绿色荧光蛋白和胸苷激酶基因共表达的慢病毒载体的构建及表达

目的构建人巨细胞病毒广谱启动子（CMV）调控的增强绿色荧光蛋白（EGFP）和自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—tk）共表达的慢病毒载体,获得高效的慢病毒转基因平台。方法采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法,将HSV-tk基因插入慢病毒载体Lenti-ires-EGFP中,构建广谱启动子CMV调控的HSV-tk和EGFP共表达的慢病毒载体（Lenti—CMV-HSV-tk-EGFP）。构建成功后的慢病毒三质粒系统通过磷酸钙沉淀法转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞-293T,28h后收集病毒颗粒,测定病毒滴度,并感染人晶状体上皮细胞株、视网膜母细胞瘤细胞株、神经母细胞株、Hela细胞等,荧光显微镜下观察EGFP的表达。RT-PCR检测HSV-tk与EGFP的表达。结果构建的慢病毒载体Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP能高效转染各类细胞并持续稳定的表达。RT-PCR的结果表明Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP感染细胞能共表达HSV-tk和EGFP,利用该慢病毒载体系统转染人晶状体上皮细胞株时,在复合感染度（MOI）为100时,转染效率接近100％,且传代培养6个月后仍能维持高转染效率。结论成功构建了能转染多种细胞的TK自杀基因和EGFP共表达的慢病毒载体,为眼科自杀基因治疗的实验研究提供高效稳定的转基因技术平台。     

HTRA1 shRNA慢病毒表达载体的构建及感染RPE细胞株的鉴定

 目的 构建HTRA1基因的shRNA慢病毒表达载体,并鉴定HTRA1 shRNA慢病毒感染RPE细胞株的效果。设计 实验研究。研究对象 HTRA1 shRNA慢病毒载体和RPE细胞。方法 设计靶向HTRA1 mRNA的寡核苷酸序列,构建HTRA1 shRNA表达质粒,测序鉴定其序列的正确性。通过载体质粒pGC-LV与辅助质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞包装慢病毒,收集病毒上清,测定滴度。将包装好的HTRA1 shRNA慢病毒感染RPE细胞,设阴性对照和空白对照,采用实时PCR（RT-PCR）和蛋白印迹法（Western Blot）方法检测HTRA1基因的mRNA水平和蛋白质表达水平的变化。主要指标  HTRA1基因的mRNA和蛋白质表达量。结果 DNA测序证实HTRA1 shRNA表达质粒包装了正确的RNA干扰序列。慢病毒滴度测定为8×108 TU/ml。HTRA1 shRNA慢病毒感染RPE细胞后,HTRA1基因的mRNA水平和蛋白质表达水平较空白对照组和阴性对照组均明显下降,差异均有统计学意义。结论 成功构建了HTRA1 shRNA的慢病毒表达载体,该shRNA慢病毒能够有效地抑制RPE细胞株HTRA1基因的表达。     

HTLV-1 Tax 基因真核表达载体的构建及对 RPE 细胞的影响

目的构建人T淋巴细胞白血病病毒-1(human T-cell leukemia virus type1,HTLV-1)Tax基因真核表达载体,在人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达Tax蛋白,观察其对细胞的影响。方法应用基因重组技术构建重组载体PIRES2-EGFP-Tax(PT),鉴定后将重组载体转染入RPE细胞,应用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测细胞内Tax基因和蛋白的表达;通过MTT和流式细胞仪检测质粒(空白载体、PT和Green-Tax)转染RPE细胞24h和48h后对RPE细胞生长活力及细胞周期的影响。结果经双酶切鉴定和测序分析证实成功地构建了HTLV-1Tax真核表达载体;通过RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测到转染Tax重组载体的RPE细胞中有Tax基因和蛋白的表达。质粒转染RPE细胞后,细胞生长活力受到抑制,G1期减少而S期增加。但转染Tax质粒和空白载体,对RPE细胞的生长活力和细胞周期产生相似影响。结论成功构建了HTLV-1Tax基因真核表达载体,并在RPE细胞中表达Tax蛋白;Tax质粒对RPE细胞的影响不排除是转染试剂所致。     

