静注人免疫球蛋白(pH4)Fc段生物学活性检测条件的优化

目的优化静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins,IVIG)Fc段生物学活性检测条件,并验证该方法的重复性。方法基于《中国药典》三部(2010版)人免疫球蛋白Fc段激活补体的试验方法,优化致敏红细胞的抗原(白喉类毒素)效价(25、50、100、150、200和250 Lf/ml)、IVIG浓度(5、10、20、30、40和50 mg/ml)和补体效价(15、50、75、100和150 CH50/ml)3个试验条件;采用优化的试验条件,对1批IVIG制品重复测定10次,计算变异系数(CV),验证该方法的重复性。结果在致敏红细胞的抗原(白喉类毒素)效价100～200 Lf/ml、IVIG浓度50 mg/ml和补体效价≥75 CH50/ml的条件下,补体介导的溶血反应动力学曲线呈典型的"S"型,可准确计算出IVIG Fc段激活补体的指数(IFc)。采用优化的试验条件,对1批IVIG制品重复测定10次,溶血反应动力学曲线几乎重合为一条,10次测定的IFc值的CV=8.91%。结论优化了IVIG Fc段生物学活性检测条件,优化后的检测方法重复性较好。     

阴离子交换层析处理对静注人免疫球蛋白(pH 4)制品的影响

目的分析在低温乙醇蛋白分离法基础上引入阴离子交换层析(anion exchange chromatography,AEX)纯化工艺处理,对静注人免疫球蛋白(pH 4)制品质量的影响。方法检测并对比分析低温乙醇蛋白分离法及联合AEX纯化工艺制备的静注人免疫球蛋白(pH 4)制品分子量大小分布、抗补体活性(anticomplement activity,ACA)、抗-HBs效价、白喉抗体效价、IgA含量、抗体Fc段生物学活性、IgG亚型分布、N-糖基化类型、蛋白质二级结构和三级结构的异同。结果在低温乙醇蛋白分离法基础上,引入AEX纯化工艺处理,可大幅度降低静注人免疫球蛋白(pH 4)制品中IgA含量;有利于去除制品中三级结构发生改变的蛋白质;未对制品其他质量指标产生显著影响。结论在低温乙醇蛋白分离法基础上,引入AEX纯化工艺可提高静注人免疫球蛋白(pH 4)制品质量。     

MTX-抗体偶联物对单核-巨噬细胞的封闭和杀伤作用

目的　观察静脉注射用免疫球蛋白与免疫抑制剂偶联物对单核—巨噬细胞的杀伤作用 ,为其临床治疗ITP奠定实验基础。方法　分别用间接和直接交联法将IVIG与MTX制备成偶联物 ,用间接免疫荧光法检测偶联物Fc段结合活性 ,以Fc受体阳性的小鼠巨噬细胞和人单核细胞白血病细胞株U937为靶细胞 ,用MTT法测定偶联物的杀伤活性。结果　偶联物对巨噬细胞的杀伤作用明显大于游离MTX ;偶联物对Fc受体阳性细胞的杀伤作用明显大于Fc受体阴性细胞。间接偶联物IVIG HSA MTX杀伤作用明显高于直接偶联物IVIG MTX。结论　MTX抗体偶联物在体外对单核—巨噬细胞显示了相对特异的杀伤活性     

新型静注人免疫球蛋白的制备及鉴定

目的制备新型静注人免疫球蛋白(IVIG),并对其质量进行鉴定。方法采用超滤浓缩法制备了8批10%IVIG制品,以甘氨酸代替糖类作为稳定剂的主要配方,并优化其浓度(12~18 g/L)。检测10%IVIG制品的总体质量、Ig G亚类分布、Fc活性及稳定性。结果最佳甘氨酸浓度为15 g/L。10%IVIG制品的总体质量均合格,Ig G亚类分布及Fc活性均与5%IVIG制品相似,且该制品在25℃存放6个月和2~8℃存放6年后的总体质量均合格。结论制备的10%IVIG质量优良,且具有良好的稳定性。     

