高分辨率熔解曲线法检测CBS基因SNP的技术优化

目的：探索高分辨率熔解曲线法（highresolutionmelting,HRM）检测胱硫醚β-合酶（CBS）基因SNP位点所需的最佳反应体系和条件,建立快速高效的对CBS基因分型的方法。方法通过普通PCR初步确立引物的退火温度范围,在实时荧光定量PCR（qPCR）-HRM反应中调整确定最佳退火温度。对影响qPCR-HRM的因素包括反应程序、模板DNA、MgCl2再分别进行优化,确立最佳反应体系和反应条件,对在此基础上得出的基因分型结果通过测序验证其准确性,从而建立系统的HRM检测CBS基因SNP的方法。结果HRM检测CBS基因该片段最佳退火温度为62℃,qPCR-HRM最佳反应体系为20μl,引物浓度为0．2μmol/L,Mg2＋为2．5μmol/L,模板DNA为60ng。在优化的体系条件下筛选出的突变型样本经测序验证与实验结果一致。结论HRM可以作为检测SNP准确、经济、高效的方法。     

突变敏感性分子开关检测线粒体DNA A1555G位点的条件优化

目的对高保真酶介导的突变敏感性分子开关技术检测线粒体DNA(mt DNA)A1555G位点条件进行优化。方法利用3'硫代磷酸化修饰的突变型引物和野生型引物作为下游引物,在其上游设计一条公共引物分别构成突变引物对和野生引物对,以构建好的包含mt DNA A1555G位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,对PCR体系中的退火温度、引物浓度、模板浓度等条件优化,通过凝胶成像系统对其PCR结果进行分析确定最佳反应条件。结果分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳PCR条件:退火温度为61.0℃,引物浓度为0.6μmol/L,检测模板浓度为103~106copies/μL。结论确定了分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳反应条件,为该技术在线粒体DNA的突变筛查中的应用提供依据。     

高分辨率熔解曲线分析法检测非小细胞肺癌KRAS和BRAF基因突变

目的探讨高分辨率熔解曲线分析(HRM)法检测非小细胞肺癌(NSCLC)中KRAS和BRAF基因突变用于临床检测的可行性。方法用HRM法检测64例NSCLC患者KRAS基因第2外显子和BRAF基因第15外显子的突变情况,用直接测序法对结果进行验证。结果 HRM法检测结果表明有9例NSCLC患者发生KRAS基因突变(14.06%)、4例发生BRAF基因突变(6.25%),直接测序法证实两法的结果完全一致;共检测出4种KRAS基因突变类型,G12C(GGT>TGT)的突变率最高(44.4%),BRAF基因突变型均为V600E。结论用HRM法检测临床样本KRAS和BRAF基因突变,具有操作简便、结果准确、成本低的优点,适用于临床检测。     

假丝酵母SSR-PCR反应体系的优化

目的建立假丝酵母SSR-PCR反应体系,确立最佳反应条件,为将该技术用于临床假丝酵母感染的快速鉴定奠定基础。方法根据引物Tm值设立退火温度梯度,确定适宜的退火温度。利用正交实验,对影响SSR-PCR反应体系的Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物等4种主要因素,进行优化。结果引物最适退火温度为51℃。假丝酵母最佳的SSR-PCR反应体系为：在25μl的PCR反应体系中加入Taq DNA聚合酶1.0 U、模板DNA为25 ng、dNTP为0.15 mmol.L-1、引物为0.5μmol.L-1。结论采用正交实验优化的SSR-PCR反应体系,操作简便,电泳条带清晰,多态性好,重复性强,可为进一步建立临床假丝酵母感染的快速鉴定提供借鉴。     

HRM法检测结直肠癌患者循环DNA中KRAS和EGFR基因突变

摘要:目的：探讨高分辨率熔解曲线(HRM) 法检测结直肠癌患者循环DNA中KRAS和EGFR基因突变的可行性。 方法：用HRM法检测70例结直肠癌患者KRAS基因2号和3号外显子以及EGFR基因19和21号外显子的突变情况,用直接测序法验证结果的准确性。 结果：70 例结直肠癌患者血液标本经HRM法、直接测序法分别检测到18例(25.7%)和17例(24.3%)KRAS基因2号外显子突变;均检测到3例EGFR基因19号外显子突变(4.3%);两法均未检测到3号外显子和21号外显子突变。HRM检测与直接测序法结果符合率为99.6% (279/280)。 结论：HRM法检测结直肠癌患者血样本KRAS和EGFR基因突变,具有准确度高、操作简单、检测成本低等优点,适合在临床推广应用。     