携带Tum5基因的慢病毒表达载体的构建及其在人脐静脉血管内皮细胞中的表达

目的:构建及鉴定Tum5基因慢病毒表达载体,并观察在体外人血管内皮细胞中的表达。方法:采用PCR技术从含有tumstatin基因的质粒克隆模板pSPORT1-Sfi钓取Tum5基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Tum5,通过酶切、测序验证Tum5基因后,将pGC-FU-Tum5质粒和包装质粒pHelper1.0,pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Tum5基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-Tum5,并转染靶细胞人脐静脉血管内皮细胞。通过检测标志蛋白-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的蛋白Tum5进一步验证pGC-FU-Tum5在靶细胞中Tum5的表达。结果:(1)pGC-FU-Tum5中携有正确的Tum5基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-Tum5共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-Tum5;(2)目的基因Tum5能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人脐静脉血管内皮细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到Tum5蛋白在靶细胞中的表达。结论:成功构建了携带Tum5基因的重组慢病毒载体,转染人脐静脉血管内皮细胞后能够稳定表达Tum5基因,为进一步研究Tum5的功能和眼部新生血管疾病的治疗奠定基础。     

慢病毒介导sFlt-1基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究

目的研究可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFlt-1）对小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法将54只C57/6J小鼠随机分为3组,每组18只。将其中2组小鼠于生后第7天开始置于体积分数75%氧环境中,5d后返回正常空气环境中以建立氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型,于17d时玻璃体腔内分别注射1μLlenti-GFP和携带sFlt-1基因片段的重组慢病毒,设为模型对照组和lenti.sFlt-1组,18只正常空气环境中生长的小鼠玻璃体腔内注射1μL磷酸盐缓冲液,设为正常对照组。通过小鼠眼球连续切片苏木精-伊红染色和心脏荧光素灌注视网膜铺片法观察小鼠视网膜新生血管的变化情况,采用免疫组织化学染色法检测视网膜血管内皮生长因子（VEGF）和VEGF受体-2（KDR/Flk-1）的表达变化。结果经RT-PCR扩增的靶基因片段序列与GenBank中的标准序列相吻合。感染后的人RPE细胞能够表达sFlt-1蛋白。正常对照组小鼠视网膜内界膜平整,模型对照组小鼠突破内界膜血管内皮细胞核的数目为（47.26±6.76）,而lenti.sFlt-1组为（5.21±1.93）个,差异有统计学意义（P〈0.05）。视网膜铺片可见新生血管荧光素渗漏表现。慢病毒携带的sFlt-1基因片段转移至模型小鼠视网膜后,发现突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数较模型对照组显著减少,并且视网膜毛细血管扩张、微血管瘤样改变、新生血管等荧光素渗漏表现亦明显减少;同时lenti.sFlt-1组VEGF的表达与模型对照组相比在视网膜神经节细胞层和内核层仍呈现强阳性染色,无明显变化,而KDR/Flk-1的阳性染色显著减少。结论慢病毒介导sFlt-1基因转移能显著抑制小鼠视网膜新生血管的发生。     

TGF-β1对RPE细胞bcl-2/Fas mRNA和Caspase-3表达的影响

目的观察转化生长因子-β1（transforming grawthfactor-β1，TGF-β1）诱导人视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）凋亡的作用机制。方法使用逆转录多聚酶链反应检测不同浓度TGF-β1作用下的人RPE细胞中凋亡相关基因bel-2和Fas mRNA的表达。使用Western-Blot蛋白印迹法检测不同浓度TGF-β1处理过的PRE细胞中Caspase-3蛋白的表达。结果逆转录多聚酶链反应正示，随着TGF-β1岛浓度的增高，人RPE细胞中bcl-2mRNA表达降低，Fas mRNA的表达逐渐增高；Western-Blot结果显示。随着TGF-β1浓度的增高，Caspase-3蛋白表达逐渐增高。结论TGF-β1可上调RPE细胞表面Fas基因的表达，从而激活Caspase-3的活性而诱导RPE细胞凋亡，Caspase-3在RPE细胞凋亡过程中起着非常重要的作用。[眼科新进展2006；26（3）：194-197]     