静注人免疫球蛋白唾液酸含量测定方法的建立及初步应用

目的建立静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins,IVIG)唾液酸含量的测定方法,并用该方法对国内外IVIG制品唾液酸含量进行检测。方法根据《中国药典》三部(2015版)和《欧洲药典》8.0中的相关内容建立唾液酸含量检测的方法,对方法中的检测波长、反应体系、沸水浴时间及样品检测浓度进行优化,并验证该方法的线性范围、精密性及准确性。采用建立的方法检测国内外7个厂家的21批IVIG制品唾液酸含量,并进行比较。结果最适检测波长为580 nm;最佳N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminicacid,NANA)标准品、间苯二酚反应液、异戊醇的加入量分别为0.2、0.5、0.5 ml;最佳沸水浴时间为30 min;最佳样品检测浓度为2 mg/ml。NANA标准品在5~80μg/ml浓度范围内,与A580值呈良好的线性关系,相关系数(R2)=0.998;5批IVIG制品检测结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)平均值为3.72%,同一批IVIG制品于3个不同时间检测结果的RSD值为3.1%;IVIG样品的加标回收率为(98.5±7.9)%。不同厂家的IVIG制品唾液酸含量存在较大差异。结论本研究建立的方法具有良好的精密性及准确性,可用于IVIG唾液酸含量的检测。     

重组人粒细胞集落刺激因子的生物学活性分析

目的评价近年重组人粒细胞集落刺激因子(Recombinant human grenulocyte colony-stimulatiny factor,rhG-CSF)的生物学活性及其检测方法的应用情况。方法采用mNFS-60细胞/MTT比色法对41批不同来源的rhG-CSF进行生物学活性检测,对中国食品药品检定研究院与各生产企业的检测结果进行比较,评价中国食品药品检定研究院检测rhG-CSF生物学活性结果的可信性。结果 37批国产rhG-CSF的生物学活性检测结果均符合《中国药典》三部(2010版)质量要求,4批进口rhG-CSF的生物学活性均符合进口拟定质量标准(JS20070016)要求。中国食品药品检定研究院与各企业的rhG-CSF生物学活性检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。结论近年上市的rhG-CSF生物学活性达到《中国药典》三部(2010版)质量要求;该制品的生物学活性检测方法在全国范围内应用情况良好。     

国产静脉注射人免疫球蛋白制品中凝血激活物水平分析

目的分析11家中国血液制品企业共计64批次上市后的静脉注射人免疫球蛋白(immunoglobulin for intravenous injection,IVIG)(p H 4)制品中凝血激活物水平,对国内IVIG制品在促凝血方面的安全性作出评估,为提高制品质量标准提供参考。方法利用非活化的部分凝血活酶时间法(non-activated partial thromboplastin time,NAPTT)、凝固法(一期法)及本实验室建立的改良凝血酶生成试验(modified thrombin generation test,M-TGT),分别测定64批次国产和7批次进口IVIG样品的NAPTT、系列凝血因子活性、活化凝血因子Ⅺ(FⅪa)的含量及凝血酶生成含量达到最高值时所需时间(time to peak,TTP),分析IVIG的凝血激活物水平。结果除国内厂家F所生产的2批IVIG中FⅪ活性为0.030~0.036 IU/ml外,其余国产62批次产品中FⅪ活性均低于试剂最低检测限未检出;所有产品中TTP均大于40 min,FⅪa含量均小于0.37 nmol/L,NAPTT均大于203 s。结论所调查的11家共计64批次的国产IVIG制品的凝血激活物水平均较低。今后在我国是否推行IVIG制品的凝血激活物检测尚需进一步研究。     

