RNA干扰Ezrin对肾癌细胞株786-0增殖及侵袭力的影响

目的探讨膜-细胞骨架联接蛋白Ezrin对肾癌细胞株786-0细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法以ezrin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体设计和构建重组体,设计2条发夹式RNA(shRNA),合成后克隆入载体Pgenesil-1,脂质体Lipofectamine2000转染进786-0细胞,观察RNA干扰Ezrin后肾癌细胞株786-0细胞增殖及侵袭能力的改变。结果稳定转染细胞荧光定量PCR结果显示shRNA-ezrin1对ezrin mRNA的表达量抑制率66.33%,稳定转染细胞Ezrin下调率达93%,shRNA干扰后786-0细胞增殖活性减弱,GO/G1时段明显延长(P<0.01),PI缩短(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01);细胞黏附力减弱,细胞运动、穿孔能力减弱(P<0.01)。结论 RNA干扰Ezrin可有效抑制786-0细胞增殖活性、降低细胞的侵袭力,Ezrin在人肾癌细胞增殖、侵袭中发挥重要作用。     

YY1基因在肾癌组织中的表达及对肾癌细胞功能的影响

目的探讨YY1基因在肾癌组织中表达及小干扰RNA(siRNA)对人肾癌786-O细胞增殖和侵袭的影响。方法以Real-Time PCR检测转录因子YY1在20对肾癌及癌旁组织中的表达;采用脂质体转染法将siRNA转染入人肾癌786-O细胞中,Real-Time PCR和Western印迹法检测YY1转染效率;MTT和平板克隆形成实验检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期;Transwell及Matrigel检测细胞侵袭能力,Real-Time PCR检测基质金属蛋白酶MMP9及钙黏附蛋白E-cadherin mRNA表达水平。结果与癌旁组织相比,20对癌组织中YY1 mRNA表达量显著增高(P<0.01)。转染人肾癌786-O后,siRNA-YY1组细胞YY1mRNA的表达抑制率达66%(P<0.01),蛋白表达水平也明显低于siRNA-NC组。与NC组相比,siRNA-YY1组细胞增殖能力显著降低(P<0.01),细胞生长被阻滞在G0/G1期,细胞侵袭能力明显减弱(P<0.01)。此外,与NC组相比,MMP9及E-cadherin mRNA水平有显著差异(P<0.01)。结论 YY1在肾癌组织中高表达,靶向沉默YY1可以在体外显著抑制肿瘤细胞的生长和侵袭能力。YY1特异性siRNA作为一种治疗肿瘤的新途径值得进一步研究。     

体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响。方法应用实时定量PCR方法检测七株胃癌细胞株中REG4基因的mRNA表达。针对REG4基因设计三条小干扰RNA片段(siRNA1、siRNA2、siRNA3),瞬时转染高表达胃癌细胞株。用RT-PCR方法检测转染后REG4基因的mRNA表达水平、MTT法检测细胞增殖能力、AnnexinV-PI法检测细胞凋亡水平。结果以永生化正常胃粘膜细胞株GES-1作为参照。MKN-45和AGS胃癌细胞株中REG4表达水平升高200倍以上,遂选用AGS细胞进行RNA干扰。RT-PCR结果证实siRNA2、siRNA3均有干扰效果,尤以siRNA3效果明显。选用siRNA3干扰AGS细胞株,MTT实验结果证实干扰AGS后,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。AnnexinV-PI实验结果显示细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论干扰REG4基因具有抑制胃癌细胞增殖、促进凋亡的作用,REG4基因可能成为胃癌基因靶向治疗的新靶点。     

siRNA抑制肾癌786-0细胞G250基因的表达

目的 观察小干扰RNA(siKNA)对肾癌786-0细胞株G250基因表达的抑制效果,以建立稳定的RNA干扰(RNAi)技术及用于进一步对G250基因的研究.方法 体外合成4条针对G250基因的siRNA和1条阴性对照序列,并利用载体pRNAT-U6.1/Neo构建重组质粒.测序鉴定后,以脂质体介导转染人肾癌786-0细胞株;分别应用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹技术测定G250 mRNA和蛋白的表达情况.结果 DNA测序和酶切鉴定表明针对G250基因的siRNA表达载体构建成功.4条siRNA分别使G250mRNA的表达降低了35.56%、49.27%、45.88%和65.13%,G250蛋白的表达量也相应降低.结论 siRNA可有效抑制786-0细胞株中G250基因的表达,满足下一步实验的需要.     

