JAK2-STAT3途径介导凝血酶诱导的小胶质细胞iNOS的激活致多巴胺能神经元变性

目的 探讨JAK2-STAT3途径与凝血酶诱导多巴胺能神经元变性作用的关系.方法 20 U/ml凝血酶或AG490(10 μmol/L)预处理 凝血酶(20 U/ml)处理原代培养的小胶质细胞或中脑腹侧混合培养体系,用Western blot检测小胶质细胞P-JAK1、P-JAK2、JAK2、STAT3、P-STAT3的表达;免疫荧光观察多巴胺能神经元的变性;Western blot、RT-PCR及激光共聚焦观察iNOS的表达.结果 凝血酶处理小胶质细胞2 h后诱导JAK2、STAT3的磷酸化,2 h和4 h分别增加小胶质细胞iNOS的转录和表达,并且24 h诱导中脑培养体系多巴胺能神经元变性.而AG490预处理显著地减少对应凝血酶处理组小胶质细胞JAK2和STAT3的磷酸化,抑制iNOS的表达,并且缓解多巴胺能神经元的变性.结论 JAK2-STAT3途径介导凝血酶诱导的小胶质细胞iNOS的激活,导致多巴胺能神经元变性.     

大鼠中脑切片的酪氨酸羟化酶和谷氨酸双重免疫荧光染色

在大鼠中脑组织切片上进行酪氨酸羟化酶和谷氨酸双重免疫荧光染色。用改良的脑灌注法以降低双重免疫荧光染色时谷氨酸的背景噪音 ,获得了满意的结果。在大鼠中脑腹侧 ,91 %± 4%的多巴胺神经元呈谷氨酸染色阳性 ,从细胞组织学上证明了中脑腹侧多数多巴胺神经元存在多巴胺与谷氨酸递质共存现象。     

百草枯和氧桥氯甲桥萘对离体大鼠中脑多巴胺神经元的损害

目的建立大鼠中脑多巴胺神经元的培养体系,判断百草枯(Paraquat)和氧桥氯甲桥萘(Dieldrin)能否对培养的大鼠中脑多巴胺神经元产生选择性损害。方法将0.001～100μmol/L浓度的Paraquat、Dieldrin加入到原代培养的大鼠中脑多巴胺神经元中,计数存活的多巴胺神经元和非多巴胺神经元。结果Paraquat对大鼠中脑多巴胺神经元无选择性损害。1μmol/LDieldrin能选择性损害大鼠中脑多巴胺神经元。结论Dieldrin可能是致帕金森病(PD)的神经毒物,它与PD病因之间的联系值得进一步研究。     

组胺介入鱼藤酮引起的多巴胺能神经元损伤的细胞分子机制

【立论依据】 帕金森病(Parkinson's disease, PD)是第二常见的慢性神经系统退行性疾病。以往临床及尸检研究发现PD病人脑内组胺能系统处在激活的状态,本实验的前期工作发现组胺可加重6-OHDA引起的大鼠黑质内多巴胺能神经元的早期退变过程。但黑质是个细胞成分复杂的脑区,包括多种神经元和胶质细胞,而组胺本身又具有双重身份:即是神经递质,又是炎性介质,这就决定了组胺介入多巴胺能神经元损伤“微环境”的复杂性。本实验试图阐明组胺损伤多巴胺能神经元的细胞机制(黑质内哪些细胞参与)及其下游的分子机制(通过哪些受体或炎性介质起作用) 【设计思路】 选取PC12细胞及SH-SY5Y细胞,作为多巴胺神经元的细胞模型,以鱼藤酮造成细胞损伤,观察组胺及其多个受体拮抗剂对细胞生长的影响,以明确组胺是否直接介入鱼藤酮引起的多巴胺能细胞的损伤及其下游分子机制;选取Wistar胎鼠腹侧中脑进行混合神经元培养,以鱼藤酮特异损伤多巴胺能神经元,观察组胺对体系中各细胞成分形态的影响(GABA、Glu、5-HT能神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞),以明确黑质内其他细胞成分是否也组胺参与鱼藤酮引起的多巴胺能细胞的损伤及其下游分子机制。 【实验内容】 (1)①PC12、SH-SY5Y细胞的培养;②MTT法检测组胺及其多个受体拮抗剂+鱼藤酮对PC12和SH-SY5Y细胞生长的影响;③如有变化,应用流式细胞仪观察细胞凋亡及应用荧光分光光度计观察细胞内钙的变化;④如有变化,蛋白质印迹法观察其下游信号通路上某些蛋白的变化。(2)①Wistar胎鼠腹侧中脑神经元的培养;②细胞化学染色法观察组胺+鱼藤酮对体系内各细胞成分形态的影响;③如有变化,细胞化学染色法继续观察组胺各受体拮抗剂+鱼藤酮对该变化的影响;④如能明确某个受体介入该变化,蛋白质印迹法观察该受体下游信号通路上某些蛋白的变化;⑤如胶质细胞也有变化,ELISA法进一步检测胶质细胞释放炎性因子的变化。 【材料】 PC12和SH-SY5Y细胞株,Wistar孕鼠,培养液和血清,MTT,组胺及其各种拮抗剂、鱼藤酮、各种蛋白的抗体,Ca检测试剂盒,ELISA试剂盒 【可行性】 (1)申请人指导教师可保证经费充足;(2)指导教师所属院系实验室具备该实验所需的所有仪器设备;(3)已经购得PC12和SH-SY5Y细胞,并建立Wistar胎鼠腹侧中脑混合神经元培养,预实验初步发现:组胺H1/H2受体拮抗剂Pyrilamine/Cimetidine可以减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞的损伤。原代神经元培养结果显示,组胺可加重鱼藤酮引起的星形胶质细胞及小胶质细胞的增生。即,组胺介入鱼藤酮引起的多巴胺能神经元的损伤,即有直接作用,又有间接作用。 【创新性】 本实验试图揭示组胺参与多巴胺能神经元损伤的属性(神经机制或炎性机制),该研究对今后从何种角度寻找神经元保护药物(受体拮抗剂或抗炎药物)具有指导意义。     

