去乙酰化酶抑制剂诱导白血病细胞凋亡过程中Daxx的表达变化

Daxx是新近发现的细胞核内的一种新型转录调控蛋白,有研究表明它参与fas通路诱导的凋亡,我们在白血病细胞系HL 6 0和K5 6 2中观察了组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠和曲古抑菌素A (TSA)诱导白血病细胞凋亡过程中Daxx蛋白表达情况。材料和方法1　主要试剂　丁酸钠和TSA(Sigma公司产品)分别溶于磷酸缓冲液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)中,置于- 2 0℃冰箱。RPMI 1 6 4 0购自Gibco公司。2　细胞培养　HL 6 0和K5 6 2细胞引自中国典型培养物保藏中心。接种于含1 0 %胎牛血清、1 0 0U/ml青霉素和1 0 0μg/ml链霉素的RPMI 1 6 4 0培养液中,…     

高三尖杉酯碱抗血管新生潜能的探讨

已有研究显示,在体外高三尖杉酯碱(HHT)能诱导不同类型白血病细胞凋亡。HHT主要通过线粒体膜电位下降、细胞色素C释放和半胱天冬酶3激活而诱导细胞凋亡[1 ] 。近年来,白血病与血管新生的关系引起了人们的关注,HHT是否也能通过抗血管新生作用,发挥抗白血病效应?为此,我们以huECV30 4细胞和K5 6 2细胞为对象,初步探讨HHT抗血管新生作用的潜能。材料和方法1　主要试剂　HHT(1mg/ml)购自杭州民生制药厂,使用前用RPMI 1 6 4 0液稀释至所需浓度。兔抗人血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)结合的羊抗兔IgG为Sant…     

新型免疫抑制剂FTY720诱导HL-60和K562细胞凋亡的作用机制

FTY72 0是一种新合成的免疫抑制剂 ,在多种动物同种异体移植模型中试用 ,效果良好。最近研究证实 ,FTY72 0可诱导正常淋巴细胞[1 ] 、Jurkat细胞[2 ] 、急性白血病细胞系HL 6 0细胞凋亡 ;但是 ,对FTY72 0诱导细胞凋亡时所参与的信号传导通路的研究较少。因此 ,我们选择HL 6 0细胞和K5 6 2细胞作为观察对象 ,对在细胞外调节蛋白激酶 (ERK)通路中FTY72 0诱导白血病细胞凋亡的作用进行了探讨。材料和方法1　细胞培养　HL 6 0细胞和K5 6 2细胞系引自中国典型培养物保藏中心。采用含 10 %胎牛血清和青、链霉素的RPMI16 4 0培养基 ,在…     

钙调素拮抗剂小檗胺诱导K562细胞凋亡及其机制的研究

小檗胺 (Berbamine,BBM)是一种双苄基异喹啉类生物碱 ,广泛用于白细胞减少症且无明显不良反应 ,最近研究表明BBM及其衍生物均属钙调素拮抗剂 (Calmodulinantagonist) ,对多种肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用 ,为明确BBM体外抗白血病的作用及其机制 ,我们以K5 6 2细胞为对象进行研究。材料和方法1　材料　BBM粉剂由抚顺中药厂惠赠 ,生理盐水调至工作母液浓度 1mg/ml,- 2 0℃保存 ,临用前用RPMI 16 40调至所需浓度。K5 6 2细胞系由浙江大学医学院肿瘤研究所提供 ,培养于含 10 %小牛血清的RPMI 16 40培养基中。Caspase 3 PE荧光单克…     

红细胞生成素诱导白血病K562细胞分化时WT1 mRNA表达的变化

近年来的研究表明 ,在白血病及某些实体瘤细胞中存在野生型WT1基因 (Wilms’tumorgene)的过度表达 ,提示WT1可能具有癌基因功能[1,2 ] ,而且WT1在白血病细胞增殖与分化中的作用仍有争议。我们应用红细胞生成素 (Epo)促进白血病K5 6 2细胞增殖及诱导分化时 ,WT1mRNA表达被上调 ,而没有随着细胞分化降低 ,提示WT1可能参与白血病细胞的增殖 ,Epo诱导K5 6 2细胞向红系分化时不需要WT1mRNA的下调。材料和方法1　细胞培养　K5 6 2细胞由日本大阪大学Sugiyama教授提供 ,生长于含有 10 %热灭活胎牛血清、12U/ml庆大霉素的RPMI 16 40培养…     

小剂量高三尖杉酯碱对K562细胞端粒酶活性及其分化的影响

以往的研究认为高三尖杉酯碱(HHT)主要通过抑制蛋白质合成或诱导白血病细胞凋亡发挥抗肿瘤作用.我们以K562细胞为对象,研究小剂量HHT对白血病细胞端粒酶活性的影响及作用机制.     

