cDNA representational difference analysis of differentially expressed cDNA sequences in human nasopharyngeal carcinoma

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｅａｒｃｈｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＮＰＣ）,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃａｎｄｉ...     

鼻咽癌中与已知基因同源的差异表达cDNA序列

采用新近发展的ｃＤＮＡ代表性差异分析法筛选鼻咽癌中不表达的或表达降低的ｃＤＮＡ序列。结果显示：有９个与已知基因高度同源的ｃＤＮＡ序列。通过对这些已知基因的结构和功能分析,发现有与细胞骨架成分相关的基因：ａ－ａｃｔｉｎｉｎ,ｅｚｒｉｎ和细胞角蛋白１３;     

3号染色体短臂21-22区域63个新基因在鼻咽癌组织中的差异表达

目的 寻找与鼻咽癌发病密切相关的未知基因。方法 对63个定位于3号染色体短臂21-22D3S1609-D3S1295区域的单拷贝并代表未知基因的EST簇进行网上克隆,在获取基因大片段或全长cDNA序列的基础上,应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测63个未知基因在4种鼻咽癌细胞株、32例鼻咽部低分化鳞状细胞癌组织和16例鼻咽部慢性炎症组织中的表达状况。结果 49个未知基因在鼻咽癌组织和鼻咽部慢性炎症组织间的表达水平无显著性差异;8个未知基因在鼻咽癌和鼻咽部慢性炎症组织中均不表达;2个未知基因在鼻咽癌组织中表达明显增强;4个未知基因在鼻咽癌组织中表达明显减弱,其中Hs.27566基因在鼻咽癌细胞和组织中均显著低表达或不表达。结论 在染色体3p21-22D3S1609-D3S1295区域构建了63个未知基因在鼻咽癌的表达差异谱;筛选出6个在鼻咽癌组织中差异表达的未知基因。     

Molecular cloning and characterization of NAG-7: a novel gene downregulated i n human nasopharyngeal carcinoma

目的　分离位于染色体 3p2 4 2 6区域中鼻咽癌新的抑瘤基因。方法　在染色体 3p2 4 2 6鼻咽癌杂合性丢失 (lossofheterogosity ,LOH)高频区 ,用RT PCR及Northern杂交检测了2 0个表达序列标记 (expressedsequencetag ,EST)在鼻咽癌细胞株HNE 1和原代培养的正常鼻咽上皮细胞中的表达水平 ,并对其中一个在鼻咽癌细胞株HNE 1中表达下调的EST在 19例鼻咽癌活检组织中的表达进行了检测。用cDNA文库筛选方法获得其全长cDNA序列 ,对该序列进行了初步分析。结果　获得一个位于染色体 3p2 5 3的新基因 ,命名为NAG 7基因。该基因在 2 6 3% (5 19)的鼻咽癌活检组织中表达下调。它全长 16 6 7bp ,其开放阅读框 (openreadingframe ,ORF)编码一个含 94个氨基酸的碱性蛋白质 ,分子量为 110 2 3 87道尔顿 ,预测为一跨膜蛋白质。它含有一蛋白激酶C磷酸化位点和肉豆蔻基位点。迄今为止 ,NAG 7基因序列在基因库中未见任何同源性基因。结论　NAG 7基因是一个在鼻咽癌中表达下调的新基因 ,它的改变可能参与了鼻咽癌的发生发展     

鼻咽癌组织RASSF1A基因的表达

目的探讨RASSF1A基因在鼻咽癌发病过程中的作用。方法采用逆转录-聚合酶链技术在4种鼻咽癌细胞株、32例鼻咽癌组织和16例正常鼻咽部组织中检测RASSF1A基因的表达,并分析鼻咽癌组织在3p21.3 D3S4604微卫星多态性位点的等位基因杂合性丢失状况。结果RASSF1A基因在4种鼻咽癌细胞株中低表达,32例鼻咽癌组织的RASSF1A基因表达显著低于16例正常鼻咽部组织(P=0.001);43.75%(14/32)的鼻咽癌组织在3p21.3 D3S4604位点发生了杂合性丢失。鼻咽癌RASSF1A基因表达与性别、年龄、颈部淋巴结转移、TNM临床分期、D3S4604位点杂合性丢失和血清EB病毒VCA/IgA抗体滴度无显著相关性,但伴远处转移的鼻咽癌组织的RASSF1A表达显著低于无远处转移的鼻咽癌(P=0.014)。结论RASSF1A基因的表达下调可能是鼻咽癌发病过程中的晚期事件,3p21区域可能还存在与鼻咽癌发生密切相关的抑瘤基因。     