DV50纳米过滤去除静注人免疫球蛋白中的病毒时流速的影响因素

目的分析DV50纳米过滤去除静注人免疫球蛋白(Human immunoglobulin for intravenous injection,IVIG)病毒时流速的影响因素。方法分别采用浊度仪、密度仪检测IVIG原液的浊度及浓度,随机选取5批浓度相近、浊度不同的IVIG原液及5批浊度相近、浓度不同的IVIG原液,分别经同一批号纳米滤芯过滤,计算平均流速;随机选取5批浊度、浓度相近的IVIG原液,经不同批号的纳米滤芯过滤,计算平均流速。结果随着制品浊度的升高,平均流速逐渐降低;制品浓度与平均流速不呈线性对应关系;不同批号的纳米滤芯,纳米平均流速相差较大。结论制品浊度对流速具有一定的影响,浓度对流速基本无影响,纳米滤芯对流速的影响最大。本实验为实际生产中控制纳米过滤去除病毒时的流速及改进生产工艺提供了参考。     

静脉注射人免疫球蛋白的质量控制

静脉注射用人免疫球蛋白 (IVIG)在抗体置换、免疫调节等方面有着广泛的应用。由于IVIG经静脉注射 ,且用量较大 ,其质量控制尤为重要。控制IVIG质量主要包括IgG的完整性、抗补体活性 (ACA)、多聚体含量、杂蛋白含量、抗体效价、病毒安全性等方面。     

静注人免疫球蛋白(pH 4)中人肠道病毒71型中和抗体效价分析

目的对目前市售静注人免疫球蛋白(p H 4)(human intravenous immunoglobulin,IVIG)中的人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)中和抗体效价进行筛查,为EV71相关疾病的被动免疫治疗提供参考。方法采用微量细胞病变法检测24批IVIG制品中的EV71中和抗体效价,并分组进行比较。结果 24批IVIG制品中的EV71中和抗体效价为841.6~1 024.3 U/m L,比活为16 832~20 486 U/g Ig G。4个季度生产的IVIG中EV71中和抗体效价差异无统计学意义(P0.05),病毒高发季与非高发季采浆生产的IVIG中EV71中和抗体效价差异也无统计学意义(P0.05)。结论 IVIG制品中EV71中和抗体效价可达50 000 U/瓶(蛋白浓度5%,50 m L/瓶),本研究为EV71相关疾病的被动治疗提供了临床参考依据。     

静注人免疫球蛋白制剂抗巨细胞病毒中和抗体效价的筛查

目的筛查国内、外静注人免疫球蛋白(human intravenous immunoglobulin,IVIG)和静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(human intravenous cytomegalovirus immunoglobulin,CMV-IVIG)制品抗CMV中和抗体效价。方法采用微量细胞病变法检测国内、外IVIG制品及CMV-IVIG抗CMV中和抗体效价,并进行比较。结果国外CMV-IVIG制品Cytogam(3 648 U/g IgG)和Cytotect(3 104 U/g IgG)抗CMV中和抗体效价分别是IVIG制品Privigen(1 048 U/g IgG)和Intratect(980 U/g IgG)的3.5和3.2倍;国内CMV-IVIG制品抗CMV中和抗体平均效价(7 195 U/g IgG)是国内13家企业19批IVIG制品(1 836 U/g IgG)的3.9倍;国内IVIG制品抗CMV中和抗体平均效价是国外IVIG制品Privigen和Intratect的1.8和1.9倍,国内CMV-IVIG制品抗CMV中和抗体平均效价是国外CMV-IVIG制品Cytogam和Cytotect的2.0和2.3倍。结论国内、外的CMV-IVIG制品抗CMV中和抗体效价均为相应IVIG制品3倍以上,采用微量细胞病变法筛查血浆用于制备CMV-IVIG具有可行性,为CMV相关疾病的被动免疫制剂的制备提供了实验依据。     