WT1基因转染抑制白血病细胞生长和集落形成并促进细胞分化

WT1基因的先天性缺失或功能缺陷可以导致Wilms瘤 ,因此普遍被认为是一种抑癌基因 ,但其在白血病发病中的作用尚有争论[1,2 ] 。我们应用逆转录病毒载体将WT1基因cDNA导入两种不同的人白血病细胞系K5 6 2和U937细胞并获得过度表达 ,发现WT1转染白血病细胞的生长和集落形成能力降低 ,对分化诱导剂的敏感性增加 ,支持该基因在白血病发病中的抑癌基因说。现将结果报道如下。材料和方法1　细胞培养　K5 6 2细胞和U937细胞 (购自美国ATCC)用含10 %胎牛血清的RPMI 16 40培养液 (Gibco/BRL)培养 ,双嗜性包装细胞PhoenixAmpho(NolanLab ,…     

小檗胺逆转K562/A02细胞耐药性及其机制

为了探讨钙调素拮抗剂小檗胺 (berbamine,BBM )逆转多药耐药的可能性及其机制 ,采用人红白血病细胞K5 6 2及其阿霉素 (ADR)诱导的耐药细胞K5 6 2 /A0 2与不同浓度ADR和BBM共培养后 ,经MTT比色法计算半数抑制浓度 (IC50 )、耐药倍数和增敏倍数 ;用流式细胞术检测细胞内ADR相对含量和P gp表达水平 ;用半定量RT PCR检测mdr1mRNA和抗凋亡基因survivinmRNA表达。结果显示 ,ADR对K5 6 2和K5 6 2 /A0 2的IC50 分别为1 16± 0 .0 9μmol/L和 37.4 7± 1.76 μmol/L ,K5 6 2 /A0 2对ADR的耐药倍数是K5 6 2的 32 .30倍。 5 μmol/L ,10μmol/L和 2 0 μmol/LBBM增加K5 6 2 /A0 2细胞对ADR的敏感性 ,并呈剂量依赖性 ,增敏倍数分别达 2 .0 1,9.6 8和4 1.18倍 (P值均 <0 .0 1)。5 μmol/L或 10 μmol/LBBM作用 2小时 ,使K5 6 2 /A0 2细胞内ADR相对含量增加到1 4 1和 1 5 2倍 (P <0 .0 1) ;作用 72小时使K5 6 2 /A0 2细胞P gp表达分别下降 4 .12 % ( P <0 .0 5 )和 2 7.0 9% (P<0 .0 1) ,且下调mdr1mRNA和survivinmRNA表达。结论 :BBM提高耐药细胞K5 6 2 /A0 2胞内的ADR浓度 ,下调mdr1mRNA、P gp及survivinmRNA的表达 ,使其对ADR的敏感性显著增高 ,从而逆转耐药性。     

细胞内钙与K562/A02细胞多药耐药相关性的研究

本研究旨在探讨白血病耐药细胞的发生及其逆转机制与细胞内钙离子浓度的关系。用甲基四唑蓝法(MTT)测定柔红霉素 (daunomycin ,DNR)的细胞毒性 ,用Fura 2 /AM方法测定耐药细胞株K5 6 2 /A0 2及其敏感株K5 6 2的静息 [Ca2 ]i水平 ,并观察了柔红霉素及耐药调节剂汉防己甲素 (Tetrandrine,Tet)、屈洛昔芬 (droloxifene,DRL)单独或联合应用后细胞内游离钙离子浓度的变化。结果表明 :1μmol/LTet,5 μmol/LDRL均能增加DNR对耐药细胞系K5 6 2 /A0 2的细胞毒作用 ,IC50 (半数抑制量 )分别为 ( 7.2 8± 2 .0 6 ) μg/ml,( 7.5 8± 3.4 4 ) μg/ml,逆转倍数为 2 .94和 2 .82倍。两药联合作用明显增强 ,IC50 为 ( 1.6 6± 0 .4 1) μg/ml,逆转倍数达 12 .9倍。静息状态下K5 6 2 /A0 2细胞的游离钙离子浓度显著高于K5 6 2细胞。 1μmol/LTet,5 μmol/LDRL单独作用于K5 6 2 /A0 2细胞引起 [Ca2 ]i的明显升高 ,两者联合应用有拮抗作用。结论 :K5 6 2 /A0 2细胞内Ca2 浓度的增高可能是导致其耐药的原因之一 ,但耐药调节剂Tet,DRL对耐药细胞 [Ca2 ]i的影响在其逆转耐药中的作用有待进一步研究     