3号染色体短臂21-22区域63个新基因在鼻咽癌组织中的差异表达

目的寻找与鼻咽癌发病密切相关的未知基闪。方法对63个定位于3号染色体短臂21-22 D3S1609-D3S1295区域的单拷贝并代表未知基因的EST簇进行网上克隆，在获取基因大片段或全长cDNA序列的基础上，应用半定量逆转录．聚合酶链反应检测63个未知基因在4种鼻咽癌细胞铢、32例鼻咽部低分化鳞状细胞癌组织和16例鼻咽部慢性炎症组织中的表达状况。结果49个未知基因在鼻咽癌组织和鼻咽部慢性炎症组织问的表达水平无显著性差异；8个未知基因在鼻咽癌和鼻咽部慢性炎症组织中均不表达；2个未知基因在鼻咽癌组织中表达明显增强；4个未知基因在鼻咽癌组织中表达明显减弱，其中Hs．27566基因在鼻咽癌细胞和组织中均显著低表达或不表达。结论在染色体3p21-22D3S1609．D3S1295区域构建了63个未知基因在鼻咽癌的表达差异谱：筛选出6个在鼻咽癌组织中差异表达的未知基因。     

鼻咽癌组织RASSFIA基因的表达

目的 探讨RASSFIA基因在鼻咽癌发病过程中的作用。方法 采用逆转录—聚合酶链技术在4种鼻咽癌细胞株、32例鼻咽癌组织和16例正常鼻咽部组织中检测RASSFIA基因的表达。并分析鼻咽癌组织在3p21.3D3S4604徽卫星多态性位点的等位基因杂合性丢失状况。结果 RASSFIA基因在4种鼻咽癌细胞株中低表达，32例鼻咽癌组织的RASSFIA基因表达显著低于16例正常鼻咽部组织(P=0．001)；43．75％(14／32)的鼻咽癌组织在3p21．3D3S4604位点发生了杂合性丢失。鼻咽癌RASSF1A基因表达与性别、年龄、颈部淋巴结转移、TNM临缶床分期、D3S4604位点杂合性丢失和血清EB病毒VCA／IgA抗体滴度无显著相关性，但伴远处转移的鼻咽癌组织的RASSFIA表达显著低于无远处转移的鼻咽癌(P=0．014)。结论 RASSFIA基因的表达下调可能是鼻咽癌发病过程中的晚期事件，3p21区域可能还存在与鼻咽癌发生密切相关的抑瘤基因。     

端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp/tk)基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应.方法 通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达.结果 转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降.hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低.结论 hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性.     

人鼻咽上皮细胞CYP2E1 cDNA克隆及序列分析

目的 :比较正常人胚鼻咽上皮 (HENE)细胞、二亚硝基哌嗪转化的人胚鼻咽上皮 (HENE)所建的细胞系( 742 9)、鼻咽癌细胞系 (HNE1)细胞色素P45 0 2E1(CYP2E1)mRNA表达序列 ,探讨CYP2E1在鼻咽癌变过程中的作用特点。方法 :采用RT PCR方法和DNA重组技术从HENE ,742 9,HNE13种细胞系中克隆的CYP2E1cDNA片段 ,测序并分析其结构改变特征。结果 :①与HENE 2E1比较 ,742 9 2E1存在 846位 (A→T)、90 1位 (A→G)两个点突变 ;HNE1 2E1存在 90 1位 (A→G)一个点突变。②与成人肝来源的CYP2E1CDs序列 (GenBank号为J0 2 843)比较 ,发现HNE1 2E1序列与其完全匹配 ;HENE 2E1序列存在 90 1位 (G→A)点突变。但上述突变对应部位氨基酸序列并无改变。结论 :鼻咽癌发生过程中CYP2E1基因cDNA序列仅存在少数无义突变 ,表现出其高度保守性。     

High frequency loss of heterozygosity on the long arms of chromosomes 13 and 14 in nasopharyngeal carcinoma in Southern China