百草枯和氧桥氯甲桥萘对离体大鼠中脑多巴胺神经元的损害

目的 建立大鼠中脑多巴胺神经元的培养体系,判断百草枯（Ｐａｒａｑｕａｔ）和氧桥氯甲桥萘（Ｄｉｅｌｄｒｉｎ）能否对培养的大鼠中脑多巴胺神经元产生选择性损害。方法 将０．００１～１００ｕｍｏｌ／Ｌ浓度的Ｐａｒａｑｕａｔ、Ｄｉｅｌｄｒｉｎ加入到原代培养的大鼠中脑多巴胺神经元中,计数存活的多巴胺神经元和非多巴胺神经元。结果 Ｐａｒａｑｕａｔ对大鼠中脑多巴胺神经元无选择性性损害。１ｕｍｏｌ／Ｌ Ｄｉｅｌｄｒ     

表没食子儿茶素没食子酸酯的多巴胺能神经元保护作用

目的 研究绿茶多酚的主要单体成分表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的多巴胺能神经元保护作用。方法利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四羟吡啶（MPTP）及其代谢产物1-甲基-4-苯基吡啶（MPP＋）分别造成选择性多巴胺能神经元损伤动物模型和细胞模型．给予不同剂量EGCG,免疫组织化学染色方法标记酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞作为多巴胺能神经元标志,通过体视学方法观察不同剂量EGCG对阳性细胞数目的影响,同时利用膜抗原CD11b标记小胶质细胞,观察EGCG对小胶质细胞激活的作用。结果在MPP＋诱导的原代培养中脑腹侧多巴胺能神经元损伤模型中,预先给予EGCG1μmol／L-100μmol／L可显著减轻MPP＋诱导的多巴胺能神经元减少,保护率为22．2％～80．5％。在体情况下,1mg／kg剂量EGCG腹腔注射对MPTP模型小鼠A9区TH免疫阳性细胞丢失的保护率为71．7％．对中脑区域总TH免疫阳性细胞数丢失的保护率为50．9％,5mg／kg和10mg／kg剂量组中脑各区域TH阳性神经元数量均较模型组高（P〈0．05）,同时,EGCG对MPTP所致的中脑部位小胶质细胞的激活具有抑制效应。结论本研究结果提示EGCG在一定剂量范围内对多巴胺能神经元具有显著的保护作用,具有潜在治疗帕金森病的价值,EGCG对多巴胺能神经元的在体保护作用可能与其抑制小胶质细胞的激活密切相关。     

