鸦胆子油乳对体外培养肺癌A549细胞株增殖、迁移能力及血管新生指标影响

目的:研究鸦胆子油乳对体外培养肺癌A549细胞株增殖、迁移能力及血管新生指标的影响.方法:培养肺癌A549细胞株,分别用不合药物的DMEM处理和1 mg/mL鸦胆子油乳处理,采用荧光定量PCR和western-blotting的方法检测细胞中Survivin、Bcl-2、Bax、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管黏附分子-1(VCAM-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的mRNA含量和蛋白含量.结果:(1)增殖能力:处理组Survivin、Bcl-2的mRNA和蛋白含量低于对照组,Bax的mRNA和蛋白含量高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);(2)迁移能力:处理组ICAM-1、VCAM-1、MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白含量低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);(3)血管新生能力:处理组细胞VEGF、HIF-1α、TGF-β1的mRNA和蛋白含量低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:鸦胆子油乳处理能够降低肺癌细胞株的增殖和迁移能力、抑制血管新生过程,能够成为治疗肺癌的理想药物.     

TNF-α基因siRNA真核表达载体的构建及其对A549细胞TNF-α和TGF-β1表达的影响

目的:构建靶向肿瘤坏死因子α（TNF-α）基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,观察其对人肺腺癌A549细胞中TNF-α和转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响。方法:依据GenBank中人TNF-α（NM₀00594）序列和siRNA靶序列设计原则,设计并合成一对针对TNF-α的特异性序列（siTNF-α）和一对无关序列（siCon）。退火合成DNA双链,再分别重组入pRNAT-U6.1载体,经过PCR和DNA测序鉴定。将构建好的重组载体pRNAT-U6.1-siTNF-α、pRNAT-U6.1-siCon及空载体pRNAT-U6.1用脂质体介导转染A549细胞株,分别采用RealtimePCR和Westernblot方法检测细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平。结果:PCR和DNA测序鉴定证实载体构建成功;转染pRNAT-U6.1-siTNF-α的A549细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均低于其他3组（FmRNA=478.663,4.081;F蛋白=123.420,6.312,P均<0.05）。结论:成功构建了靶向TNF-α基因的siRNA真核表达载体,该载体能够有效沉默A549细胞中TNF-α的表达,TGF-β1基因表达亦受到抑制。     

干扰素α通过IFI16和P21影响人血管内皮细胞凋亡

目的 观察干扰素α(IFN-α)对人血管内皮细胞(VECs)凋亡的影响并了解其部分机制.方法 应用IFN-α和转染IFN诱导蛋白16基因(IFI16)的siRNA瞬时干预体外培养的VECs,以转染非特异性siRNA设为对照组,RT-PCR法检测IFI16及P21 mRNA表达,Western blot检测IFI16及P21蛋白表达,流式细胞仪Annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡情况.结果 与对照组比较,IFN-α组IFI16 mRNA和蛋白表达上调(P＜0.05),细胞凋亡增多(P＜0.05),伴P21 mRNA和蛋白表达增多(P＜0.05);IFN-α干预后再转染IFI16 siRNA,IFI16 mRNA和蛋白表达下调(P＜0.05),细胞凋亡减少(P＜0.05),P21 mRNA和蛋白表达减少(P＜0.05).结论 IFI16及P21参与IFN-α诱导VECs凋亡过程的调控.     

siRNA干扰Pokemon基因影响A549细胞增殖的实验研究

目的 研究siRNA干扰Pokemon基因对肺腺癌A549细胞增殖抑制效应的变化.方法 专业设计合成3条针对Pokemon的siRNA,分别转染A549细胞后,RT-PCR检测转录水平Pokemon mRNA表达的变化,筛选出其中最高效的1条siRNA;用MTT法检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞增殖的抑制作用;流式细胞技术检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞凋亡的影响.结果 3条siRNA均成功转染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞呈圆绿色.RT-PCR结果显示有2条siRNA使细胞中Pokemon的mRNA表达降低(P＜0.05).MTT法结果显示siRNA干扰Pokemon后对A549细胞增殖有抑制作用(P＜0.05),其中48 h抑制效率达(24.14±1.39)％.流式细胞技术检测结果显示该siRNA干扰Pokemon可增加A549细胞的凋亡,凋亡率为14.05％.结论 应用RNA干扰Pokemon基因能够抑制A549细胞的增殖,促进A549细胞的凋亡.Pokemon基因有可能成为肺癌治疗中的一个新靶点.     