目的：分析鼻咽癌（NPC）13号染色体长臂（13q）和14号染色体长臂（14q）上21个位点的等位基因杂合子丢失（LOH）,并分析这些位点的LOH与NPC临床病理及EBV感染的关系。方法：用聚合酶链反应（PCR）为基础的微卫星多态性分析技术结合基因扫描和基因绘图技术对60例NPC进行LOH分析。结果：13q染色体发生一个或多个位点LOH频率为78％,高频率LOH（大于30％）位点集中于13q12.3-q14.3和13q32附近。14q染色体发生至少一个位点LOH的频率为80％,高频率丢失位点集中于14q11-q13、1q421-q24和14q32附近。13q31-q32位点的LOH与低滴度血清EBV EA/IgA有关;14q染色体的LOH与NPC细胞的分化差有关。结论：华南地区鼻咽癌在13q和14q染色体发生高频率的LOH,这些缺失区可能存在多个在NPC发生发展过程中起重要作用的肿瘤抑制基因。     

Epstein-Barr病毒RPMS1基因在鼻咽癌组织中的表达及其细胞内定位

目的:了解RPMS1基因在鼻咽癌组织中的表达特点,并明确该基因在上皮细胞中表达的亚细胞区域,为进一步研究其生物学功能提供依据. 方法:提取鼻咽癌组织及各细胞系的DNA和总RNA,以巢式PCR扩增W片段来检测Epstein-Barr病毒(EB病毒)的感染情况,RT-PCR检测RPMS1基因在鼻咽癌组织、细胞株中的表达,并克隆入pEGFP-C2真核表达载体,通过脂质体转染技术将其介导入人胚肾上皮(HEK293)细胞,以激光共聚焦显微镜观察其蛋白表达的亚细胞区域. 结果:除BJAB细胞株外,所有标本中均检测到EB病毒W片段;RPMS1 mRNA在鼻咽癌组织中的表达率为83.3%(45/54),在鼻咽非癌组织中则仅为4%(1/25),二者有显著性差异(P<0.001),鼻咽癌外周血淋巴细胞中未检测到RPMS1表达,RPMS1在SUNE1细胞中的表达高于Raji细胞,但不表达于B95.8细胞;RPMS1可稳定表达于HEK293细胞,其编码蛋白的表达以胞核为主. 结论:EB病毒RPMS1基因在高发区鼻咽癌组织中存在高水平转录,在体外可稳定表达于上皮细胞的胞核,提示RPMS1编码蛋白可能作为核转录因子通过调控细胞增殖相关的信息传递而参与上皮癌变过程.     

人鼻咽癌细胞系中基质金属蛋白酶9的表达及意义

目的 检测MMP9在鼻咽癌细胞株及细胞株裸鼠成瘤瘤块组织中的表达,探讨MMP9的表达与鼻咽癌发生、发展的关系.方法 采用细胞免疫组织化学技术、RT-PCR、Western blot检测鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2和SUNE15株细胞株中MMP9表达;免疫组织化学(SABC 法)检测HNE1和CNE2细胞裸鼠成瘤后瘤块MMP9的表达.结果 5株鼻咽癌细胞株中,免疫组化显示HNE1和SUNE1细胞中MMP9蛋白表达阳性.RT-PCR及Western Blot检测结果显示.HNE1和SUNE1细胞中MMP9 mKNA及蛋白高表达.HNE1和CNE2细胞裸鼠种植成瘤后,5例瘤块中MMP9蛋白均强阳性表达.结论 MMP9在鼻咽癌细胞系中表达阳性,成瘤后表达增强,提示MMP9的表达可能与鼻咽癌侵袭转移有关.     

鼻咽癌易感/抑瘤基因的功能基因组学研究

鼻咽癌组织在染色体3p,9p,6q,11q,13 q和14q等区域存在较高的等位基因不平衡,表明这些区域存在与鼻咽癌相关的抑瘤基因.采用cDNA代表性差异分析等方法成功获得了候选的鼻咽癌易感/仰瘤基因,并进行了基因功能研究.发现:(1)Cx基因的表达增强是由于肿瘤细胞为突破细胞通讯功能的障碍,试图重建细胞间隙连接的一种表达变异;(2)BRD7基因是一个与细胞周期调控密切相关的核转录调控因子;(3)NAG7基因具有双重生物学功能--在抑制低侵袭能力的HNE1细胞增殖的同时,能够增加HNE1和6-10B细胞的侵袭潜能;(4)NGX6可以与Ezrin发生交互作用,参与鼻咽癌转移;(5)SPLUNC1基因的表达下调是鼻咽癌早期预警的分子诊断标志物.这些易感/抑瘤基因的功能基因组学研究为阐明鼻咽癌的发病机制打下了坚实的理论基础.     

