假丝酵母SSR-PCR反应体系的优化

目的建立假丝酵母SSR-PCR反应体系,确立最佳反应条件,为将该技术用于临床假丝酵母感染的快速鉴定奠定基础。方法根据引物Tm值设立退火温度梯度,确定适宜的退火温度。利用正交实验,对影响SSR-PCR反应体系的Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物等4种主要因素,进行优化。结果引物最适退火温度为51℃。假丝酵母最佳的SSR-PCR反应体系为：在25μl的PCR反应体系中加入Taq DNA聚合酶1.0 U、模板DNA为25 ng、dNTP为0.15 mmol.L-1、引物为0.5μmol.L-1。结论采用正交实验优化的SSR-PCR反应体系,操作简便,电泳条带清晰,多态性好,重复性强,可为进一步建立临床假丝酵母感染的快速鉴定提供借鉴。     

分子信标荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的反应体系优化方法对比研究

目的建立分子信标荧光定量PCR检测结核分技杆菌的最佳反应体系,探讨影响分子信标荧光定量PCR扩增结果的多个因素。方法利用单因素法和正交实验法,从MgCl2,引物,分子信标探针,dNTP,Taq DNA聚合酶5种因素对分子信标荧光定量PCR反应体系进行优化,并对这两种方法所得的最优体系进行比较。结果单因素法得到的最优反应体系（25μl）为：4mmol／L MgCl2,上、下游引物各0．3μmol／L,分子信标探针0．1μmol／L,200μmol／L dNTP,2U Taq DNA;正交法得到的最优反应体系（25μl）为：6mmol／L MgCl2,上、下游引物各0．2μmol／L,分子信标探针0．1μmol／L,100μmol／L dNTP,3U Taq DNA聚合酶,正交法得到的最优反应体系的荧光定量PCR扩增曲线形状更好,Q值较小,△Rn较大。结论采用正交法得到的荧光定量PCR反应体系优于单因素法,进行实时荧光定量PCR反应体系优化时,正交实验设计是一条科学、可靠、高效、快捷的途径。     

真菌DNA提取方法的建立和比较

目的:DNA的提取效率,尤其是DNA的纯度严重影响实验结果,同一标本采用不同方法或不同标本采用相同方法提取DNA,其纯度和提取率有很大差异。以丝状真菌为材料.进行DNA提取.对真菌DNA的提取方法进行优化,探讨其最佳DNA提取方法方法:实验于2004-06/2006-12在吉林大学基础医学院真菌实验室进行以临床常见致病真菌标本为材料,采用玻璃珠-盐析法、CTAB法、Gene TLE~(TM)法3种不同方法提取DNA,通过琼脂糖凝胶电泳比较不同方法提取DNA的效率。结果:同等菌体量下,A_(260)和A_(280)的比值采用Gene TLE~(TM)法获得的样品最高,表明其蛋白质含量相对最少.3种提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图都在相应的多重PCR体系中扩增出目的片段,Gene TLE~(TM)DNA抽提法带型最清楚、明亮。结论:Gene TLE~(TM)法提取DNA效率高、质量好,操作简单.适于DNA的提取。     

突变敏感性分子开关检测线粒体DNA A1555G位点的条件优化

目的对高保真酶介导的突变敏感性分子开关技术检测线粒体DNA(mt DNA)A1555G位点条件进行优化。方法利用3'硫代磷酸化修饰的突变型引物和野生型引物作为下游引物,在其上游设计一条公共引物分别构成突变引物对和野生引物对,以构建好的包含mt DNA A1555G位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,对PCR体系中的退火温度、引物浓度、模板浓度等条件优化,通过凝胶成像系统对其PCR结果进行分析确定最佳反应条件。结果分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳PCR条件:退火温度为61.0℃,引物浓度为0.6μmol/L,检测模板浓度为103~106copies/μL。结论确定了分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳反应条件,为该技术在线粒体DNA的突变筛查中的应用提供依据。     