进展性大鼠肝纤维化组织中整合素αVβ3受体和血小板内皮细胞黏附分子的表达

目的 探讨整合素αVβ3和血小板内皮细胞黏附分子(CD31)表达与肝纤维化进展和间质重建的关系.方法 硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射和胆总管结扎(BDL)建立两种大鼠肝纤维化模型,TAA组和BDL组每组8只,分别在第3、9周末和第2、4周末取材.肝组织切片天狼猩红染色和计算机图像分析,整合素αVβ3、CD31免疫化学和荧光染色.整合素αVβ3与α-平滑肌肌动蛋白(SMA)荧光染色双重染色及激光共聚焦观察.实时定量PCR和Western印迹分析肝组织中整合素αVβ3、CD31的相对定量表达.结果 肝纤维化中αVβ3表达范围扩大并与α-SMA表达部位一致,CD31在肝血窦、扩大的汇管区和纤维隔表达明显增加,伴有血管新生.模型组和对照组比较肝组织中αVβ3、CD31表达水平差异均有统计学意义(TAA组F=28.66、P＜0.01,F=19.62、P＜0.01和BDL组F=32.60、P＜0.01,F=42.36、P＜0.01).TAA 3周和9周整合素αVβ3和CD31 mRNA的△Ct值分别为5.70±0.25、5.50±0.18和4.40±0.25、4.00±0.18.BDL组1周和4周分别为5.60±0.24、5.30±0.14和4.20±30.16、3.80±0.23,表达增加和纤维化进展一致.结论 肝纤维化进展中整合素αVβ3表达水平增加与星状细胞活化和血管新生有关,并与间质重建程度平行.     

整合素αVβ3在人胆管癌组织中的表达及其临床意义

目的研究整合素αVβ3在人胆管癌组织中的表达及其与胆管癌的临床病理关系.方法采用免疫组织化学方法检测47例人胆管癌组织及正常癌旁胆管组织中整合素αVβ3的表达.结果整合素αVβ3表达于人胆管癌细胞及胆管癌组织中的新生血管细胞,47例标本均呈阳性表达,其表达强度与是否伴有肿瘤转移有显著差异(P<0.05),而与性别、癌组织分化程度无关.结论整合素αVβ3可能在胆管癌细胞的恶性生物学行为中具有重要的作用,检测整合素αVβ3表达可以作为胆管癌预后判断的依据之一.     

整合素αVβ5在卵巢上皮性癌中的表达及临床意义

目的：探讨整合素αVβ5在卵巢上皮性癌中的表达及其与微血管密度(microvessel density,MVD)和临床病理特征的关系。方法：采用免疫组织化学PV两步法,分别测定15例正常卵巢组织、15例良性卵巢上皮性肿瘤、10例交界性卵巢上皮性肿瘤、57例卵巢上皮性癌组织中整合素αVβ5的表达及MVD。结果：(1)卵巢上皮性癌中整合素αVβ5的阳性率及MVD值高于正常卵巢组织、良性卵巢上皮性肿瘤和交界性卵巢上皮性肿瘤(P＜0.01);(2)卵巢上皮性癌中整合素αVβ5的阳性率及MVD值随临床分期、组织分级的升高而增加(P＜0.05);(3)卵巢上皮性癌中整合素αVβ5的表达强度与MVD值之间呈正相关(r=0.545,P＜0.05);(4)卵巢上皮性癌中整合素αVβ5表达阳性组患者的生存率明显低于整合素αVβ5表达阴性组(P＜0.05)。结论：整合素αVβ5可能通过介导血管新生参与卵巢上皮性癌的发生、发展、侵袭和转移,整合素αVβ5是卵巢上皮性癌患者的不良预后指标。     

SiRNA干扰DLL4表达对A549细胞周期和凋亡的影响

目的 筛选DLL4基因的特异性小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),探讨DLL4对A549 细胞增殖、周期、凋亡的影响.方法 设计、合成并筛选针对DLL4的siRNA,转染A549细胞后,以RT-PCR和Western blot检测DLL4 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖,激光扫描共聚焦显微镜检测细胞凋亡变化,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 DLL4 siRNA能够明显下调A549细胞中DLL4 mRNA和蛋白的表达.并能抑制细胞的增殖(抑制率为43.85％);促进细胞凋亡(P＜0.05),G2/M期细胞比例明显增加(P＜0.05).结论 DLL4在肺癌细胞中也有表达,下调其表达后,能够抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡.     