survivin基因在血液肿瘤细胞株的表达

survivin基因是近年来被发现的凋亡蛋白抑制因子家族(IAP)成员之一,其结构简单,组织分布具有明显的特征。我们研究了其在不同类型血液肿瘤细胞株中的表达,现报道如下。对象和方法1　研究对象　将巨核细胞白血病细胞株Dami、Burkitt’s淋巴瘤细胞株Raji、髓系白血病细胞株HL 6 0、组织细胞淋巴瘤细胞株U937、红白血病细胞株HEL、T细胞白血病细胞株6T CEM、慢性髓细胞白血病细胞株K5 6 2、T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat、急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4、骨髓增生异常综合征RAEB t细胞株MUTZ 1(各细胞株均为我院保种)置于RPMI 16 4 0…     

维生素K3诱导MR2细胞凋亡及其与三氧化二砷联合作用的体外研究

近年来 ,已有研究发现 ,维生素K3(VK3)对某些实体肿瘤和白血病细胞有诱导凋亡作用[1 ] ,然而其作用机制不十分清楚。我们在证实VK3对MR2细胞具有诱导凋亡作用的同时 ,观察其与三氧化二砷 (As2 O3)的联合作用 ,并进一步探讨VK3可能的作用机制。材料和方法1　主要试剂　VK3(亚硫酸氢钠甲萘醌 )注射剂购于无锡市第七制药厂。As2 O3购于美国Sigma公司。MDA试剂盒、谷胱甘肽 (GSH)试剂盒及超氧化物歧化酶 (SOD)检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。VK3使用时以RPMI 16 4 0溶解稀释 ,配制成所需浓度。 1.0mol LAs2 O3经NaOH溶…     

高三尖杉酯碱诱导的白血病耐药细胞基因表达谱的变化

目的 探讨高三尖杉酯碱(HHT)诱导的人白血病细胞耐药相关分子.方法 在前期建立的HHT诱导的人白血病多药耐药细胞株K562/HHT的基础上,采用基因芯片技术比较K562/HHT细胞、其亲本K562细胞以及用耐药逆转剂米非司酮(RU486)作用后的K562/HHT(K562/HHT/RU486)细胞三者基因表达谱的差异,选择在这三种细胞中呈动态变化的骨髓细胞X染色体上酪氨酸激酶(BMX)基因用RT-PCR和Western blot法在转录和翻译水平进行验证,进而转染BMX基因到K562和K562/HHT细胞,观察BMX过表达时这两种细胞内柔红霉素(DNR)含量的变化,确定BMX是否在K562/HHT细胞耐药形成中发挥作用.结果 耐药细胞K562/HHT与其亲本K562细胞相比,共有117个基因表达有显著差异,其中57个基因表达明显上调,60个基因表达明显下调,耐药细胞K562/HHT中多药耐药基因mdr1表达明显上调;K562/HHT/RU486细胞与K562/HHT细胞相比,13个基因表达明显上调,37个基因表达明显下调.这些差异表达的基因涉及耐药、细胞信号传导、细胞分化、细胞增殖、转录调节以及离子转运等.基因NM-001721(BMX)、NM-031459(SESN2)、NM-033642(FGF13)和AL 049309(SFRS12)在两组芯片中的表达均有显著差异.其中BMX基因在K562/HHT细胞中的表达与K562细胞相比,明显上调,在K562/HHT/RU486细胞则较K562/HHT细胞减低.进一步用RT-PCR和Western blot法检测得到了相同的结果.RT-PCR和Western blot证实BMX质粒转染的K562及K562/HHT细胞BMX表达均上调,流式细胞术检测到K562及K562/HHT细胞内DNR含量荧光强度分别为79.28±4.04和29.84±2.67,均较转染前荧光强度158.52±8.08和58.58±6.53显著减低.结论 BMX在高三尖杉酯碱诱导的人白血病多药耐药细胞株K562/HHT耐药性产生中发挥作用.     