骨髓基质饲养层对精原干细胞体外培养的影响

目的以原代培养小鼠骨髓基质细胞为饲养层，探讨精原干细胞能否在该饲养层上生长及生长的影响因素。方法采用原代培养的小鼠骨髓基质细胞，待细胞长成单层后用丝裂霉素C处理并接种生精细胞共培养。结果原代的小鼠培养骨髓基质细胞能很好的维持精原干细胞的非分化性扩增。结论小鼠原代培养的骨髓基质细胞能作为饲养层支持精原干细胞体外非分化性扩增，该细胞有望成为干细胞培养的新的饲养层。     

人类中脑神经祖细胞的体外扩增及诱导分化

目的：探讨人类中脑祖细胞体外分离、培养及向多巴胺能神经元诱导分化的方法。方法：利用neurosphere法，在低氧分压的情况下建立中脑祖细胞克隆，并用纹状体培养上清对其进行诱导分化，观察TH阳性神经元的分化比率及成熟度。结果：中脑来源的神经祖细胞克隆，能以neurosphere形式生长，低氧分压对其克隆生长具有促进作用；纹状体培养上清可增加TH阳性神经元的分化比率，并能使TH阳性细胞具有更成熟的多巴胺能神经元的形态特征。结论：低氧分压更适于中脑神经祖细胞的体外扩增，纹状体培养上清对中脑祖细胞向多巴胺能神经元的分化及成熟具有促进作用。     

人胚中脑神经干细胞的分离、增殖及分化的研究

目的　探讨人胚中脑腹侧神经干细胞的分离、增殖条件及分化方向。方法　应用表皮生长因子 (ＥＧＦ)和成纤维细胞生长因子 2 (ＦＧＦ 2 )使人胚中脑腹侧幼稚细胞维持在未分化状态并促进其增殖 ;通过克隆分析、细胞增殖曲线及流式细胞仪检测培养细胞的增殖能力 ;应用免疫组织化学方法鉴定这些细胞的分化方向。结果　该细胞群具有一定的增殖能力 ,在撤除生长因子后至少能分化为神经元和星形胶质细胞 ,但未检测到多巴胺能神经元。结论　从人胚中脑腹侧分离出的幼稚细胞具有一定的增殖和自我更新能力 ,有多向分化潜能 ,具备中枢神经系统干细胞的…     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养多巴胺能神经元营养作用

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子对体外培养的中脑多巴胺能神经元的作用。方法：在培养孕14－16d大鼠胚胎黑质神经元中加入碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF)，不同时间对培养细胞进行观察并计数存活的黑质细胞总数及长神经突起细胞总数。结果：培养1周后bFGF可促进多巴胺能神经元的存活和生长。结论：bFGF对体外培养的多巴胺能神经元有营养作用。     

脂多糖对大鼠中脑原代培养细胞的神经损伤作用

目的:观察脂多糖(LPS)对大鼠中脑原代混合细胞多巴胺能神经元的损伤作用.方法:取孕14 d的SD大鼠胚胎中脑原代培养.①将细胞分为正常对照组和不同剂量LPS(0.01、0.10、1.00和10.00 mg/L)组,体外培养7 d后,实验组加入不同浓度的LPS,持续作用72 h后,经酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色...     

蛋白酶体抑制剂对小鼠黑质多巴胺神经元的毒性作用

目的:观察蛋白酶体抑制剂对小鼠黑质多巴胺神经元的毒性作用.方法:8周龄C57BL/6小鼠随机分组:磷酸盐缓冲液(PBS组)和lactacystin组,二种制剂分别单侧立体定向注射于中脑前脑束(Middle forebrain bundle);12周龄时灌注取脑分离纹状体,采用HPLC法测多巴胺、5-HT及代谢产物,取中脑观察黑质区多巴胺能神经元变性及包涵体样物质形成情况.结果:Lactacystin组同侧黑质区多巴胺细胞数减少51%,并可见泛素染色阳性的类包涵体样物质形成,同侧纹状体多巴胺(DA)及其代谢产物二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)浓度分别减少52%、46%和51%,而5-羟色胺(5-HT)及5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)浓度无改变.结论:蛋白酶体抑制剂可引起选择性黑质区多巴胺能神经元变性,并可能导致细胞内异常蛋白质聚集.     