Cloning and sequence analysis of human embryonic nasopharyngeal epithelial CYP2E1 cDNA]

OBJECTIVES: To investigate the role of CYP2E1 gene in chemical carcinogen-induced nasopharyngeal carcinogenesis and to provide new evidence about etiology and pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma. METHODS: RT-PCR was used to clone the CYP2E1 gene in human embryonic nasopharyngeal epithelial (HENE) cell, the transformed nasopharyngeal epithelial cell line (7,429), and the nasopharyngeal carcinoma cell line (HNE1). The cloned segments were inserted into pGEM-T Easy vector to sequence by DNA recombination technique. RESULTS: In comparison with HENE-2E1 cDNA, there were two point mutations at positions 846 (A to T) and 901 (A to G) in 7,429-2E1 cDNA as well as only one point mutation at position 901 (A to G) in HNE1-2E1 cDNA. In comparison with human (adult, ethanol-inducible) liver CYP2E1 gene (GenBank NO. J02843), HENE-2E1 cDNA had one point mutation at position 901 (G to A). All these point mutations didn't affect the amino acid sequence. But no base change was found in HNE1-2E1 cDNA. CONCLUSION: There are a few of base substitutions among HENE-2E1 cDNA, 7,429-2E1 cDNA, and HNE1 cDNA sequences. All these point mutations are synonymous mutation. The study reconfirms that the human CYP2E1 gene is relatively well conserved.     

利用mRNA差异显示法分离鼻咽癌中的表达差异cDNA片段

为了分离与鼻咽癌癌变有关的抑瘤基因，应用ｍＲＮＡ差异显示法从中国人鼻咽癌细胞株ＨＯＮＥ１及正常表皮细胞Ｒｈｅｋ中分离有表达差异的ｃＤＮＡ片段。对所分离的两个ｃＤＮＡ片段进一步作了Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析，未能获得预期的信号差异。本文就改善实验提出了建议和设想，为进一步分离鼻咽癌中的抑瘤基因提供了经验。     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

Novel chromosomal alterations detected in primary nasopharyngeal carcinoma by comparative genomic hybridization

Objective　To gain a better understanding of genetic changes in Cantonese nasopharyngeal carcinoma (NPC). Methods　Comparative genomic hybridization (CGH) was performed on 17 primary nasopharyngeal carcinomas. Results　A novel copy number gain an chromosome 4q and loss of chromosome 1p were found at a high frequency (&gt;50%). Conclusions　Current analysis revealed a comprehensive profile of the chromosomal regions showing gain of chromosomes 4q, 12q, and 1q as well as loss of chromosomes 1p, 3p, 11q, 14q, 15q, 13q, Xq, 9q, 10p, 10q, and 16q. Frequently altered loci may encode oncogenes or tumor suppressor genes involved in the development of primary NPC.     

鼻咽癌活检组织中EB病毒膜抗原和EB病毒核酸的分析

应用抗EB病毒膜抗原(EBV/MA)的单克隆抗体检测51例病理确诊的鼻咽癌(NPC)活检标本的冰冻切片,其中49例有EBV/MA的表达。经细胞形态学分析首次发现鼻咽癌癌细胞,增生上皮细胞以及正常鼻咽部上皮细胞都有EBV/MA。以Southern杂交法检查20例鼻咽癌活检组织中EB病毒核酸(EBV/DNA),结果证实鼻咽癌组织中不仅有EB病毒核酸的重复序列W片段,还有与细胞转化有关的K片段的序列存在。进一步表明EB病毒在鼻咽癌的发生中并非“过客”,很可能是其病原因素之一。     

蛋白质组学筛选抑癌基因CCDC19在鼻咽癌中的调控蛋白

目的本研究利用蛋白质组学筛选抑癌候选基因CCDC19在鼻咽癌中可能调控蛋白。方法提取CCDC19稳定高表达的鼻咽癌3D8和对照鼻咽癌C6细胞蛋白,并采用双向凝胶电泳(2D-PAGE)技术进行有效分离,图像扫描后获得高分辨率的2D-PAGE图谱。选用差异蛋白质组学技术筛选差异蛋白位点,然后用肽质量指纹谱(peptide mass fingerprinting,PMF)和数据库检索技术给予鉴定。荧光定量PCR和Western blot验证差异基因表达水平。结果质谱分析显示,FASN、CTSD和PGK1在CCDC19过表达的3D8细胞中表达下调,分别为-3.28、-1.64和-6.97倍。荧光定量PCR在mRNA水平验证了FASN、CTSD和PGK1以及Western blot在蛋白水平验证CTSD蛋白在3D8细胞中表达下调。结论 FASN、CTSD和PGK1可能是CCDC19在鼻咽癌中调控的靶基因。