As2S2与STI 571协同诱导K562细胞凋亡

目的　探索As2 S2 和STI 5 71联合使用对K5 6 2细胞的诱导凋亡作用及其机制。方法　用细胞计数法研究As2 S2 对K5 6 2细胞的生长抑制作用 ;细胞凋亡的检测用流式细胞术、基因组DNA电泳、细胞形态学观察等方法 ;蛋白表达的检测采用Western blot法 ;基因表达的变化用半定量RT PCR法。结果　As2 S2 1～ 5 μmol/L作用 2 4～ 72h ,即可明显抑制K5 6 2细胞增殖 ,3～ 5 μmol/L作用 4 8～ 72h即可诱导K5 6 2细胞凋亡。 3μmol/LAs2 S2 作用 72h ,细胞凋亡率达 34.4 % ;5 μmol/LAs2 S2 作用 4 8,72h ,细胞凋亡率分别达 2 1.8%和 4 6 .0 %。 1μmol/LSTI 5 71作用 4 8h ,细胞凋亡率为 (18.4± 1.4 ) % ;5 μmol/LAs2 S2 作用 4 8h ,细胞凋亡率为 (15 .8± 1.2 ) % ;而两者合用细胞凋亡率上升为 (40 .6± 2 .0 ) %。对于U937细胞 ,单用 1μmol/LSTI5 71作用 4 8h ,细胞凋亡率为 (4.5± 1.1) % ;单用 5 μmol/LAs2 S2 作用 4 8h ,细胞凋亡率为 (6 .0± 1.2 ) % ;而两者合用 ,细胞凋亡率为 (7.3± 1.0 ) % ,无明显协同作用。As2 S2 能降低K5 6 2细胞中Bcr Abl蛋白水平 ,并抑制c Abl和Bcr AblPTK活性 ,但As2 S2 并不调变bcr abl基因表达水平。结论　As2 S2 联合STI 5 71可增强诱导K5 6 2细胞凋亡的作用 ,其机制可能     

转染反义VEGFl21 cDNA恢复K562细胞β1整合素的活化功能

为了探索血管内皮细胞生长因子 (VEGF)在K5 6 2细胞 β1整合素活化功能中的作用 ,利用转染正义 (S)、反义 (As)VEGF12 1cDNA及空载体 (V ,pcDNA3 )的不同K5 6 2细胞株 ,通过流式细胞术检测其粘附分子VLA 4(CD4 9d/CD2 9)和VLA 5 (CD4 9e/CD2 9)表达及 β1整合素的可活化性。结果显示 :K5 6 2 /V ,K5 6 2 /S和K5 6 2 /As细胞 β1整合素VLA 4 (CD4 9d/CD2 9)与VLA 5 (CD4 9e/CD2 9)的表达率均在 92 %以上 ,但经 β1整合素活化剂 8A2抗体激活后 ,K5 6 2 /As细胞可活化表位 9EG7表达率较K5 6 2 /V细胞明显提高 (75 .6± 10 .5vs 4 1.2± 2 .1% ,P <0 .0 1)。结论 :转染反义VEGF12 1cDNA能增加K5 6 2细胞 β1整合素的可活化性     

三氧化二砷对K562及其多药耐药细胞系K562/A02细胞的诱导凋亡研究

Ｐ170表达阳性的白血病细胞往往对多种不同化学结构和作用靶点的药物同时发生耐药。我们观察了三氧化二砷(Ａｓ2 Ｏ3 )对体外培养的人急性红白血病细胞系Ｋ5 6 2及其多药耐药细胞系Ｋ5 6 2 /Ａ0 2细胞的凋亡诱导作用 ,以探讨Ａｓ2 Ｏ3 对多药耐药白血病细胞的作用。材料和方法1　药品　Ａｓ2 Ｏ3 (Ｓｉｇｍａ公司 )溶于Ｈａｎｋｓ缓冲液中 ,配制成 1ｍｍｏｌ/Ｌ ,保存于 4℃。2　细胞株及细胞培养　Ｋ5 6 2及其多药耐药细胞系Ｋ5 6 2 /Ａ0 2细胞 (中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所提供 )置于含体积分数为 10 %小牛血清的ＲＰＭ…     