睫状神经营养因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的构建

背景 间充质干细胞作为基因转移的载体,已在多种疾病的研究中发挥作用.该方法可能为外源性神经营养因子在中枢神经系统,包括在视网膜中的应用提供更有效的途径. 目的 构建慢病毒介导的过表达睫状神经营养因子（CNTF）的骨髓间充质于细胞（BMSCs）,为眼科视网膜、视神经疾病的治疗提供新的方法.方法 对SD大鼠BMSCs进行培养和传代,第4代细胞用于实验.将全基因合成含信号肽的大鼠CNTF基因编码序列克隆至pHⅣ-dTomato慢病毒载体质粒,构建重组质粒CNTF-dTomato.CNTF-dTomato/pHⅣ-dTomato与慢病毒辅助质粒psPAX2及pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装,获得重组慢病毒CNTF-lenti及不含CNTF的control-lenti.以CNTF-lenti或control-lenti感染SD大鼠BMSCs,构建CNTF-BMSCs及空载-BMSCs细胞,根据红色荧光蛋白dTomato表达情况确定病毒感染效率;未感染lenti的BMSCs为空白-BMSCs.用ELISA法测定空白-BMSCs、空载-BMSCs及CNTF-BMSCs细胞培养液中CNTF的质量浓度.将CNTF-BMSCs向成骨和成脂2个方向诱导分化,并用茜素红S（ARS）染色和油红O染色对分化细胞进行鉴定.结果 CNTF-dTomato质粒转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞后,菌落PCR产物大小约为1 033 bp,质粒测序结果显示,pHⅣ-dTomato质粒中插入部分的碱基序列与预期序列一致,显示CNTF-dTomato质粒构建成功.重组慢病毒对BMSCs的感染率达95％.ELISA检测结果显示,感染后2、3、4、7d,CNTF-BMSCs组细胞上清液中CNTF蛋白的质量浓度明显高于空白-BMSCs组及空载-BMSCs组,差异均有统计学意义（均P=0.000）;CNTF-BMSCs组感染后2、3、7d细胞上清液中CNTF质量浓度均明显高于感染后1d,差异均有统计学意义（P=0.013、0.004、0.042）.CNTF-BMSCs经成脂培养基诱导后分化的细胞油红0染色呈红色着染,经成骨培养基诱导后分化的细胞ARS染色可见橘红色钙结节. 结论 本研究成功构建CNTF-dTomato质粒,利用慢病毒载体可成功构建稳定过表达分泌型CNTF的大鼠BMSCs,CNTF-BMSCs具备向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能.     

pEGFP-N1-Endostatin重组质粒的构建及其体外表达

目的构建分泌型人内皮抑素（ES）的真核表达载体pEGFP-N1-Endostatin重组质粒,鉴定其蛋白的体外瞬时表达。方法以pcDNA3-Endo质粒为模板,通过PCR扩增获得人ES基因片段,且在基因前加信号肽序列,将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-ES。采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒。利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾HEK-293细胞中,采用免疫组织化学法和Westernblot法检测转染细胞内及培养上清液中ES蛋白的表达。结果通过HindⅢ和BamHⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明构建出了含ES基因的真核表达载体,且插入片段正确。采用免疫组织化学法和Western blot法检测表明HEK-293细胞内及培养上清中存在相对分子质量为20 000的人ES蛋白表达。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-ES真核表达载体,转染HEK-293细胞后可稳定有效地分泌人ES蛋白。     