银杏叶提取物对大鼠中脑原代细胞的作用

目的:观察银杏叶提取物(EGB761)对中脑原代培养细胞的作用.方法:采用大鼠胚胎中脑原代细胞培养法,培养了中脑神经细胞,再将细胞分为对照组、阳性对照组(神经生长因子,NGF组)、实验组(EGB761组),给予EGB761和NGF进行配组干预,然后观察细胞生长状况,同时运用MTT(四唑盐)比色法检测神经细胞活性;用抗酪氨酸羟化酶(TH)对多巴胺(DA)能免疫细胞化学染色,比较各组阳性神经元数目及突起的变化情况.结果:实验组细胞生长旺盛,轴突延长明显.MTT法测得细胞A值,实验组0.677及免疫细胞化学TH阳性细胞数(实验组61.90)与空白对照组(A值0.596,TH阳性细胞数50.88)相比差异显著(P<0.05),但与阳性对照组比较二者均无统计学意义(P>0.05).结论:EGB761对中脑原代培养细胞有一定的保护作用.     

谷氨酸在体外对新生大鼠中脑腹侧神经元的神经毒性作用

目的 探讨谷氨酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）在体外对中脑腹侧神经元的神经毒性作用。方法 用培养的新生大鼠中脑侧神经元，暴露于谷氨酸后，经抗酪氨酸羟化酶（ＴＨ）和抗γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）双重免疫细胞染色，观察谷氨酸对神经元的毒性作用以及与其受体的关系，结果 新生大鼠中脑腹侧主要含有多巴胺（ＤＡ）及ＧＡＢＡ神经元，谷氨酸对体外培养１周的ＤＡ神经元的半数致死量为６０μｍｏｌ／Ｌ而对ＧＡＢＡ神经元的半数致死量     

围生期双酚A暴露对雄性子代大鼠中脑多巴胺神经细胞凋亡的影响

目的探讨围生期双酚A暴露对大鼠雄性子代腹侧中脑区多巴胺神经元凋亡及对酪氨酸羟化酶(tyros ine hydroxy lase,TH)蛋白表达的影响。方法孕鼠自妊娠第10 d起至哺乳期结束分别每日给予50(高)、5(中)、0.5(低)、0(对照)m g/kg.bw双酚A灌胃染毒,于子代出生后(postnata l day,PND)第21、30 d取雄性仔鼠脑,采用免疫组化方法检测腹侧中脑区C aspase-3、B cl-2和TH的表达,原位凋亡检测PND 21时腹侧中脑区神经细胞的凋亡。结果仔鼠出生后的两个检测时间点,高、中剂量染毒组的腹侧中脑区与对照组相比C aspase-3表达明显增加,B cl-2表达明显降低,PND 21时腹侧中脑区可见较多的凋亡细胞。PND 21及PND 30时腹侧中脑区TH表达降低。结论围生期双酚A高、中剂量暴露能导致断乳期雄性子代鼠脑多巴胺神经元的凋亡增加,使腹侧中脑多巴胺神经元富集区酪氨酸羟化酶减少,从而影响多巴胺神经系统的功能。     

Necl1促进原代培养大鼠神经元间神经突触形成

目的 研究神经黏附分子Necl1在神经突触形成过程中的功能.方法 采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 检测在体外神经分化细胞模型(SH-SY5Y,P19)中Necl1表达量的变化;Western blot方法 检测原代培养的大鼠海马和皮层神经元在体外培养条件下Necl1的表达量变化和在突触小体中Necl1的表达;细胞免疫荧光法检测神经元和293细胞共培养后293细胞表面突触形成情况,并检测在神经元内过表达Necl1后神经元表面突触密度变化.结果 Necl1的表达量可随神经细胞的分化或原代神经元体外培养时间的延长而升高.纯化后的突触小体中存在Necl1的表达.过表达Necl1的293细胞在与原代神经元共培养的情况下可产生突触样结构.直接在原代培养神经元内过表达Necl1可提高神经元间突触密度.结论 Necl1可能在中枢神经系统的神经突触形成中发挥功能.     

MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元活性的影响

目的　探讨 1 甲基 4 苯基吡啶 (MPP+ )对体外培养的中脑多巴胺能神经元的影响。方法　将不同浓度的MPP+ 加入体外培养的中脑多巴胺能神经元培养液中 ,分别测定 [3H]多巴胺和 [3H]胆碱摄取能力及细胞内的多巴胺含量 ,并进行酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色。结果　MPP+ 对体外培养的中脑多巴胺能神经元的 [3H]多巴胺摄取力有明显的抑制作用 (P <0 0 5 ) ;但对[3H]胆碱摄取力无抑制作用 (P >0 0 5 ) ;这种抑制作用在未抑制胶质细胞组明显强于抑制胶质细胞组 (P <0 0 5 ) ;加用MPP+ 后中脑多巴胺能神经元细胞内的多巴胺含量明显减少 (P <0 0 5 ) ,TH阳性细胞明显减少 (P <0 0 5 )。结论　MPP+ 对体外培养的中脑多巴胺能神经元活性有明显的抑制作用     