KRAS基因突变高分辨率熔解曲线检测技术参数的优化

目的建立KRAS基因突变高分辨率熔解曲线分析法(high resolution melting,HRM)检测方法,确立最佳反应体系和反应条件,为将此技术用于临床基因突变的快速检测奠定基础。方法根据引物Tm值设立退火温度梯度,确定适宜的退火温度。利用正交实验,对影响实时荧光定量PCR(qPCR)-HRM反应体系的模板DNA、Mg2+、引物等3种主要因素进行优化。通过对SW480和MDA-MB-231细胞基因组DNA进行HRM分析检测突变,并直接测序验证,观察反应体系和反应条件的可行性。结果引物最适退火温度为60.8℃。KRAS基因突变qPCR-HRM最佳反应体系为:20μl qPCR-HRM反应体系中,引物浓度为0.5μmol/L,Mg2+为2.5mmol/L,模板DNA为40ng。优化的qPCR-HRM反应体系和反应条件能检测基因突变,和直接测序结果一致。结论采用正交实验优化的qPCR-HRM反应体系,操作简便,电泳条带清晰,熔解曲线峰型单一,特异性好,结果准确可靠,可为进一步建立HRM技术检测基因突变的临床应用提供借鉴。     

乙型肝炎病毒全长基因组的扩增

目的:探讨扩增乙肝病毒全长基因组合适的PCR反应条件。方法:设计针对负链5′末端引物,PCR一步法扩增乙肝病毒全长基因。改变PCR反应条件,决定最佳退火温度和最佳引物浓度,并观察不同乙肝病毒DNA模板量对PCR扩增效率的影响。结果:最佳退火温度为68℃,最佳引物浓度为0.5μmol/L,模板量在150拷贝以上能扩增出乙肝病毒全长基因,但模板量达到105拷贝抑制扩增效率。结论:退火温度为68℃、引物浓度为0.5μmol/L、乙肝病毒DNA模板量在150～105拷贝为乙肝病毒全长基因扩增的合适PCR反应条件。     

随机扩增多态性DNA反应体系优化的研究

目的 筛选出反应体系的最佳优化方案用于金黄色葡萄球菌的随机扩增多态性DNA分析(RAPD).方法 应用单因素设计进行RAPD反应体系的优化.结果 通过优化后得出稳定性良好的优化反应体系(关键成分浓度)为模板6 μL引物0.5 μmol/L和镁离子1.5 mmol/L.结论 采用单因素设计优化RAPD反应体系,可获得较稳定、可靠的实验结果.     

肺癌组织中puma基因第三外显子扩增的实验条件研究及应用

目的 优化肺癌组织中puma基因第三外显子(GC含量＞80%)PCR扩增的最适实验条件,应用此条件对34例肺癌组织中puma第三外显子进行突变研究,探讨其与肺癌发生发展的相关性.方法 通过改变PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,确定puma基因第三外显子PCR扩增体系最适浓度和反应条件.应用优化后的反应体系扩增34例肺癌puma第三外显子,测序寻找突变.结果 PCR反应体系为dNTP 200 μmol/L, 增强体系MgSO4 2.0 mmol/L,引物500 nmol/L,Taq DNA聚合酶0.1 U/μl,模板量不低于4 000 ng,10×增强体系缓冲液5 μl,增强液5 μl,总体积50 μl.反应条件为95℃预变性5 min,95℃ 45 s,64℃ 45 s,72℃ 45 s,循环33次,最后72℃延伸5 min.应用以上最适条件,成功扩增34例肺癌患者puma基因第三外显子,经测序均无突变.结论 肺癌患者puma基因第三外显子突变与肺癌的发生发展及肺癌的病理类型之间无明显相关.     