靶向Slug基因腺相关病毒载体的构建及其抑制视网膜母细胞瘤细胞生长的体外研究

目的 构建并制备携带目的 基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.方法 首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316-EGFP-Slug-siRNA克隆为模板扩增EGFP-Slug-siRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后回收PCR产物.酶切pSNAV2.0-LacZ-α载体质粒,并与上述产物进行连接.转化感受态大肠杆菌DH5α,得到重组质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,酶切和测序对其进行鉴定.建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA,大规模制备rAAV2-EGFP-Slug-siRNA并对其纯化、鉴定和滴度测定.将体外培养的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)细胞转染rAAV-EGFP-Slug-siRNA和pSNAV2.0-EGFP空载体.鸡胚绒毛尿囊膜实验检测血管生成,MTT比色法检测细胞存活率,建立鸡胚绒毛尿囊移植瘤.结果 携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-SIug-siRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确.将构建成功的载体质粒与重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc/UL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出重组腺相关病毒rAAV2-EGFP-Slug-siRNA,经检测目的 片段插入成功,滴度为90.21×109 puf.Slug-siRNA有效抑制RB细胞内Slug表达后,肿瘤血管密度明显降低,血管生成被抑制,细胞存活率明显降低.实体瘤血管生成和生长受到抑制.结论 成功制备出高滴度的携带目的 基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.干扰Slug可抑制肿瘤血管生成,抑制RB细胞的生长增殖.     

绿色荧光蛋白逆转录病毒及其介导的视网膜色素上皮细胞基因转移研究

目的 制备携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)基因的逆转录病毒,感染原代与建株的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE)细胞,评价逆转录病毒对人RPE细胞的感染能力,为视网膜病变的基因治疗奠定基础。方法 分离编码GFP的cDNA片段并插入逆转录病毒载体pLNCX,借助脂质体将重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转入单嗜性及双嗜性包装细胞,G418筛选抗性克隆,分离GFP表达水平最高的克隆;收集含病毒颗粒的上清液感染NIH3T3及体外培养的人原代与建株的RPE细胞。结果 重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转染各种包装细胞后,可产生GFP逆转录病毒。由双嗜性包装细胞产生的GFP逆转病毒能够感染原代与建株的人RPE细胞,GFP基因可持续在RPE细胞内表达。结论 逆转录病毒能够简便、快速、稳定将目的基因转入RPE细胞,可作为眼底病变基因治疗介导目的基因转移的重要工具。     

可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1不同基因片段对视网膜新生血管的抑制作用

目的 观察可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1(sFlt-1)不同基因片段对小鼠视网膜新生血管(RNV)的抑制作用.方法 构建携带sFlt-1(2～3)、(2～4)免疫球蛋白样区域编码基因的重组慢病毒sFlt-1(2～3)和sFlt-1(2～4).鼠龄7 d的C57/6J小鼠96只,数字表法随机分为4组,每组24只.1组为正常对照组;2组为模型对照组;3组为sFlt-1(2～3)组;4组为sFlt-1(2～4)组.2、3、4组置于(75±2)%氧浓度环境,出生后12 d再置于正常空气下饲养,并分别玻璃体腔注射空病毒、慢病毒sFlt-1(2～3)和sFlt-1(2～4)各1μl.出生后17 d,荧光素灌注造影行视网膜铺片,观察视网膜血管改变;视网膜切片行苏木精-伊红染色,计数小鼠RNV细胞核数;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测视网膜血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体-2含激酶插入区受体/胎肝激酶-1(KDR/Flk-1)的蛋白表达.结果 出生后17 d,与2组比较,3、4组视网膜荧光渗漏面积、RNV、突破内界膜(ILM)的血管内皮细胞核数均明显减少(P<0.01);VEGF蛋白表达无明显变化(P>0.05),KDR/F1k-1蛋白表达明显下降(P<0.01).结论 sFlt-1(2～3)和sFlt-1(2～4)基因片段能明显抑制氧诱导小鼠RNV的形成,sFlt-1(2～3)效果更为显著.     