脂质体转染survivin siRNA对A549细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨脂质体转染survivin siRNA 对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡的影响.方法:人工合成抑制survivin基因的siRNA片段,通过脂质体转染到A549细胞内,倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化;用四氮唑盐(M1Tr)法观察转染后24h,48h,72h对细胞增生的影响;流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数;RT-PCR检测survivin mRNA的表达.结果:转染siRNA后的A549细胞,细胞增殖受到显著抑制,细胞明显出现凋亡,survivin基因mRNA表达显著下降.结论:应用RNA干扰靶向抑制survivin基因可以显著抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡.survivin可能成为肺癌基因治疗的一个新靶点.     

晶状体蛋白αB对卵巢癌细胞恶性行为的影响

目的 研究晶状体蛋白αB(αB-crystallin)在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞SKOV3增殖及迁移侵袭能力的影响.方法 免疫组织化学法检测人正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中αB-crystallin表达;针对蛋白αB-crystallin的基因(CRYAB基因)设计合成靶向小干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA)重组慢病毒,并感染人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3;流式细胞仪、平板克隆、MTT检测细胞凋亡和增殖;Transwell检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达.结果 αB-crystallin在卵巢癌组织中表达高于正常卵巢组织,在Ⅱ型卵巢癌组织中呈明显高表达(P＜0.01),稳转CRYAB siRNA慢病毒后SKOV3细胞内αB-crystallin蛋白表达降低64％,其凋亡和增殖无明显改变,但SKOV3细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制(P＜0.01),同时蛋白MMP-2和MMP-9表达下调(P＜0.01).结论 αB-crystallin能够影响卵巢癌SKOV3细胞浸润转移,其在Ⅱ型卵巢癌组织中的高表达可能与其高侵袭潜能相关.     

SH-SY5Y神经细胞中α3尼古丁受体基因表达沉默对β分泌酶蛋白表达的影响

目的:研究α3神经型尼古丁受体(nAChR)基因沉默对β分泌酶(BACE)蛋白表达的影响。方法:稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒及空质粒的SH-SY5Y神经细胞与正常对照组细胞,用Real time-PCR和Western印迹法检测α3 nAChR mRNA表达和蛋白水平表达,评价RNA的干扰效率;用蛋白质印迹方法分别检测细胞中β分泌酶2个亚型(BACE1和BACE2)蛋白表达水平的变化。结果:稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒的细胞克隆株,与空质粒和正常对照组相比BACE1蛋白表达水平增加,BACE2蛋白表达水平减少。结论:α3 nAChR可以通过增加BACE2蛋白表达水平及减少BACE1蛋白表达水平,影响Aβ生成从而减少Aβ的神经毒性作用,发挥神经保护作用。     

hnRNPB_1基因的RNA干扰抑制肺癌细胞A549增殖研究

目的 探讨特异性小分子干扰(small interference,siRNA)抑制肺癌A549细胞核内不均一核糖蛋白B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPB1)基因的表达后,对A549细胞增殖的影响. 方法构建hnRNPB1特异性的siRNA真核细胞表达载体并转染人肺癌细胞株A549,观察重组载体分别在第1、4及6周对A549细胞hnRNPB1基因的干扰效果以及对肺癌细胞周期及凋亡的影响.结果 特异性siRNA真核表达可显著抑制肺癌细胞hnRNPB1基因的表达,使hnRNPB1 mRNA的表达减少46%～73%,蛋白表达减少77.69%～83.04%,作用时间至少可维持克隆形成后4周,同时,hnRNPB1基因表达下调抑制了A549细胞在体外的增殖,促进了肺癌细胞的凋亡.结论 特异性siRNA能特异、高效地抑制肺癌细胞株A549细胞hnRNPB1基因的表达,RNAi可能为肺癌的基因治疗提供新策略.     

靶向siRNA沉默Akt1基因表达及其对肺癌培养基促内皮细胞迁移的抑制作用

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对血管内皮细胞Akt1基因表达的沉默作用及其对肺癌A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的影响。方法:以人脐静脉内皮细胞为靶细胞,设计针对Akt1基因mRNA的siRNA(siAkt1),利用阳离子脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞,采用半定量PCR技术(RT-PCR)检测Akt1mRNA的表达,用Western blotting技术检测Akt总蛋白表达。同时用体外"伤口愈合"实验观察细胞迁移。结果:筛选出的siAkt1能显著抑制内皮细胞Akt1mRNA(P<0.01)和Akt总蛋白的表达(P<0.05),A549细胞条件培养基显著促进人脐静脉内皮细胞迁移(P<0.05),但对转染siAkt1的人脐静脉内皮细胞迁移没有促进作用(P>0.05)。结论:特异性siRNA通过有效抑制Akt1基因的表达而抑制A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的作用,这为肺癌血管生成干预治疗提供了新的理论基础。     