RNA干扰技术特异性抑制肾癌survivin表达的实验研究

目的:体外转录合成survlvin siRNA(Small interference RNA,siRNA),观察其在肾癌786-O细胞株中抑制survivin的表达情况.方法:体外转录合成3组survivin序列特异性双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA),转染786-O细胞株中,用RT-PCR和Western blot检测转染后survivin基因的mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞活性.结果:有2组转染特异性siRNA的786-O细胞表达survivin mRNA及蛋白均下调.活性受到抑制,另一组效果不明显.结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制肾癌786-O细胞中survivin的表达,抑制细胞的活性,RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术可能为肾癌的基因治疗提供一种新策略.     

RNA干扰p38基因对肾癌786-O细胞生物学特性的影响及对舒尼替尼的增敏作用

目的 探讨RNA干扰p38基因对人肾癌细胞株786 0增殖、侵袭、细胞周期和细胞对舒尼替尼敏感性的影响.方法 构建针对p38的siRNA531和siRNA659两条siRNA,分别将其转染至肾癌786-O细胞株,即为siRNA531组和siRNA659组,同时设置转染无义siRNA的阴性对照组和仅加转染试剂的空白对照组.应用RT-PCR技术检测786-0细胞p38 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测p38蛋白的表达.CCK-8法检测细胞的增殖情况和对舒尼替尼的敏感性,流式细胞术检测细胞的周期改变情况,Transwell实验检测细胞的侵袭能力.结果 RT-PCR及蛋白质印迹法检测发现siRNA转染后786-0细胞p38mRNA及蛋白的表达均降低.与空白对照组和阴性对照组相比,siRNA531组和siRNA659组786-O细胞在转染后3～5 d时的增殖率均降低(P＜0.05,P＜0.01),细胞对舒尼替尼的敏感性增加,两组对舒尼替尼的IC50值均低于阴性对照组[(3.2±0.3)、(1.4±0.1) μmol/mL vs (5.4±0.2)μmol/mL,P＜0.05].siRNA531组、siRNA659组G1期细胞数量明显多于对照组,且两组786-O细胞出现G0/G1阻滞.转染24 h后,两组的穿膜细胞数分别为56.43±6.02、34.00±8.12,与阴性对照组(76.27±5.08)相比,两组细胞的侵袭能力均下降(P＜0.01).结论 通过转染p38特异性siRNA可以成功沉默肾癌细胞株786-O的p38基因的表达,抑制肾癌细胞株786-O的增殖、侵袭能力,增加其对舒尼替尼的敏感性,为后续研究肾癌治疗及靶向耐药奠定基础.     

COL1A1-shRNA表达载体的构建及对胃癌细胞增殖迁移的影响

目的:构建COL1A1特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,体外评价其对胃癌细胞BGC-823增殖迁移的影响.方法:根据文献获得3个COL1A1的siRNA靶序列,设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencerTM 4.1- CMV neo线性质粒载体连接,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选获得重组质粒;经DNA测序鉴定重组体DNA序列正确后转染胃癌BGC-823细胞,利用G418筛选稳定表达COL1A1-shRNA的BGC-823细胞株.通过实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后细胞COL1A1在mRNA及蛋白质水平的表达;MTT法及Transwell法检测COL1A1干扰后胃癌细胞增殖及迁移能力的变化.结果:序列测定表明成功构建3个COL1A1-shRNA表达载体.实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测显示,COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞的COL1A1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);MTT试验及Transwell迁移试验显示,转染后细胞增殖及迁移能力明显降低(P<0.05).结论:COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞能有效抑制细胞COL1A1的表达及癌细胞的增殖迁移.     

