CCL3L1融合蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化CCL3L1融合蛋白,并对其免疫原性进行分析.方法 应用分子生物学技术将pGEX-4T-1-CCL3L1质粒进行酶切,收集CCL3L1片段与pET-32a(+)表达载体连接,构建pET-32a(+)-CCL3L1重组质粒,将其转化BL-21大肠埃希菌进行蛋白表达并纯化.应用酶切鉴定、SDS-PAGE及Western blot等方法确保基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.以间接ELISA法测定BABL/c小鼠多克隆抗体滴度.结果 成功获得了高纯度的CCL3L1融合蛋白,且该蛋白为可溶性表达,以其制备的多克隆抗体滴度最高可达1:51 200.结论 获得高纯度可溶性表达的CCL3L1融合蛋白及其高效价的多克隆抗体.     

胃动素受体多克隆抗体的制备及其受体在人胃的表达

目的制备胃动素受体多克隆抗体和研究该受体在人胃中的组织定位。方法通过合成肽耦联钥孔戚血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)制备抗体,以ELISA方法测定效价。用含有GPR38基因(胃动素受体)的质粒转染293细胞株,以RT-PCR方法鉴定。Westernblot和免疫组织化学法检测转染的293细胞和组织中胃动素受体的表达。结果制备的兔抗人的多抗效价达1∶500000,有较好的特异性。成功转染293细胞,该细胞能够瞬时表达胃动素受体,而该受体在人胃窦胃体的黏膜腺上皮中表达。结论应用合成肽-KLH成功地制备了胃动素受体的兔抗人多克隆抗体,用该抗体检测到人胃窦胃体黏膜上皮细胞存在胃动素受体的表达。     

pVAX1-Ag85B的构建及其免疫原性的初步探索

目的构建以Ag85B基因为基础的DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法以pET28a-Ag85B基因组DNA为模板,PCR扩增获得Ag85B全长基因;将PCR产物构建成pUCm-Ag85B亚克隆;经限制性内切酶消化后克隆入pVAX1载体中构建真核表达质粒pVAX1-Ag85B,酶切、DNA测序鉴定。并将构建的DNA疫苗经肌肉免疫荷瘤小鼠,检测血清特异性抗体水平和脾淋巴细胞的增殖活性,并与BCG组、空白质粒组、生理盐水组相比较。结果经NheⅠ和HindⅢ双酶切、DNA测序鉴定后证实,Ag85B基因定向克隆入pVAX1载体,碱基无突变,序列完全正确。免疫荷瘤小鼠后,pVAX1-Ag85B组和BCG组均可提高淋巴细胞增殖活性,但效果不及卡介苗;pVAX1-Ag85B组的抗体滴度为1∶400,BCG免疫组的抗体滴度为1∶800。结论成功地构建了pVAX1-Ag85B质粒,为膀胱肿瘤的基因免疫治疗提供可靠的实验依据。免疫小鼠后,可提高小鼠免疫水平,但效果不及卡介苗。     

肝癌相关蛋白FAM172A2的克隆表达及多克隆抗体制备

目的 构建肝癌相关蛋白FAM172A2的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗FAM172A2蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以HepG2细胞总RNA为模板,扩增FAM172A2目的基因片段1113bp,构建原核表达载体,Western blot分析证实融合蛋白表达的特异性.诱导其大量表达后纯化、复性并制备多克隆抗体,Western blot及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测特异性及其效价.结果 扩增获得FAM172A2基因片段,成功诱导FAM172A2融合蛋白表达并制备其多克隆抗体.ELISA检测证实其效价＞1∶160000,且特异性良好.结论 利用大肠埃希菌BL21( DE3)能够成功表达FAM172A2蛋白,获得高特异性、高效价兔抗FAM172A2蛋白的多克隆抗体.     

免疫调控相关基因C12orf28在免疫组织中的分布特征

目的：制备抗人C12orf28多克隆抗体,明确C12orf28编码蛋白在免疫组织中的分布特征。方法选取免疫原性高、特异性强的羧基端257个氨基酸作为目的片段,以人外周血单个核细胞（PBMC）cDNA为模板,采用PCR获得目的基因C12orf28C257;构建其原核表达载体pET32a（＋）-C12orf28C257,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）,异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白;将重组蛋白免疫大耳白大白兔制备兔源性多克隆抗体,采用ELISA和Western blot分析检测多克隆抗体效价和特异性,采用Western blot明确C12orf28的组织分布特征。结果 PCR扩增得到C12orf28C257目的基因片段,诱导表达重组蛋白并制备了其多克隆抗体。ELISA分析结果显示,多克隆抗体效价＞1︰1.28×106,Western blot分析鉴定得出多克隆抗体具有较高的特异性。结论未知功能基因C12orf28在胎儿肠、淋巴、胸腺和心肌等组织中均有不同程度的表达。     

抗人精子蛋白22单克隆抗体细胞株的建立与鉴定

目的:制备小鼠抗人精子蛋白SP22单克隆抗体并鉴定其特异性。方法:用BL/21菌表达的SP22作抗原免疫BALB/c小鼠,用有限稀释法筛选分泌SP22单克隆抗体(M cAb)的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,通过ELISA技术,W estern印迹方法鉴定其敏感性及特异性。免疫组化法探讨SP22在人精子表面的分布与定位。结果:获得3株稳定分泌SP22单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其细胞培养液浓缩上清和混合腹水的效价分别为1∶1000和1∶3 200,抗体亲和力为1.0×107L/mol,小鼠IgG亚类均为IgG1,W estern印迹结果显示该抗体能特异性识别人精子SP22,免疫组化结果显示SP22主要定位于精子的顶体部位。结论:用杂交瘤技术制备的抗人SP22单克隆抗体具有高的效价和特异性,并且能特异地与人精子表面的SP22蛋白结合。     

改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 表达、纯化改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备其多克隆抗体.方法 利用原核表达载体PGEX-6P-1/改良型TAT-VP3在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,经GST标签纯化树脂纯化蛋白,并用PreScission Protease酶切除标签,以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,获得改良型TAT-VP3融合蛋白的多克隆抗体.用ELISA进行效价检测,Western blotting鉴定其特异性.结果 诱导表达并纯化了改良型TAT-VP3融合蛋白,纯度大于90%,蛋白浓度为1.2 mg/ml.制备了该蛋白的多克隆抗体,ELISA表明多克隆抗体效价为1∶32 000,Western blotting证明多克隆抗体的特异性良好.结论 成功纯化出改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备出高效价、高特异性的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础.     