sFlt-1基因片段对缺氧、高糖下人脐静脉血管内皮细胞及ERK1/2信号通路的影响

目的比较可溶性血管内皮生成因子受体1（sFlt-1）胞外第2～3区和第2～4区对缺氧、高糖条件下血管内皮细胞增生、迁移及细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK 1/2）信号转导通路的影响。方法以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法从人胎盘组织cDNA文库中扩增出sFlt-1胞外第2～3区和第2～4区,连接入pcDNA3.1载体后电泳,并进行测序鉴定;以羧甲基化葡聚糖（CMD）纳米磁颗粒为基因载体分别携带2种重组质粒,转染人脐静脉内皮细胞（UVECs）后分别进行正常、缺氧和高糖条件下的培养。MTT法检测各组人UVECs的增生;光学显微镜下观察人UVECs的迁移;Western blot法检测各组人UVECs ERK1/2信号通路下游特异性磷酸化激酶ERK 1/2（p-ERK 1/2）蛋白的表达。结果经过pcDNA3.1/sFlt-1（2-3）或pcDNA3.1/sFlt-1（2-4）转染的人UVECs在缺氧和高糖条件下的增生、迁移及p-ERK 1/2蛋白的表达较转染前均明显下降（P〈0.01）;2种重组质粒对缺氧和高糖条件下人UVECs增生、迁移及ERK 1/2信号转导通路的影响差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 sFlt-1受体胞外第2～3区和第2～4区均可抑制缺氧和高糖条件下人UVECs的增生、迁移及ERK1/2信号通路的转导,且2种受体基因片段的作用无明显差异。     

缺氧对小鼠角膜血管内皮生长因子及可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1表达的影响

目的观察缺氧对小鼠角膜组织中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）及可溶性fins一样酪氨酸激酶受体-1（soluble fms-like tyrosine kinase receptor-1, sFlt-1 ）表达的影响并探讨两者之间的关系。方法实验用健康雌性成年昆明小鼠70只，分为缺氧组和正常对照组，缺氧仓的氧气体积分数为8％～10％，缺氧时间分别为1、3、5、7、10、14d。用变性Western blot技术检测小鼠在缺氧条件下角膜组织中总VEGF表达的变化，用非变性Western blot技术检测小鼠在缺氧条件下角膜组织中游离及结合VEGF表达的变化，用逆转录聚合酶链反应技术检测小鼠在缺氧条件下角膜组织中VEGF、sFlt-1、缺氧诱导因子-1（hypoxia in-ducible巧玲珑factor-1，HIF-1）的基因表达变化。结果缺氧14d内未见小鼠角膜新生血管。缺氧组总VEGF及结合VEGF表达增加，随着缺氧时间的延长而增强，与正常对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05），但缺氧14d内均未见游离VEGF表达。缺氧组VEGF、sFh-1、HIF-1的基因表达均增加，随着缺氧时间的延长而增强，与正常对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），其中VEGF的基因表达与HIF．1的基因表达呈正相关（r=0．993），sFlt-1的基因表达与HIF-1的基因表达呈正相关（r=0．997）。结论缺氧可以诱导小鼠角膜组织中VEGF和sFlt-1表达的增加，在缺氧的条件下，小鼠角膜组织中VEGF和sFlt-1呈平衡状态。sFlt-1可作为一种内源性VEGF拮抗因子治疗眼部新生血管性疾病。（中国眼耳鼻喉科杂志，2008，8：286-288）     

缺氧对培养的人视网膜色素上皮细胞中血管生成素-2表达的影响

背景脉络膜新生血管（CNV）是导致一些眼底疾病视力丧失的主要原因,而血管生成素2（Ang-2）与血管生成的关系较为密切。目前在缺氧条件下人视网膜色素上皮（RPE）细胞上Ang-2的表达情况与CNV发病的关系研究较少。目的观察缺氧对体外培养的人RPE细胞中Ang．2表达的影响,探讨Ang-2在CNV形成中的可能作用。方法人RPE细胞经培养和传代,取第4～7代细胞以5×10^7个／L密度接种于培养皿,常氧对照组不加CoCl2,缺氧组换以含终浓度为200μmol／LCoCl2的培养基5ml建立RPE细胞化学缺氧模型,分别于加药导致缺氧后0．5、1、2、4、6、12和24h终止缺氧。采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测缺氧不同时间对体外培养的人RPE细胞Ang-2mRNA表达的影响;采用酶联免疫吸附反应（ELISA）法检测缺氧不同时间对体外培养的人RPE细胞上清液中Ang-2蛋白质量浓度的影响。结果人RPE细胞复苏后存活率达90％,第4代传代细胞中色素很少,细胞形态多为梭形。不同培养条件组人RPE细胞中Ang-2mRNA／β-actin mRNA值的总体比较差异有统计学意义（F=1086．30,P=0．00）;缺氧条件下培养0．5h后人RPE细胞中Ang-2mRNA／β-actin mRNA值开始明显增加,至缺氧培养后4～6h达高峰,与常氧对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）;缺氧培养24h后Ang-2mRNA／β-actin mRNA值接近常氧对照组。ELISA分析结果表明,不同培养条件下人RPE细胞培养基上清液中Ang-2蛋白的总体比较差异有统计学意义（F=1034．00,P=0．00）,缺氧条件下培养0．5h后人RPE细胞中Ang-2蛋白的质量浓度开始明显升高,6h达到高峰,与常氧对照组相比,差异均有统计学意义（P〈0．05）;缺氧培养24h后Ang-2蛋白的质量浓度接近常氧对照组。结论缺氧可显著上调体外培养的人RPE细胞中Ang-2的表达,Ang-2于缺氧早期呈高表达,提示Ang-2参与了CNV的形成,可能在CNV形成过程的早期阶段发挥作用。     