高分辨率熔解曲线法检测CBS基因SNP的技术优化

目的：探索高分辨率熔解曲线法（highresolutionmelting,HRM）检测胱硫醚β-合酶（CBS）基因SNP位点所需的最佳反应体系和条件,建立快速高效的对CBS基因分型的方法。方法通过普通PCR初步确立引物的退火温度范围,在实时荧光定量PCR（qPCR）-HRM反应中调整确定最佳退火温度。对影响qPCR-HRM的因素包括反应程序、模板DNA、MgCl2再分别进行优化,确立最佳反应体系和反应条件,对在此基础上得出的基因分型结果通过测序验证其准确性,从而建立系统的HRM检测CBS基因SNP的方法。结果HRM检测CBS基因该片段最佳退火温度为62℃,qPCR-HRM最佳反应体系为20μl,引物浓度为0．2μmol/L,Mg2＋为2．5μmol/L,模板DNA为60ng。在优化的体系条件下筛选出的突变型样本经测序验证与实验结果一致。结论HRM可以作为检测SNP准确、经济、高效的方法。     

实时荧光定量聚合酶链反应技术检测解脲脲原体生物群的研究

目的建立解脲脲原体生物群Taqman荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法根据解脲脲原体生物群MBA基因差异,分别设计并合成引物和探针。优化引物和探针浓度及试验条件,并进行试验的灵敏度、特异性和重复性评价。结果生物1群最适缓冲体系:25μL反应体系中包含2.5U Taq酶,Mg2+2.5mmol/L,上、下游引物0.1pmol/L,TaqMan探针0.2pmol/L,模板DNA 2μL。生物2群最适缓冲体系:25μL反应体系中包含2.5UTaq酶,Mg2+2.5mmol/L,上、下游引物0.2pmol/L,TaqMan探针0.3pmol/L,模板DNA2μL。PCR反应条件:95℃2min;95℃10s;55℃(检测荧光信号)20s,循环40次。该方法线性范围在1.0×102～8 copy/mL之间,检测限达到100～200copy/mL,特异性达到100%,CV值为2.5%。结论 本研究建立的TaqMan荧光PCR检测解脲脲原体生物群线性范围宽、灵敏度高、特异性及重复性好,能够快速进行解脲脲原体生物群检测。     

IgH重排的实时定量PCR检测及反应参数研究

为了探讨以通用引物应用PCR技术扩增克隆性免疫球蛋白重链基因（IgH）重排的最佳实验条件及SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测该基因的可行性，以通用引物对克隆性IgH重排进行扩增，对影响PCR扩增的退火温度、引物浓度、Taq酶用量、dNTP浓度、镁离子浓度、循环次数等实验因素进行了系统研究，找出最佳反应参数。并以通用引物进行了SYBR greenⅠ实时定量PCR对IgH重排基因的检测，测定了该法检测IgH重排基因的敏感性。结果表明：最佳退火温度为60℃，最佳引物浓度为0．8μmol／L，0．5U的Taq酶量效果满意，最适dNTP浓度为100μmol／L，最适镁离子浓度为3．0mmol／L，最佳循环次数为40次。SYBR GreenⅠ实时定量PCR可以实现对克隆性IgH重排的扩增和荧光信号的检测分析，其对IgH重排基因检测的敏感性为10^4／ml。结论：确定了应用PCR技术检测克隆性IgH重排的最适反应条件，实现了用通用引物对克隆性IgH重排稳定、特异的扩增，初步实现了以通用引物和应用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR对IgH重排的检测。     

引物二聚体在目的基因克隆中的应用初探

目的 根据引物二聚体形成原理，建立一种新的克隆目的基因的方法。方法 人工合成两条或两条以上3′端互补配对的寡核苷酸链，寡核苷酸链、Taq酶和dNTP按一定比例混合，PCR扩增延伸，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。结果 PCR产物经电泳鉴定，可见一条清晰的特异条带。结论 此方法能合成500bp以下的短片段目的基因。     

