肝癌细胞HepG2株线粒体亮氨酸拉链EF-hand结构域基因突变实验研究

[目的]检测肝癌细胞HepG2株线粒体亮氨酸拉链EF-hand结构域(LETM1)基因突变.[方法]提取HepG2株细胞中的mRNA并合成cDNA,采用PCR方法扩增LETM1基因,连接到真核表达载体pCMV-3Myc-2A上,构建重组质粒pCMV-3Myc-LETM1,酶切,测定序列并检测突变位点.[结果]肝癌细胞LETM1基因发生突变和氨基酸改变,突变发生于G148A(缬氨酸→异亮氨酸)、G320A(甘氨酸→天冬酰胺)、G344A(精氨酸→组氨酸)和A1760G(赖氨酸→精氨酸).[结论]肝癌细胞HepG2线粒体LETM1基因发生突变.     

前列腺癌及良性增生组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的：研究前列腺癌(Pca)及良性前列腺增生(BPH)组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况。方法：采用RT—PCR、DNA序列分析技术对12例Pca及20例BPH组织中的polβ进行检测,并利用DNASIS、OMIGA等软件分析测序数据。结果：Pca组织中polβ突变率为4／12,BPH组织中polβ突变率为1／20。突变形式如下：①点突变：325位A→G转换(71位Glu→G1)),721位A→G转换(203位Glu→Gly),768位C→T转换(219位Gln→终止码),801位A→G转换(230位Lys→Glu),853位A→G转换(247位Glu→Gly),1071位A→G转换(320位Phe→Leu),177．188位CT→AA(22位Leu→Asn)。②58bp片段缺失(181～238位),导致移码及提前终止。结论：Pca组织中polβ的突变以点突变A→G转换为主要突变形式。181～238位的58bp的大片段缺失系国内外首次发现的突变形式DNA polβ突变可能与Pca的发生、发展密切相关。     

人鼻咽癌细胞系中基质金属蛋白酶9的表达及意义

目的 检测MMP9在鼻咽癌细胞株及细胞株裸鼠成瘤瘤块组织中的表达,探讨MMP9的表达与鼻咽癌发生、发展的关系.方法 采用细胞免疫组织化学技术、RT-PCR、Western blot检测鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2和SUNE15株细胞株中MMP9表达;免疫组织化学(SABC 法)检测HNE1和CNE2细胞裸鼠成瘤后瘤块MMP9的表达.结果 5株鼻咽癌细胞株中,免疫组化显示HNE1和SUNE1细胞中MMP9蛋白表达阳性.RT-PCR及Western Blot检测结果显示.HNE1和SUNE1细胞中MMP9 mKNA及蛋白高表达.HNE1和CNE2细胞裸鼠种植成瘤后,5例瘤块中MMP9蛋白均强阳性表达.结论 MMP9在鼻咽癌细胞系中表达阳性,成瘤后表达增强,提示MMP9的表达可能与鼻咽癌侵袭转移有关.     

人源细胞色素P450 2E1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 人源细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1, CYP2E1)基因的克隆及其表达?方法:采用RT-PCR方法对我国汉族人CYP2E1基因进行了克隆,并利用pET-32a(+)原核表达载体进行了表达?结果:经过酶切与测序鉴定表明扩增的CYP2E1基因含有完整的编码序列,除该基因编码区第1 263位核苷酸发生C→T的突变(未引起氨基酸发生突变)外,其他核苷酸与氨基酸序列与GenBank中登录发表的人CYP2E1基因完全相同?SDS-PAGE分析结果显示该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)后在BL21(DE3)大肠杆菌中成功表达?结论:该基因的成功表达为开展临床前药物安全性评价与药物代谢分析的后续工作打下了基础?     

人食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变的研究

目的：研究人食管癌组织中DNA聚合酶β（POLB）基因的突变情况。方法：利用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）、单链构象多态性（SSCP）和序列分析对30例人食管癌标本组织中DNA聚合酶β基因进行了检测。利用DNASIS、OMIGA等软件分析测序数据。结果：手术切除浸润癌组30例食管癌标本中有13例POLB发生变异,突变率为43．3％（13／30）;而癌旁对照29例正常,仅1例异常。早期原位癌组14标本中有5例POLB发生变异,突变率为35．7％（5／14）;另外,在1例食管鳞状上皮增生中也发现有POLB变异发生。在7例癌组织中存在相同58bp(177位到234位）的基因片段缺失;共有8种点突变形式：（1）375位A→G（Ile→Val),(2)454位T→C（Phe→Ser),(3)462位G→T（Tlu→终止码）,（4）466位G→A（Gly→Glu）,（5)613位A→T（Lys→Ile),(6)648位G→C（Gly→Arg),(7)660位A→G（Arg→Gly)(8)670位A→G（Glu→Gly)。结论：本研究首次在食管癌中发现POLB基因突变;该酶基因突变可能与食管癌的发生、发展相关。     