乙型肝炎病毒全长基因组的扩增

目的:探讨扩增乙肝病毒全长基因组合适的PCR反应条件。方法:设计针对负链5′末端引物,PCR一步法扩增乙肝病毒全长基因。改变PCR反应条件,决定最佳退火温度和最佳引物浓度,并观察不同乙肝病毒DNA模板量对PCR扩增效率的影响。结果:最佳退火温度为68℃,最佳引物浓度为0.5μmol/L,模板量在150拷贝以上能扩增出乙肝病毒全长基因,但模板量达到105拷贝抑制扩增效率。结论:退火温度为68℃、引物浓度为0.5μmol/L、乙肝病毒DNA模板量在150～105拷贝为乙肝病毒全长基因扩增的合适PCR反应条件。     

实时荧光定量聚合酶链反应技术检测解脲脲原体生物群的研究

目的建立解脲脲原体生物群Taqman荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法根据解脲脲原体生物群MBA基因差异,分别设计并合成引物和探针。优化引物和探针浓度及试验条件,并进行试验的灵敏度、特异性和重复性评价。结果生物1群最适缓冲体系:25μL反应体系中包含2.5U Taq酶,Mg2+2.5mmol/L,上、下游引物0.1pmol/L,TaqMan探针0.2pmol/L,模板DNA 2μL。生物2群最适缓冲体系:25μL反应体系中包含2.5UTaq酶,Mg2+2.5mmol/L,上、下游引物0.2pmol/L,TaqMan探针0.3pmol/L,模板DNA2μL。PCR反应条件:95℃2min;95℃10s;55℃(检测荧光信号)20s,循环40次。该方法线性范围在1.0×102～8 copy/mL之间,检测限达到100～200copy/mL,特异性达到100%,CV值为2.5%。结论 本研究建立的TaqMan荧光PCR检测解脲脲原体生物群线性范围宽、灵敏度高、特异性及重复性好,能够快速进行解脲脲原体生物群检测。     

病原真菌DNA提取方法及简单重复序列聚合酶链反应体系的优化

背景:真菌DNA的提取在真菌基因工程以及分子生物学研究中占有重要地位.DNA的提取效率,尤其是DNA的质量严重影响实验结果.目的:建立提取病原真菌基因组DNA的方法,探讨简单重复序列-PCR反应体系中各成分的最佳组合.设计、时间及地点:DNA提取方法对照分析及正交实验,于2004-06,2006-12在吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室真菌学研究室进行.材料:将接种临床标本的马铃薯葡萄糖液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、酵母蛋白胨液体培养基28℃培养3-7 d后,选取可疑菌落进行分离、纯化.方法:比较玻璃珠-盐析法、CTAB法、GeneTLE~(TM)抽提法3种不同DNA提取方法对菌体DNA质量的影响;利用正交设计,选择Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物4个因素,在3个水平上根据L9(3~4)正交表进行试验,对真菌简单重复序列-PCR(SSR-PCR)体系进行优化分析;并通过PCR选择适宜的退火温度及循环次数.主要观察指标:根据扩增获得带型的多态性和特异性,确定最佳反应体系.结果:Gene TLE~(TM)抽提法全部在相应的PCR体系中扩增出目的片段,且带型清楚度、明亮度优于其余两种方法.SSR-PCR反应体系正交试验结果显示,根据尺值大小确定因素显著性顺序为模板DNA(2.67)>Taq DNA聚合酶(2.00)>dNTP(0.67)>引物(0.33);根据ki值大小确定各因素优化水平组合为:模板DNA 30 mg/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP150 μmol/L,引物0.5 μmol/L.但由于引物作为影响因素的R值小,是非显著因素,因此引物取A水平即0.25 μmol/L.反应条件以53℃退火温度、35个循环次数为最佳.结论:Gene TLE~(TM)提取法提取DNA的效率更高、操作步骤快速简单.根据正交试验的优化结果,SSR-PCR最佳反应体系为模板DNA 30 mg/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP 150 μmol/L,引物0.25 μmol/L.反应条件以53℃退火温度、35个循环次数为最佳.     

HRM法检测结直肠癌组织KRAS基因密码子12和13点突变

目的 建立HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突变的方法 .方法 采用HRM法对含不同比例KRAS基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况,并与直接测序法的结果 进行比较分析.结果 HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解,即可获得检测结果 .HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变,其检测灵敏度达10%.HRM法从60份大肠癌患者组织标本中,检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%);直接测序法检出15份(25.0%)突变,2份未检出KRAS基因突变.HRM法检测的敏感度为100%(15/15),特异度为96%(43/45).结论 HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时,具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染等优点,完全符合临床个体化治疗的要求,值得推广.     