RNAi抑制NF—KB基因增强肺癌细胞对TRAIL敏感性的研究

目的:探讨RNAi靶向沉默NF-κB基因对TRAIL诱导肺癌细胞凋亡的影响.方法:使用NF-κB p65 siRNA转染肺癌A549细胞48 h,实验分为空白对照、脂质体对照以及干扰实验3组.采用RT-PCR法测定肺癌A549细胞内NF-κB p65 mRNA的表达,MTT法检测siRNA转染前后TRAIL对A549细胞生长抑制作用的变化.结果:与空白对照和脂质体对照组相比,siRNA组具有明显抑制肺癌A549细胞NF-κB p65mRNA表达的作用(P<0.01).MTT实验表明,转染siRNA后TRAIL对A549细胞的生长抑制作用明显增强,但在同一浓度,转染NF-κB p65 siRNA的细胞与未转染组相比,细胞增殖活性明显下降(P<0.05).结论:应用RNAi技术可有效干扰NF-κB p65的表达,抑制肺癌A549细胞的增殖,并可增加肺癌细胞对TRAIL的敏感性.     

沉默MACC1基因表达对耐药性非小细胞肺癌A549细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨siRNA沉默结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达对耐药性非小细胞肺癌细胞株A549增殖及侵袭的影响。方法培养非耐药性和耐药性非小细胞肺癌A549细胞,应用RT-PCR技术检测MACC1 mRNA的表达水平;通过化学合成特异性siRNA,与阳离子脂质体Lipofectamine 2000形成复合体,转染耐药性A549细胞,RT-PCR检测转染效果;继续顺铂药物处理耐药性A549细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率;Hoechst33258染色法观察siMACC1后耐药性A549细胞的凋亡形态;Transwell法检测siMACC1后耐药性A549细胞迁移能力;Western blot法检测siMACC1后耐药性A549细胞周期蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达水平。结果与耐药性A549细胞组比较,非耐药性A549细胞组中MACC1 mRNA表达量显著下降(P0.05)。与siRNA NC耐药性A549细胞组比较,siRNA MACC1耐药性A549细胞组中MACC1 mRNA表达量显著降低(P0.05),细胞增殖抑制率上升(P0.05);Hoechst 33258细胞染色结果表明siRNA MACC1耐药性A549细胞组发生细胞皱缩,细胞核聚集,细胞形态学呈现细胞凋亡改变;Transwell实验表明MACC1基因沉默后,细胞迁移能力变弱;Western blot结果表明MACC1基因沉默后,与siRNA NC耐药性A549细胞组比较,siRNA MACC1耐药性A549细胞组中E-cadherin蛋白表达显著增加(P0.05),N-cadherin蛋白表达显著减少(P0.05),细胞的侵袭转移能力显著减弱。结论 MACC1在耐药性A549细胞中的异常升高,可能是肺癌肿瘤细胞耐药性产生的分子机制之一。siRNA MACCl能够有效转染耐药性A549细胞,能显著地抑制耐药性A549细胞增殖与侵袭。     

真核基因组编码大量长链非编码RNA癌易感性候选基因15在肺癌细胞中表达上调且通过miR-153-3p激活Wnt/β-catenin 通路调控A549细胞增殖、侵袭及化疗敏感性实验研究

目的:探讨真核基因组编码大量长链非编码RNA癌易感性候选基因15(lncRNA CASC15)调控肺癌A549细胞增殖、侵袭和化疗敏感性的作用机制。方法:实时荧光定量PCR实验分析lncRNA CASC15、miR-153-3p在65例肺癌组织、50例癌旁组织、肺癌A549细胞和正常肺上皮BEAS-2B细胞中的差异表达。选取A549细胞进行培养,并将siRNA CASC15转染A549细胞,分析下调CASC15对A549细胞增殖和侵袭的影响,用不同浓度顺铂(0、2、4、8、16μg/ml)处理A549细胞后,检测细胞活力和凋亡率。miRcode预测lncRNA CASC15的潜在结合靶点,双荧光素酶报告基因实验进一步分析与miR-153-3p之间的相关性。下调miR-153-3p或同时上调lncRNA CASC15和miR-153-3p表达,分析A549细胞增殖、侵袭和化疗敏感性情况。过表达或下调miR-153-3p,检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达。XAV939作用细胞后进一步检测miR-153-3p对A549细胞的增殖、侵袭和化疗敏感性的影响。结果:与癌旁正常组织或B...     