人细胞色素P450 2E1 cDNA在鼻咽癌细胞系CNE-2的稳定表达

目的 :为进一步研究人细胞色素P45 0E1 (cytochromeP45 0 2E1 ,CYP2E1 )蛋白对相关化学致癌物的体外代谢功能及其在化学物质鼻咽癌 (nasopharyngealcarcinoma ,NPC)变中的作用机制提供体外模型。方法 :应用基因重组技术构建人CYP2E1cDNA真核表达载体pcDNA3 .1 - 2E1 ,并经脂质体介导转入CNE2细胞 ,通过G41 8筛选后挑选若干抗性细胞克隆扩大培养。结果 :经Southernblot和Westernblot对一系列抗性克隆细胞进行检测 ,获得 2个具有外源CYP2E1cDNA基因稳定整合和表达的细胞克隆CNE2 - 2E1 - 1及CNE2 - 2E1 - 2。结论 :建立了可供CYP2E1代谢相关的化学致癌物筛选及CYP2E1在NPC癌变中作用机制研究的体外模型。     

人胸腺素α原cDNA序列多态性分析

目的:通过对人胸腺素α原(prothymosin-α,ProTα)cDNA测序来分析人胸腺素α原的序列多态性.方法:应用RT-PCR技术从健康人外周血及健康新生儿脐带血中扩增胸腺素α原cDNA,纯化后与克隆载体pMD18-T连接,进行克隆测序,并与标准序列比对,分析其多态性.结果:序列分析结果表明,克隆的ProTα基因的核苷酸序列并不一致.与已报道的胸腺素α原基因(NM-002823)进行比较,发现存在2种变异:Ⅰ类变异包括107位单核苷酸突变(A→G)、110～121位和191～205位的核苷酸片段缺失;Ⅱ类变异为306位单核苷酸(G)缺失,多见于年龄60～80岁者.结论:本研究中ProTα cDNA序列存在2种变异,但并未影响其N-端前28个氨基酸.     

一种新的人类G6PD突变型的体外构建

目的:体外构建人类G6PD突变型.方法:①运用PCR方法获得含有G6PD基因开放阅读框的PCR产物,随后将PCR产物连接到18T-simple vector中,构建成18T-G6PD;②酶切下G6PD cDNA的开放阅读框并连接到pALTER-1 vector中,构建成pAL-G6PD重组子;③运用含有突变序列的寡核苷酸引物体外构建G6PD835-海口突变重组子(835A→G,T279A),命名为pAL-G6PD-AG.结果:获得了G6PD的T279A的突变重组子.结论:此项工作为进一步体外表达突变型G6PD,并展开比较人类G6PD新发点突变835-海口(835A→G,T279A)与正常G6PD的酶动力学差异的研究奠定基础.     

脑胶质瘤组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的:研究人脑胶质瘤组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况。方法:应用RT-PCR及SSCP检测22例脑胶质瘤、4例脑膜瘤、3例垂体瘤及1例肺部转移性鳞癌标本中polβ的表达,利用DNASIS、OMIGA软件及Chou&Fasman算法对扩增产物进行序列分析及蛋白质二、三级结构分析。结果:脑胶质瘤组织中DNApolβ突变率为6/22,共8个突变位点,2例发生504位A→G(131位Lys→Glu)、748位A→G(212位His→Arg)突变,2者蛋白质二级结构亦明显改变;598位T→C(162位Val→Ala)突变2例,但2者蛋白质二级结构无明显改变;2例Ⅲ级星形细胞瘤分别有2个和3个突变位点,但其各有1个相应的氨基酸未发生变异。Ⅱ级以下脑胶质瘤及脑膜瘤、垂体瘤等良性脑肿瘤组织均未发现DNApolβ基因突变。1例肺癌脑部转移性鳞状细胞癌DNApolβ基因出现5个突变位点,737位A→C(208位Pro未变异)、744位T→G(211位Lue→Val)、830位C→G(239位Cys→Trp)、866位A→C(251位Pro未变异)、870位A→C(253位Arg未变异),但蛋白质二级结构未改变。蛋白质三维结构图显示脑胶质瘤组织中6个氨基酸变异位点中,5个位于掌部,1个位于拇指部。结论:脑胶质瘤细胞中存在DNApolβ基因突变,且这些突变位点均为DNApolβ基因(尤其是掌部)活化结构域。提示脑胶质瘤的发生和发展可能与DNApolβ基因突变有关。     

Cloning and sequence analysis of human embryonic nasopharyngeal epithelial CYP2E1 cDNA]