人ODC重组蛋白及其多抗的制备和临床应用

目的:构建鸟氨酸脱羧酶(ODC)表达载体,表达ODC重组蛋白,制备其多克隆抗体并观察其在大肠癌诊断中的意义.方法:从大肠癌组织中提取总RNA,反转录PCR法扩增全长ODC cDNA,将扩增的基因插入表达载体pQE-30的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点之间,DNA测序验证插入片段.将重组载体转化入宿主菌M15中进行诱导表达,产生含6-His-tag的融合蛋白.Western Blotting法检测表达蛋白.亲和层析法纯化融合蛋白,以该蛋白免疫小鼠制备多抗,免疫组化检测大肠癌组织中ODC的表达水平.结果:酶切鉴定和DNA测序显示ODC重组表达载体中含有人ODC eDNA全长序列,与NIH基因库的人ODCcDNA比较有99%的同源性.将该重组载体转化入大肠杆菌M15中表达所得蛋白经Western Blotting验证为目的蛋白.纯化融合蛋白,免疫小鼠获得多抗效价较高.免疫组化检测大肠癌组织中ODC的表达显示该抗体检测效果较好,大肠癌组织中ODC的表达水平明显高于正常组织(P＜o.05).结论:成功地构建了ODC表达载体、表达出ODC重组蛋白、制备出ODC多克隆抗体,为进一步研究结直肠癌的发病机理及其诊断和治疗方法打下了良好基础.     

兔抗大鼠LM23蛋白合成肽多克隆抗体的制备与初步应用

目的制备大鼠精子发生相关蛋白LM23的合成肽多克隆抗体,对其特性进行初步鉴定,并对LM23多克隆抗体进行初步应用。方法利用生物信息学方法分析选择LM23蛋白的多肽序列。应用Fmoc法化学合成大鼠LM23蛋白N端第1～20和第274-291个氨基酸多肽（接近C端）,经C18的RP—HPLC纯化后,通过高碘酸钠法,将纯化的LM23蛋白的多肽与KLH交联,免疫新西兰大耳白兔,获得LM23蛋白的多克隆抗体。用ELISA方法鉴定多克隆抗体效价。通过Westernblot方法鉴定LM23多克隆抗体的特异性并研究LM23在大鼠睾丸中的表达;通过免疫组化方法研究LM23在大鼠睾丸组织和细胞中的定位。结果化学Fmoc法分别合成大鼠LM23蛋白N端第1～20,第274-291个氨基酸多肽,纯化后两条多肽纯度都达到90％以上,符合免疫用抗原标准。将多肽与KLH交联,用于免疫动物。经ELISA鉴定,两种多克隆抗体的效价分别达到1：64000和1：128000。应用大鼠睾丸组织切片进行LM23—18肽多克隆抗体的免疫组织化学研究,发现精母细胞有阳性颗粒反应,且LM23主要表达于细胞核。Westernblot研究证实,LM23—18肽多克隆抗体可特异识别大鼠睾丸组织中相对分子萤（Mr）约为36kD的LM23蛋白。结论所制备的LM23合成肽多克隆抗体可用于ELISA、Westernblot及免疫组化研究。LM23合成肽多克隆抗体的制备为进一步研究LM23的功能和作用机制提供了有力支持。     

CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果

目的 采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染人永生化角质形成细胞系(HaCaT),筛选出稳定干扰CCL20基因表达的细胞克隆并检测其干扰效果.方法 用CaCl2法将已构建好的3种pHSER-CCL20-shRNA-GFP载体(pHCG-1和pHCG-2为CC120基因特异性,pHCG-3为CCL20基因错配)转染293FT包装出慢病毒颗粒,流式细胞术测定其病毒滴度.用G418压力筛选慢病毒感染的HaCaT,荧光定量RT-PCR和ELISA法分别检测CC120基因mRNA和蛋白的表达水平,以判断其特异性干扰效果.结果 三种慢病毒载体所包装出的慢病毒滴度分别为7.08×105转导单位(TU)/ml、1.88×105TU/ml和2.08×105TU/ml;感染后的HaCaT经过G418筛选5～8周,获得4株CCL20基因特异性的细胞克隆(HaCaT-1、HaCaT-2、HaCaT-3和HaCaT-4)及2株CCL20基因错配对照的细胞克隆(HaCaT-5和HaCaT-6).经荧光定量PCR和ELISA法检测显示,4株CCL20基因特异性细胞克隆均具有稳定干扰效果,不仅能显著地下调CCL20基因的mRNA表达(其抑制率分别为81.0%、89.0%、81.3%、77.2%),而且明显地减少CCL20蛋白分泌(其抑制率分别为70.0%、86.1%、88.1%、90.7%).结论 采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染HaCaT可以筛选出具有长期稳定表达RNA干扰效应的CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞克隆,将可能为低免疫排斥反应异基因组织工程皮肤的构建提供种子细胞.