米诺环素抑制促炎因子生成保护多巴胺能神经元

目的 探讨米诺环素对炎症介导的中脑多巴胺能神经元损伤的影响.方法 应用脂多糖处理中脑原代神经元/胶质细胞培养体系建立SD大鼠多巴胺能神经元损伤的炎症机制模型,于脂多糖处理该培养体系前或后加入米诺环素,免疫细胞化学法检测酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目,液闪测定法测定多巴胺摄取力,并检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(ELISA法)、白介素-1β(IL-1β)(ELISA法)、一氧化氮(NO)(Griess法)和超氧阴离子(细胞色素C还原法)等促炎因子的变化.结果 米诺环素(2～10 μmol/L)前处理对脂多糖(J～ 100 ng/mL)诱导的中脑多巴胺能神经元损伤具有显著的保护作用.呈剂量依赖性;米诺环素( 10μmol/L)后处理对脂多糖(10 ng/mL)诱导的中脑多巴胺能神经元损伤也具有显著的保护作用;米诺环素显著降低促炎因子TNF-α、IL-1β、NO和超氧阴离子的生成.结论 米诺环素在脂多糖处理的中脑神经元/胶质细胞培养体系中可能通过抑制促炎因子生成保护多巴胺能神经元.     

谷氨酸对小鼠胚胎中脑原代细胞培养中多巴胺能神经元损伤的时程效应

目的：探讨谷氨酸兴奋性损伤诱导小鼠胚胎中脑原代培养多巴胺能神经元损伤的时程效应,阐明谷氨酸兴奋性毒性在帕金森病(PD）模型中对多巴胺能神经元损伤的作用。方法：取孕14 d小鼠胚胎的中脑组织制备成细胞悬液,进行原代培养,分为对照组和谷氨酸用药组。细胞在体外培养第10天,加入500 μmol·L^-1谷氨酸并作用15 min,分别于用药后2、 4、 6、24 和48 h进行酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学染色。在显微镜下计数TH染色阳性神经元数量及每个神经元突起数量。结果：对照组中每个培养孔多巴胺能神经元的数量平均为（778.0±18.6）个,谷氨酸用药组2、4、6、24 和 48 h多巴胺能神经元数量平均为（306.0±8.6）、（314.0±15.4）、（298.0±19.1）、（307.0±18.5）及（323.0± 23.8）个。谷氨酸用药各组中多巴胺能神经元数量较对照组明显减少(P<0.05),但谷氨酸用药组2、4、6、24 和 48 h多巴胺能神经元数量比较差异无显著性(P>0.05)。随机选取每组100个多巴胺能神经元的突起进行计数,对照组多巴胺能神经元的突起数量平均为（3.440±0.106）个,谷氨酸用药组2、4、6、 24 和 48 h时多巴胺能神经元突起数量分别为（2.240±0.105）、（2.390±0.103）、（3.070±0.105）、（3.420±0.987）和 （3.420±0.923）个。谷氨酸用药后2和4 h多巴胺能神经元的突起数量较其他各组均明显减少(P<0.05)。结论: 谷氨酸可在体外诱导小鼠胚胎中脑原代培养中多巴胺能神经元的损伤和死亡,是一个相对急性、不可逆的损伤过程,但随着损伤后恢复时间的延长,损伤的多巴胺能神经元形态可恢复。     

甲基苯丙胺对中脑边缘投射多巴胺神经元自发动作电位频率和I_h电流的影响

目的检测高浓度甲基苯丙胺(MA)对中脑边缘多巴胺神经元自发动作电位频率和超极化激活阳离子电流(Ih)的影响。方法应用立体定位仪将逆行示踪剂注入伏隔核区(NAc),标记投射到该区域的中脑边缘多巴胺神经元,并进行酪氨酸羟化酶(TH)染色鉴定;制备中脑脑片,应用膜片钳技术在全细胞模式下检测MA(10μmol/L)对标记神经元自发动作电位频率及Ih的作用。结果中脑边缘投射多巴胺神经元可被准确示踪标记,呈TH阳性,位于腹侧被盖区(VTA);MA可明显降低其自发动作电位频率(P<0.05),并抑制Ih电流(P<0.05)。结论甲基苯丙胺可抑制中脑边缘多巴胺神经元的自发动作电位频率和Ih电流。