病毒灭活/去除工艺对抗CD20单克隆抗体生物学活性影响评价方法的建立

目的建立病毒灭活/去除工艺对抗CD20单克隆抗体生物学活性影响的评价方法。方法以Raji细胞株作为靶细胞,通过补体依赖性细胞毒(complement dependent cytotoxicity,CDC)作用,用CCK-8试剂进行抗CD20单克隆抗体的生物学活性检测,并验证系统适应性。以抗CD20单克隆抗体参比品计算低pH及纳米膜过滤(简称纳滤)2种病毒灭活/去除工艺前后样品的相对百分效价,并对检测结果进行统计学分析。结果抗CD20单克隆抗体CDC生物学活性存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)~B]+D。该方法的曲线平行性较好,且有良好的稳定性和有效性。低pH病毒灭活工艺处理前后样品的相对效价分别为(97. 22±2. 49)%和(87. 84±5. 60)%,相对变化值的平均平方值为10. 57%;纳滤病毒去除工艺处理前后样品的相对效价分别为(87. 65±4. 31)%和(89. 43±7. 33)%,相对变化值的平均平方值为4. 17%。2种工艺3次检测间差异的单因素方差分析及处理前后配对t检验差异均无统计学意义(P 0. 05)。结论以抗CD20单克隆抗体为目标抗体,建立了病毒灭活/去除工艺对生物学活性影响的评价方法,该方法具有良好的平行性、稳定性及有效性,为其他单克隆抗体类治疗药物的质量控制提供了实验依据。     

静脉注射用免疫球蛋白的抗补体活性及部分免疫学特性测定

本文采用100CH_(50)法测定静脉注射用免疫球蛋白(IVIG)的抗补体活性(ACA)。对IVIG的pH,Na~+含量及不同成分的缓冲液进行了试验比较;ACA重复测定结果的变异系数在15％以内;MG在含微量IgG多聚体情况下,多聚体与ACA的关系不明显;17批MG都含有麻疹抗体和白喉抗体,IgA含量不等,不含IgM。     

肉毒毒素生物学活性及肉毒中毒病原检测方法的研究进展

肉毒毒素生物学活性的检测和肉毒中毒诊断方法的研究进展迅速,对食品检验、肉毒中毒实验室诊断、生物反恐和肉毒毒素制品的开发及应用具有十分重要的意义。本文就肉毒毒素生物学活性及肉毒中毒病原检测方法的研究进展作一综述。     

静注人免疫球蛋白产品中活化Ⅺ因子活性凝血酶生成试验检测方法的建立

目的建立静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)中活化Ⅺ因子(activated factorⅪ,FⅪa)活性凝血酶生成试验(thrombin generation assay,TGA)的测定方法。方法采用自动校正凝血酶生成(calibrated automated thrombogram,CAT)分析仪,建立IVIG中FⅪa活性检测方法,并确定方法的线性范围和检测限,验证方法的精密度和准确性。采用建立的方法对4家血液制品公司的29批IVIG产品进行FⅪa活性定量测定。结果 FⅪa浓度在3. 34～27. 84 mIU/mL范围时,与凝血酶峰值浓度(peak thrombin concentration,PTC)呈良好的线性关系,回归方程为Y=-0. 022 8 X~2+1. 891 6 X+10. 282,R~2=0. 989;检测限为2. 76 mIU/mL;供试品的6次测定结果 RSD为12. 9%;低、中、高浓度加标样品的回收率分别为86. 7%、116. 7%、121. 6%,RSD分别为16. 4%、19. 8%、8. 4%。29批IVIG产品中,不同厂家及相同厂家不同批次间FⅪa活性均存在一定差异。结论建立了用于检测IVIG产品中FⅪa活性的TGA方法,且具有良好的线性、精密性及准确性,可用于评价IVIG产品的致血栓风险。     