胶质瘤表皮生长因子受体基因突变检测方法的对比研究

目的分析普通聚合酶链式反应(PCR)联合直接测序法与实时聚合酶链式反应-高分辨率融解(qPCR-HRM)曲线分析技术对胶质瘤表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的检测效果。方法用普通PCR联合直接测序法与qPCR-HRM曲线分析技术检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,检测结果比较采用χ2检验。结果普通PCR联合直接测序法与qPCR-HRM曲线分析技术对胶质瘤患者肿瘤组织EGFR突变的检测结果一致性较高,达90.91%,两者间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 qPCR-HRM曲线分析技术操作较普通PCR联合直接测序法简便,实验时间较短,降低了交叉污染的风险,通过HRM曲线分析检测结果可以实现对样品基因型的判定。     

Using newly developed multiplex polymerase chain reaction and melting curve analysis for detection and discrimination of β-lactamases in Escherichia coli isolates from intensive care patients

A total of 78 bacterial strains with known β-lactamases were used to optimize a rapid detection system consisting of multiplex polymerase chain reaction and melting curve analysis to amplify and identify blaTEM, blaSHV, and blaCTX-M genes in a single reaction. Additionally, to evaluate the applicability of this method, 32 clinical isolates of Escherichia coli displaying an extended-spectrum β-lactamase phenotype from patients hospitalized at intensive care units were tested. Results were analyzed by the Rotor-Gene operating software and Rotor-Gene ScreenClust HRM Software. The individual melting curves differed by a temperature shift or curve shape, according to the presence of β-lactamase genes. With the use of this method and direct sequencing, blaCTX-M-15-like was identified as the most prevalent β-lactamase gene. In conclusion, this novel detection system seems to be a suitable tool for rapid detection of present β-lactamase genes and their characterization.     

高分辨熔解曲线法检测骨髓增殖性肿瘤患者 JAK2V617F 基因突变简

本研究探讨高分辨率熔解曲线（High resolution melting,HRM）法检测骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者JAK2V617F基因突变的可行性.随机抽取29份2008年1月至2011年1月确诊为MPN患者的骨髓标本,应用HRM法检测JAK2V617F基因突变情况,并与等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）和测序法的检测结果比较分析.结果表明,经HRM法检测,在29份MPN患者骨髓标本中检出JAK2 V617F突变阳性11例,突变率为37.9％;与基因测序法比较,结果完全一致,符合率100％.而AS-PCR法与测序法比较,Kappa=0.179,P=0.316,一致性强度较差.结论：HRM方法具有简便、快速、特异性高等优点,可作为临床JAK2V617F基因突变的优选方法.     

qPCR-HRM曲线分析技术与普通PCR加直接测序法检测胶质瘤EGFR突变比较

目的:比较实时聚合酶链反应-高分辨率融解(qPCR-HRM)曲线分析技术和普通PCR法加直接测序法检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,探讨适用于临床的EGFR基因突变检测方法,为胶质瘤患者术后放射、化学治疗及预后判断研究提供可靠的依据。方法:用普通PCR加测序法与qPCR-HRM曲线分析技术检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,检测结果比较采用卡方检验。结果:两种方法检测EGFR外显子19基因突变结果比较差异无统计学意义,且qPCR-HRM曲线分析技术比直接测序法更快捷、灵敏。结论:与直接测序法相比,qPCR-HRM曲线分析技术可能更适用于临床检测胶质瘤患者标本EGFR突变性质。     

KRAS and BRAF mutation analysis in routine molecular diagnostics: comparison of three testing methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tumor-derived DNA

Accurate mutation detection assays are strongly needed for use in routine molecular pathology analyses to aid in the selection of patients with cancer for targeted therapy. The high-resolution melting (HRM) assay is an ideal prescreening tool, and SNaPshot analysis offers a straightforward genotyping system. Our present study was determined to compare these mutation testing methods on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tumor-derived DNA. We compared the performance of HRM, followed by cycle sequencing (HRM-sequencing); multiplex PCR assay, followed by SNaPshot analysis (multiplex mutation assay); and a successor assay using HRM, followed by SNaPshot (HRM-SNaPshot) for mutation analysis of both KRAS (codon 12/13/61) and BRAF (codon 600/601). In a series of 195 FFPE-derived DNA specimens, a high genotypic concordance between HRM-sequencing and multiplex mutation assay was found (κ, 0.98; 95% CI, 0.94 to 1), underlining the potential of a combined HRM-SNaPshot approach. In reconstruction experiments, the analytical sensitivity of HRM-SNaPshot was twofold to fourfold higher than HRM-sequencing and multiplex mutation assay, respectively. In addition, HRM-SNaPshot had a good performance rate (99%) on FFPE tumor-derived DNA, and mutation detection was highly concordant with the predecessor assays (κ for both, 0.98). The occurrence of BRAF and KRAS mutations is mutually exclusive. HRM-SNaPshot is an attractive method for mutation analysis in pathology, given its good performance rate on FFPE-derived DNA, high analytical sensitivity, and prescreening approach.