1,将其分别应用于清香型白酒酿造中,探究强化接种微生物对发酵的影响。发酵结束后,在酒醅中共检测到挥发性代谢产物38 种,通过多元统计分析,在强化B.L-1组和B.S-1组中分别筛选出差异代谢物21 个和11 个（VIP＞1;P＜0.05）,其中4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和四甲基吡嗪在2 组强化中均为差异代谢物,含量显著升高。结果表明,用酶学特性进行菌株筛选能够快速有效地获得特定功能菌株,由此获得的菌株进行强化发酵可显著提高酒醅中挥发性风味物质含量。该方法可以有效地为大曲微生物合成群落重塑提供菌种资源。     

酱香型白酒酵母菌群快速鉴定及发酵性能初探

为了研究酱香型白酒酿造过程中酵母菌群的生物多样性及发酵性能,对前期建立的“国台酒-酵母菌种库”展开研究,利用十二烷基磺酸钠（SDS）热裂解法提取总DNA,进而通过5.8S rDNA-ITS区域限制性片段长度多态性分析（RFLP）的方法结合“Yeast-ID”数据库比对,将酵母菌株鉴定到种的水平,再通过inter-δ PCR的方法将酿酒酵母菌株在种以下水平进一步分类。最后,对每个类型的酵母菌株,进行了发酵性能的初步研究。研究表明,酱香型白酒酿造过程中酵母菌群被分为7种,其中3种表现出较强的产酒功能,1种表现出较强的产乙酸乙酯能力;各菌种之间代谢产酸、产酯和微量物质的能力各不相同。     

野木瓜酵母菌株抗性及发酵特性评价

以从野木瓜自然发酵过程中筛选出的8株发酵力强、产香好的酵母菌,对其进行抗性（温度耐受性、葡萄糖耐受性、酒精耐受性等）评价。供试菌株中,在NaCl浓度为140 g/L时,有4株菌仍可生长发酵并具耐高渗性,可用于高盐环境发酵中;菌株B7-2、C-4、BL-5的耐高温性较好,在55℃时仍可生长,可用于工业生产的高温环境;所有供试菌株都有很好的SO2耐受性,筛选的5株优良酵母模拟酒精发酵实验中,菌株C-4、B1-3产酒精度高于商品酵母RC212,可以作为优良酵母进一步开发利用。菌株B7-2产酒精度为0,但产香很好,可作为产香酵母在发酵过程中适量添加以增加香味,或者用于面包和无醇饮料的开发。     

耐高温酒精酵母菌株的筛选及发酵能力比较

采用酵母菌富集培养方法和选择性培养基从中国传统大曲酒等基质中共分离得到58株具有一定的酒精发酵能力的酵母菌株。经过初筛和复筛,从中筛选获得1株能在33℃～42℃生长良好,并具有良好酒精发酵性能的酵母菌株XG-1,经分类鉴定为酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。40℃液体摇瓶培养条件下,XG-1菌株活菌数占总菌数的比率较安琪耐高温酿酒高活性干酵母（TRADY）高15％。将其与TRADY菌株进行木薯酒精发酵比较,33R2条件下两者的酒精发酵能力相当,但在42℃时进行酒精发酵,XG-1菌株的酒精度比TRADY菌株高20％。     

多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌多样性分析与优质功能菌筛选

分析多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌多样性,基于ITS rDNA序列构建其系统发育树对其进行鉴定,筛选优质酿酒功能酵母菌,并考察其发酵特性。结果表明,共分离出43株酵母菌,分为12种形态类型,编号为WY1～WY12,其中,菌株WY2、WY6、WY9为库德里阿兹威（氏）毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）;菌株WY1、WY3为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）;菌株WY4为海洋嗜杀酵母（Wickerhamomyces anomalus）;菌株WY5为扣囊复膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）;菌株WY7为拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）;菌株WY8为葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）;菌株WY10为季也蒙毕赤酵母（Galactomyces geotrichum）;菌株WY11、WY12为罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）。功能酵母菌筛选结果表明,扣囊复膜酵母菌（S. fibuligera）WY5-1和酿酒酵母（S. cerevisiae）WY3-2具有良好的产乙醇特性;库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）WY6-3和WY9-2具有良好的产酯特性、温度和pH耐受性,为浓香型白酒的工业生产中菌株的选择提供了更多可能。     

中高温大曲中芽孢杆菌多样性及代谢特征研究

为探究大曲中芽孢杆菌的代谢特征和功能性,首先采用传统培养法结合分子生物学技术从中高温大曲中分离、鉴定芽孢杆菌,对其微生物多样性进行分析;然后通过耐受性分析从中筛选优势菌,最后利用代谢组学方法分析其代谢特性。结果表明,共分离、鉴定得到49株芽孢杆菌,其中3株芽孢杆菌耐受性较好,分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-5、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS-7和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BV-10。从单菌株及混合菌株发酵后的发酵液中共检测到23种挥发性代谢物和52种非挥发性代谢物,其中,愈创木酚以菌株BS-7单独培养时含量最高,为8.56 mg/L。同时芽孢杆菌混合发酵会增加4-乙烯基愈创木酚的生成量,在菌株BV-10和BA-5混合培养后,达到104.47 mg/L,说明芽孢杆菌单菌株及种间协同作用对白酒酿造中的特征物质形成具有重要影响。     