抗CD20单克隆抗体质量控制中生物学活性的趋势分析

目的对抗CD20单克隆抗体质量控制中的生物学活性进行趋势分析。方法利用人淋巴瘤Raji细胞株作为靶细胞,通过补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC),使用Cyto Tox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂监测抗CD20单抗的生物学活性,以抗CD20单抗参比品计算供试品的相对百分效价。通过对中国食品药品检定研究院(NIFDC)和企业质控实验室99批次抗CD20单抗生物学活性的检测结果,分别建立警戒限(均值±2 SD)和行动限(均值±3 SD),绘制趋势分析图,并对检测结果进行连续性及周期性趋势分析。结果对2009~2013年某企业抗CD20单抗的生物学活性测定结果显示,抗CD20单抗供试品和参比品在CDC活性中均存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D。NIFDC体外CDC活性的相对百分效价为(99.95±10.83)%,企业自检的相对百分效价为(100.71±9.29)%;对上述结果进行连续性趋势分析,未发现超出行动限的结果;对不同年度间数据进行方差分析显示,年度间差异无统计学意义(P0.05),数据具有可比性;对年度数据进行周期性趋势分析,结果均在行动限以内,无过高或过低结果,未出现严重的漂移或连续两批结果相差4 SD以上结果,总体趋势较平稳。结论首次通过对抗CD20单克隆抗体生物学活性的趋势分析,反映了该制品的批间一致性以及生产工艺的稳定性,也为其他单抗类治疗药物质量控制中关键质量属性的趋势分析提供了参考。     

静注人免疫球蛋白质量控制要求的比较

静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)p H 4目前已广泛用于治疗各种免疫缺陷疾病及自身免疫性疾病。严格的质量控制是确保IVIG临床疗效的重要保障,欧美及我国药典均对IVIG的质控作出了严格规定。但IVIG成分复杂,随着其作用机制逐渐明确以及新的临床适应症不断增加,现有的规定可能需实时补充、完善和改进。本文比较了目前国际主流药典关于IVIG制品质量控制要求的差异,以及现有文献资料中对于IVIG制品质量控制新方法的探索,以期对相关人员研究及血液制品企业生产质控有所启发。     

心房利钠多肽的规模化制备及活性分析

目的 建立一种简便、有效的心房利钠多肽（ａｔｒｉａｌ　 ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＡＮＰ）的规模化制备方法。 方法 以恒河猴心房为原料，采用匀浆、分级超滤制备ｍ－ＡＮＰ，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定纯度和相对分子质量，用Ｗｉｓｔａｒ大 鼠检测生物学活性。结果 所制备的ｍ－ＡＮＰ相对分子质量主要分布在２０００～６０００，包含了ＡＮＰ的主要活性成分。 具有降低血压，扩展血管和利钠利尿的生物学活性。结论 该工艺可用于规模化生产ＡＮＰ。     

IgG-Fc融合蛋白的研究进展

IgG-Fc融合蛋白是将生物活性蛋白与IgG的铰链区和Fc片段进行基因重组而表达的融合蛋白。IgG-Fc融合蛋白不仅可发挥所融合蛋白的生物学活性,还赋予其类似抗体的特性,包括延长血浆半衰期以及Fc片段特有的一系列效应功能,并已广泛应用于临床治疗、生物医学研究等领域。合理优化IgG-Fc融合蛋白是未来发展趋势,选择合适的IgG亚类作为融合载体,采用Fc片段单个或多个氨基酸序列修饰、糖基化改造等,提高融合蛋白的血浆半衰期、优化融合蛋白的效应功能,最终达到最佳免疫治疗效果。本文对IgG-Fc融合蛋白的功能、相应优化策略作一综述,并介绍了其临床研究现状。     

纳米滤芯过滤静注人免疫球蛋白去病毒工艺的蛋白耗损分析

目的分析使用纳米滤芯过滤静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)去除病毒时的蛋白损耗。方法通过分析蓉生静注人免疫球蛋白(pH 4)使用纳米滤芯除病毒过滤前后的蛋白含量,探讨纳米过滤总量、纳米滤芯批号、纳米滤芯数量对纳米滤芯除病毒过程中蛋白损耗量及损耗率的影响。结果纳米过滤蛋白损耗并未随批量增加而增加,使用不同批号滤芯和使用不同数量滤芯进行生产,蛋白损耗变化均较小。结论使用纳米滤芯进行IVIG纳米过滤生产,制品量、滤芯批号及数量对纳米过滤蛋白损耗影响均较小。