OBJECTIVES: To investigate the role of CYP2E1 gene in chemical carcinogen-induced nasopharyngeal carcinogenesis and to provide new evidence about etiology and pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma. METHODS: RT-PCR was used to clone the CYP2E1 gene in human embryonic nasopharyngeal epithelial (HENE) cell, the transformed nasopharyngeal epithelial cell line (7,429), and the nasopharyngeal carcinoma cell line (HNE1). The cloned segments were inserted into pGEM-T Easy vector to sequence by DNA recombination technique. RESULTS: In comparison with HENE-2E1 cDNA, there were two point mutations at positions 846 (A to T) and 901 (A to G) in 7,429-2E1 cDNA as well as only one point mutation at position 901 (A to G) in HNE1-2E1 cDNA. In comparison with human (adult, ethanol-inducible) liver CYP2E1 gene (GenBank NO. J02843), HENE-2E1 cDNA had one point mutation at position 901 (G to A). All these point mutations didn't affect the amino acid sequence. But no base change was found in HNE1-2E1 cDNA. CONCLUSION: There are a few of base substitutions among HENE-2E1 cDNA, 7,429-2E1 cDNA, and HNE1 cDNA sequences. All these point mutations are synonymous mutation. The study reconfirms that the human CYP2E1 gene is relatively well conserved.     

cDNA representational difference analysis of differentially expressed cDNA sequences in human nasopharyngeal carcinoma

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｅａｒｃｈｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＮＰＣ）,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃａｎｄｉ...     

人细胞色素P450 2E1 cDNA在鼻咽癌细胞系CNE—2的稳定表达

目的：为进一步研究人细胞色素P450E1（cytochrome P450 2E1,CYP2E1)蛋白对相关化学致癌物的体外代谢功能及其在化学物质鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC)变中的作用机制提供体外模型，方法：应用基因重组技术构建人CYP2E1，cDNA真核表达载体pcDNA3.1-2E1，并经脂质体介导转入CNE2细胞，通过G418筛选后挑选若干抗性细胞克隆扩大培养，结果：经Southern blot和Western blot对一系列抗性克隆细胞进行检测，获得2个具有外源CYP2E1 cDNA基因稳定整合和表达的细胞克隆CNE2－2E1－1及CNE2－2E1－2，结论：建立了可供CYP2E1代谢相关的化学致癌物筛选及CYP2E1在NPC癌变中作用机制的体外模型。     

鼻咽癌中与已知基因同源的差异表达cDNA序列

采用新近发展的ｃＤＮＡ代表性差异分析法筛选鼻咽癌中不表达的或表达降低的ｃＤＮＡ序列。结果显示：有９个与已知基因高度同源的ｃＤＮＡ序列。通过对这些已知基因的结构和功能分析,发现有与细胞骨架成分相关的基因：ａ－ａｃｔｉｎｉｎ,ｅｚｒｉｎ和细胞角蛋白１３;     

EB病毒LMP1促进Tet-on-LMP1 HNE2鼻咽癌细胞增殖

目的探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白1（LMP1）对Tet-on-LMP1 HNE2鼻咽癌细胞生物学效应的影响.方法采用Western blot方法、流式细胞术DNA含量分析法、细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验和四唑盐（MTT）比色法检测不同剂量的DOX诱导下Tet-on-LMP1 HNE2细胞在不同时间点的增殖效应.结果在LMP1表达逐渐增强的情况下,Tet-on-LMP1 HNE2细胞由G0/G1期加速向S期的行进;细胞生长速度逐渐加快（P〈0.05）;软琼脂集落形成率逐渐上升（P〈0.05）;细胞吸光度值逐渐升高（P〈0.05）.结论EB病毒LMP1促进Tet-on-LMP1 HNE2鼻咽癌细胞增殖.     

A cDNA located on chromosome 7q32 shows loss of expression in epithelial cell line of nasopharyngeal carcinoma

ｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｓｏｎ 7ｑ32ｉｎＤＮＡｆｒｏｍ 2 4ｂｉｏｐｓｉｅｓｏｆｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｍａｔｃｈｅｄｎｏｒｍａｌｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆ 2 0ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ (ＥＳＴｓ)ｏｎ 7ｑ32ｂｅｔｗｅｅｎｈｕｍａｎｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ 1(ＨＮＥ1)ａｎ…     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

鼻咽癌转化基因的 2.8kb EcoRI 片段在鼻咽癌中不存在点突变

用改进的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术对鼻咽癌活检组织进行筛查，以检测Ｔｘ基因中与转化有关的序列在鼻咽癌中是否存在突变。在被检测的１１例配对的鼻咽癌标本中均未检测到泳动速率的改变。提示在多数鼻咽癌中基因突变不是Ｔｘ基因的活化方式。