随机扩增多态性DNA分型法用于肠球菌基因分型

目的 研究适于本实验室肠球菌随机扩增多态性NDA分型法（RAPD）分型的最佳实验条件。方法 在改变引物、模板、Mg^2 浓度、Taq多聚酶用量及循环参数等不同条件下,采用RAPD法对肠球菌进行基因分型。结果 经优化后的RAPD方法能很好地对肠球菌进行分子生物学分型。结论 RAPD是从分子水平对微生物感染进行病原学,流行病学研究较理想的一种经济、快速、可靠的基因分型方法。     

基因突变敏感性分子开关检测β地中海贫血基因突变

目的:采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测β地中海贫血。方法:首先提取正常人血液基因组DNA,根据已知β珠蛋白基因热点突变CD41-42、IVS2-654区域序列,分别设计突变序列扩增引物,利用低保真酶进行引物延伸反应,将其PCR产物克隆到pMD19-T载体,得到β地中海贫血常见的两个突变位点的基因突变克隆:CD41-42、IVS2-654,然后以这两个突变位点为检测靶点,分别设计3′末端与野生型基因位点或突变基因位点配对的引物,硫化磷酸修饰3′末端并偶联高保真DNA聚合酶构成的基因突变敏感性分子开关,对含有相应突变的阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应,并通过凝胶成像系统对其进行分析。结果:当引物与模板完全配对时,引物被延伸,有PCR产物;当引物与模板不完全配对时,引物不被延伸,无PCR产物。结论:高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关能准确、快速筛查β地中海贫血CD41-42、IVS2-654突变,提示其在单基因遗传病的诊断中具有广阔的应用前景。     

聚合酶活性信号检测地高辛方法的建立

目的建立以聚合酶活性信号为检测对象的反应体系,使用具有高灵敏度和精密度的均相分析方法,实现地高辛血药浓度的自动化检测。方法设计特异的DNA模板及其引物,引物上特定位点连接有Digoxingenin-11-dUTP(Dxin),使得样品中地高辛(Dig)与引物上的Dxin在抗Dig抗体存在时形成竞争反应,影响DNA聚合酶与引物结合,从而根据合成的双链量即可检测出样品Dig浓度。结果选择D2p作为Dxin在引物上的结合位点,17nmol/L模板及引物浓度、33nmol/L的抗Dig抗体浓度。试剂可报告范围为0.3~39.0ng/mL,CV10%。结论聚合酶活性信号检测技术可以实现高灵敏度的地高辛均相分析。     

Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach

Considerable time and effort can be saved by simultaneously amplifying multiple sequences in a single reaction, a process referred to as multiplex polymerase chain reaction (PCR). Multiplex PCR requires that primers lead to amplification of unique regions of DNA, both in individual pairs and in combinations of many primers, under a single set of reaction conditions. In addition, methods must be available for the analysis of each individual amplification product from the mixture of all the products. Multiplex PCR is becoming a rapid and convenient screening assay in both the clinical and the research laboratory. The development of an efficient multiplex PCR usually requires strategic planning and multiple attempts to optimize reaction conditions. For a successful multiplex PCR assay, the relative concentration of the primers, concentration of the PCR buffer, balance between the magnesium chloride and deoxynucleotide concentrations, cycling temperatures, and amount of template DNA and Taq DNA polymerase are important. An optimal combination of annealing temperature and buffer concentration is essential in multiplex PCR to obtain highly specific amplification products. Magnesium chloride concentration needs only to be proportional to the amount of dNTP, while adjusting primer concentration for each target sequence is also essential. The list of various factors that can influence the reaction is by no means complete. Optimization of the parameters discussed in the present review should provide a practical approach toward resolving the common problems encountered in multiplex PCR (such as spurious amplification products, uneven or no amplification of some target sequences, and difficulties in reproducing some results). Thorough evaluation and validation of new multiplex PCR procedures is essential. The sensitivity and specificity must be thoroughly evaluated using standardized purified nucleic acids. Where available, full use should be made of external and internal quality controls, which must be rigorously applied. As the number of microbial agents detectable by PCR increases, it will become highly desirable for practical purposes to achieve simultaneous detection of multiple agents that cause similar or identical clinical syndromes and/or share similar epidemiological features.