STATs家族在非小细胞肺癌组织中的表达量分析及其潜在靶基因的研究

目的:研究非小细胞肺癌组织中STATs家族的表达量及STATs潜在的靶基因。方法:选择在我院诊断为非小细胞肺癌的128例患者,收集肺癌组织和癌旁组织,提取蛋白后采用酶联免疫吸附试剂盒测定STATs以及增殖、凋亡、血管新生相关基因的表达量。结果:非小细胞肺癌组织中STAT1的蛋白表达量显著低于癌旁组织,STAT3、STAT5的蛋白表达量显著高于癌旁组织,STAT2、STAT4、STAT6的蛋白表达量与癌旁组织比较无显著性差异;STAT1高表达非小细胞肺癌组织中Bcl-2、BclxL的蛋白表达量显著低于STAT1低表达非小细胞肺癌组织,Caspase-2、Caspase-3、Caspase-7的蛋白表达量显著高于STAT1低表达非小细胞肺癌组织;STAT3、STAT5高表达非小细胞肺癌组织中VEGF-A、VEGFR1、VEGFR2、FGF2、FGFR1的蛋白表达量显著高于STAT3、STAT5低表达非小细胞肺癌组织。结论:非小细胞肺癌组织中STAT1呈低表达、STAT3和STAT5呈高表达,STAT1的靶基因为增殖和凋亡基因,STAT3和STAT5的靶基因为血管新生基因。     

siRNA抑制人前列腺癌PC-3细胞株VEGF的表达及细胞增殖

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对PC-3人前列腺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的抑制作用及抑制癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。方法:体外合成特异性靶向人VEGF基因的siRNA，并转染到PC-3细胞中;RT-PCR和Western blotting检测siVEGF对VEGF基因和蛋白表达的抑制作用;MTT法检测siVEGF对癌细胞增殖抑制作用，流式细胞术检测siVEGF诱导细胞凋亡的作用。结果:转染siVEGF1和siVEGF2组VEGF mRNA 表达水平与空白对照组比较分别下调了60.32%和70.73%；VEGF蛋白表达水平与空白对照组比较明显受到抑制，最高抑制率达72％；转染阴性对照质粒组VEGF基因和蛋白表达水平都无明显改变。转染siVEGF1和siVEGF2的细胞增殖受到抑制，增殖抑制率分别为49.5%和55.3 %，细胞的凋亡率分别为33.9%和42.0%。结论:构建的siRNA VEGF能特异有效下调VEGF基因的表达,瞬时转染siRNA VEGF能有效抑制人前列腺癌细胞PC-3增殖并诱导其凋亡。     

siRNA联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达的影响。方法 在肺癌A549细胞中转染survivin基因的siRNA,分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blotting方法检测survivin基因mRNA和蛋白的表达。将肺癌A549细胞分为单纯放射组、单纯转染组、转染+放射组,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用细胞集落形成实验检测细胞增殖情况,采用CCK8测细胞生长曲线。结果 siRNA能抑制肺癌细胞survivin基因mRNA和蛋白的表达。siRNA联合预照射较单纯转染和单纯放射能显著增加细胞凋亡率,降低细胞的集落形成,抑制细胞生长。结论 预照射可以增强siRNA对肺癌细胞survivin基因的抑制作用。     

人骨髓间充质干细胞表达外源性IL-24基因对肺癌细胞A549增殖的影响

目的探讨以人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)为基因治疗载体表达外源性IL-24对肺癌细胞A549增殖和凋亡的影响。方法分离培养hBMSCs,并通过流式细胞术鉴定。慢病毒介导IL-24基因转染hBMSCs,构建表达外源性基因IL-24的hBMSCs(hBMSCs-IL-24),qPCR及ELISA法检测hBMSCs-IL-24中IL-24基因mRNA及蛋白表达。CCK-8法检测hBMSCs-IL-24分泌的外源性IL-24对肺癌细胞A549增殖活性的影响。AnnexinV-PI检测hBMSCs-IL-24对A549细胞凋亡的影响。结果慢病毒介导的外源基因IL-24成功转染hBMSCs(hBMSCs-IL-24),其IL-24基因在mRNA及蛋白水平均有明显表达。hBMSCs-IL-24分泌的外源性IL-24蛋白显著抑制肺癌细胞A549的增殖并促进其凋亡。结论 hBMSCs-IL-24能够在mRNA及蛋白水平表达外源性IL-24基因,IL-24蛋白能显著抑制肺癌细胞A549的增殖,促进凋亡。