青蒿素对肾癌细胞株786-0细胞的增殖和Fascin表达的影响

目的:探讨青蒿素对肾癌细胞株786-0细胞的增殖和Fascin表达的影响。方法:选用786-0肾癌细胞株,分别通过不同浓度的青蒿素作用细胞株,收集不同时间点(0、24、48、72 h)的细胞,运用细胞增殖CCK-8法测定青蒿素对肾癌细胞株786-0细胞的增殖;通过Western Blot检测青蒿素干预后肾癌细胞株786-0细胞Fascin的表达。结果:随着药物浓度的增加,青蒿素可明显抑制肾癌细胞株786-0细胞的增殖(P0.01),青蒿素可显著降低肾癌细胞株786-0 Fascin蛋白的表达(P0.05)。结论:青蒿素通过抑制肾癌细胞增殖和Fascin蛋白的表达,从而抑制肿瘤细胞的恶性增生。     

siRNA抑制DJ-1基因表达对肺鳞癌SK-MES-1细胞生物学行为的影响

目的:采用RNA 干扰技术下调DJ-1 基因在肺鳞癌细胞SK-MES-1 中的表达, 探讨DJ-1 表达下调对SKMES-1 细胞生物学行为的影响, 以期探讨DJ-1 基因的功能。方法:构建靶向DJ-1 基因siRNA 慢病毒载体( 重组慢病毒中有绿色荧光蛋白真核表达框), 感染SK-MES-1 细胞(DJ-1 siRNA 组), 并设立慢病毒载体对照组(Control-siRNA 组)及空白对照组。荧光显微镜下观察并计算感染效率, Western 印迹检测各组细胞中DJ-1 蛋白表达水平, MTT法检测细胞增殖能力, 流式细胞术测定细胞周期, Transwell 小室实验检测细胞体外迁移侵袭能力。结果:与Control-siRNA组及空白对照组比较, DJ-1 siRNA 组的DJ-1 蛋白表达受到抑制、细胞增殖能力明显减弱(P<0.01)、G1/G2 期细胞数增多和S 期细胞数减少表明细胞周期受阻、细胞体外迁移和侵袭能力显著减弱(P<0.01)。结论:DJ-1 基因具有促进肺鳞癌细胞SK-MES-1 细胞的增殖和体外迁移侵袭的作用。     

TRPC1对人肾癌细胞A498增殖和迁移的影响

目的探讨瞬时受体电位C1(TRPC1)对人肾癌细胞A498细胞增殖和迁移的影响。方法利用荧光定量PCR检测人肾癌细胞A498、786-O和GRC-1中TRPC1的表达水平。设计并合成靶向TRPC1的特异性sh RNA,通过脂质体转染法转染TRPC1表达最高的人肾癌细胞A498以构建稳定低表达TRPC1细胞株,通过免疫印迹法和荧光定量PCR来验证sh RNA的干扰效率;通过MTT比色法检测干扰后细胞的增殖能力;通过Transwell小室测细胞迁移情况;免疫印迹法检测PI3K和AKT的表达水平。结果在3株肾癌细胞中A498的TRPC1表达量最高;特异性靶向TRPC1的sh RNA能够有效下调A498细胞中TRPC1的表达;特异性sh RNA干扰组细胞较其他两组细胞增殖显著减慢(F=42.31,P0.01);A498/sh RNA组的迁移细胞数显著低于A498组和A498/Con组(F=24.52,P0.01);A498/sh RNA组细胞的PI3K和AKT蛋白的表达较A498组和A498/Con组显著下调。结论采用RNA干扰技术能够有效沉默A498细胞的TRPC1基因,并致使其细胞增殖能力下降以及细胞迁移能力减弱,其中可能的机制为通过调节细胞因子PI3K来调控人肾癌细胞的增殖和迁移。提示TRPC1在肾癌的发生发展中起着较为重要作用,TRPC1可能成为治疗肾癌的新靶点。