姜黄素对K562细胞STAT5信号分子的影响

目的　了解姜黄素对信号分子的影响 ,探讨其抗白血病的分子机制。方法　用MTT比色法检测细胞增殖活性。用原位杂交法检测细胞STAT5mRNA的表达。用免疫印迹法 (Westernblot ting)检测细胞STAT5蛋白的表达。结果　①姜黄素抑制K5 6 2细胞增殖与作用时间及姜黄素浓度分别呈依赖关系 ,最适作用时间为 12h ,最适作用浓度为 2 5 μmol L。②姜黄素组K5 6 2细胞STAT5mRNA表达的阳性率为 19% ,与K5 6 2细胞组 (31% )相比明显减少 (P <0 .0 1)。③姜黄素组K5 6 2细胞STAT5蛋白的表达 (A值为 15 2 6 6± 76 9)与K5 6 2细胞组 (A值为 2 5 781± 12 4 0 )相比明显减低 (P <0 .0 1)。结论　姜黄素能抑制K5 6 2细胞STAT5信号分子的活化及表达 ,进一步抑制白血病细胞的增殖。     

bFGF和VEGF在急性白血病中的表达及对HL-60细胞生长的影响

为了研究急性白血病患者血清及细胞株培养上清中碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的表达水平 ,并初步探讨白血病患者VEGF水平的评价方法以及VEGF特异性反义寡脱氧核苷酸(ASODN)的抗血管生成作用 ,用夹心ELISA法测定患者血清、细胞株 (HL 6 0、U937、NB4、JM和K5 6 2 )培养上清中bFGF和VEGF浓度 ,比较其差异 ,将VEGF血清浓度测定值 (pg ml)、血清浓度测定值经外周血血小板计数标化后标化值VEGF PLT(pg 10 6 )分别作为比较指示 ;HL 6 0细胞经不同浓度VEGFASODN作用后 ,利用噻唑蓝、ELISA法分别测定靶细胞的生长状态及其VEGF分泌水平。结果发现 :①急性白血病患者血清bFGF阳性率 (37.5 % )高于健康对照者 (10 % ) (P <0 .0 1) ,在 5株白血病细胞株中 ,NB4 、U937和K5 6 2细胞上清中检测到了bFGF表达 ;②急性白血病患者及健康者血清VEGF测定值差异无统计学差异 ,但二者标化值测相差显著 (P <0 .0 5 ) ;除U937外 ,其余 4株细胞株培养上清中均有VEGF表达 ;③HL 6 0细胞经 0 .5 ,1及 5 μmol LVEGFASODN作用 2 4小时后 ,其存活率与对照组相比明显降低 (P <0 .0 5 ) ;经 1,5 ,2 0 μmol LVEGFASODN作用 2 4小时后 ,HL 6 0细胞培养上清中VEGF浓度均明显低于对照 (P <0 .0 5 )。结论 :     

高三尖杉酯碱启动白血病细胞凋亡的比较蛋白质组学研究

目的：解码高三尖杉酯碱(HHT)启动白血病细胞凋亡相关蛋白。方法：在建立HHT启动HL-60细胞早期凋亡模型的基础上，分别提取未用和经HHT作用的HL-60细胞总蛋白，构建其相应的双向电泳图谱，应用图像扫描仪及图像分析软件获得差异蛋白斑点的信息，运用MALDI-TOF-MS分析呈显著性差异的蛋白斑点，将检测出的肽链质量输入蛋白质数据库获得差异蛋白质信息。结果：MHCI类抗原分子、钙结合蛋白D-28K、氯通道蛋白6、癌蛋白OP18、锌指蛋白HELIOS和凋亡抑制物样蛋白2与HHT启动白血病HL-60细胞凋亡相关。结论：运用比较蛋白质组学技术解码HHT启动白血病细胞凋亡相关蛋白，将有助于揭示HHT治疗白血病的机制，为开发HHT相关的以诱导白血病细胞凋亡为靶位的药物先导化合物提供参考。     

高三尖杉酯碱对慢性粒细胞白血病细胞及K562细胞端粒酶活性的影响

我们观察了高三尖杉酯碱(HHT)对慢性粒细胞白血病(CML)患白血病细胞及K562细胞端粒酶活性的影响，对HHT治疗CML的作用机制进行初步探讨。     

简单快速扩增获取γδT细胞的方法

近年来的研究发现 ,γδT细胞在机体的抗感染、抗肿瘤及免疫调节等方面具有重要作用。过去用流式细胞仪或磁性细胞分离技术来分离γδT细胞 ,不仅需要大量的外周血 ,而且所需仪器设备昂贵 ,操作复杂。我们用结核杆菌低分子多肽抗原 (Mtb Ag)刺激外周血淋巴细胞进行快速扩增 ,结果短期内可获得大量的γδT细胞 ,现介绍如下。材料和方法1　材料　流式细胞仪为CoulterEPICSR XL MCL型 ,美国Beckman Coulter公司产品 ;磁性细胞分选器为MiltenyiBiotec公司产品。牛Mtb Ag参照文献 [1]自制 ;RPMI16 4 0细胞培养液为Gibco公司产品 ;鼠…