窖泥中高产丁酸梭菌的筛选、鉴定及其生长耐受性研究

从浓香型白酒窖泥中通过传统微生物分离手段筛选高产丁酸的梭菌,并对分离菌株进行形态学观察、分子生物学鉴定及生长耐受性分析研究。结果表明,通过发酵产物检测获得两株高产丁酸菌株,编号为AB2RH027和AB2RH033,经过菌落观察、革兰氏染色及分子生物学鉴定两株菌均为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）。通过耐受性实验,确定菌株AB2RH027最适生长pH值为8,最适生长温度为40 ℃,酒精耐受性为15%vol,发酵24 h丁酸产量为5.29 g/L;菌株AB2RH033最适生长pH值为8,最适生长温度为35 ℃,酒精耐受性为18%vol,发酵24 h丁酸产量为5.23 g/L。该研究筛选得到的两株高产丁酸的菌株在白酒品质提升方面具有一定应用价值。     

浓香型和酱香型大曲微生物多样性分析

大曲是中国白酒酿造过程中的糖化发酵剂,具有自然接种的特点。为探究同一酒厂浓香型和酱香型大曲微生物群落组成,分别采用传统培养和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳法（PCR-DGGE）对其微生物进行分析鉴定。传统培养法共分离鉴定出198株菌,其中浓香型大曲中24种,酱香型大曲12种。两种大曲中地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）数量占绝对优势,在浓香型大曲中优势真菌为谢瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri ）和米曲霉（Aspergillus oryzae）,而在酱香型大曲中,以伞状毛霉（Lichtheimia corymbifera）和多变拟青霉（Paecilomyces variotii ）居多;通过PCR-DGGE共鉴定出14种菌,两种大曲中葡萄球菌（Staphylococcus）、高温放线菌（Thermoactinomyces）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）为优势菌。     

黄酒曲酵母的筛选和耐受性研究

在酿酒过程中,酵母菌株的优劣直接影响黄酒的酒精含量和风味特征。为筛选到发酵能力强、产香强、繁殖快和耐受性强的酿酒用功能性酵母,从各种酒曲中分离纯化的13株酵母菌通过TTC法初筛和复筛得到Y-3、Y-7、Y-103株酵母菌。通过对Y-3、Y-7、Y-10进行耐乙醇能力、耐pH能力、耐温度、耐渗透压分析,筛选出1株发酵力强、产风味物质含量较高的、耐受性较好的酵母菌株Y-10。将Y-3、Y-7、Y-10应用到黄酒生产试验中,结果表明,筛选得到的Y-10酵母在酿造的黄酒中风味物质的种类多于8种;风味物质的含量高于其他两种,高达329.87 mg/mL。由此可见,在黄酒酿造过程中,Y-10在提高黄酒的酒精含量以及增强其风味物质种类与含量方面有不可估量的应用前景。     

高产阿魏酸酯酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化

为提高白酒酿造过程中阿魏酸的含量,该研究从浓香型白酒大曲中分离筛选产阿魏酸酯酶的菌株,通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并以阿魏酸酯酶活力为评价指标,采用单因素试验及响应面试验对其发酵条件进行优化。结果表明,筛选得到一株产阿魏酸酯酶的菌株,编号为M2。经鉴定,其为一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）,该菌株产阿魏酸酯酶的最佳发酵条件为接种量5%,发酵温度30 ℃,初始pH值5.5,发酵时间72 h。在此优化条件下,阿魏酸酯酶活力为33.89 U/L,比优化前提高10.03%,具有较强的产阿魏酸酯酶能力。     

茅台大曲中酵母的分离、鉴定及其功能初探

采用可培养方法对酱香型白酒大曲中的酵母菌进行计数和筛选,通过形态学特征、生理生化实验及酵母26S rDNA分子生物学方法鉴定酵母,并分析酵母的发酵能力和风味成分。结果表明,酱香型大曲中酵母数量为103 CFU/g;共分离鉴定6种酵母,各酵母产香能力不同,编号FBKL2.0071扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)固态发酵物具有浓郁的果香味,其中以乙酸乙酯、乙酸异戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯、棕榈酸乙酯含量较高。编号FBKL2.0082多株伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)固态发酵物呈浓郁的花香味,其中以乙酸乙酯、乙酸异戊酯和苯乙醇含量较高。这两株酵母固态发酵时都能产生大量的酯类和醇类等挥发性香味物质,还有少量醛、酮、酚和烷类等物质。分离得到的酵母产酒能力不同,总体产酒能力不高。