两种fms-样络氨酸激酶受体-1基因片段对磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白酶B之间信号通路的影响

目的 观察可溶性fms-样络氨酸激酶受体-1(sFlt-1)基因胞外第2～3区和2～4区对缺氧、高糖环境下视网膜血管通透性及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白酶B(PI3K/Akt)之间信号通路的影响.方法 构建真核表达质粒编码增强型绿色荧光蛋白质粒(pcDNA3.1-EGFP)/s Flt-1(2～3)和pcDNA3.1-EGFP/s Flt-1(2～4),采用酶切、电泳及基因测序鉴定.将实验分为正常对照组、缺氧组和高糖组进行.以羧甲基化匍聚糖(CMD)纳米磁颗粒为基因载体,分别携带两种重组质粒转染缺氧、高糖条件下培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC).采用分光光度计检测各组兔视网膜血管对伊凡思蓝(EB)染料的渗漏量.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫蛋白印迹(Western blot)法分别检测各组细胞PI3K/Akt信号通路下游特异性磷酸化激酶Akt(p-Akt)mRNA和蛋白的表达.结果 缺氧组和高糖组注射转染细胞上清液后,视网膜血管EB渗漏量较正常对照组明显增加(t=2.476,2.515;P值均＜0.01).缺氧组和高糖组转染了pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1(2～3)和pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1(2～4)后,视网膜血管EB渗漏量较未转染明显降低(t=2.598,2.679,2.386,2.732;P值均＜＜0.01).缺氧组、高糖组HUVEC p-Akt mRNA表达较正常对照组明显上调(t=2.612,2.545;P值均＜0.01),转染pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1(2～3)和pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1(2～4)后明显下调(t=2.512,2.189,2.372,2.687;P值均＜0.01).缺氧组和高糖组HUVEC p-Akt蛋白表达较正常对照组明显上调(t=2.376,2.712;P值均＜0.01),转染pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1(2～3)和pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1(2～4)后明显下调(t=2.259,2.391,2.399,2.413;P值均＜0.01).结论 sFlt-1受体胞外第2～3区和2～4区均可抑制缺氧、高糖环境下的视网膜血管通透性增高和PI3K/Akt通路的信号传导.     

羊膜对人视网膜色素上皮细胞增生和分化的影响

背景人视网膜色素上皮（RPE）细胞移植治疗视网膜变性性疾病是目前的研究热点之一,许多生物载体可制备RPE细胞单层,但多存在着细胞毒性、稳定性差及免疫反应等问题。目的检测羊膜对人RPE细胞增生和分化的影响,探讨其作为人RPE细胞层载体进行移植的可能性。方法将RPE细胞系ARPE-19细胞株用含质量分数10％胎牛血清的DMEM／F12培养基进行培养和传代,8～12代细胞用于实验。将传代细胞分为2个组,一组细胞接种于去上皮羊膜作为实验组,另一组细胞直接在培养孔内进行培养作为对照组。分别于接种后24、48、72、96h行MTT实验,测定RPE细胞的吸光度（A492）值以评估两组细胞在增生能力方面的不同;培养3周后的细胞层行苏木精-伊红染色,检测细胞在不同培养载体上是否存在形态学方面的区别;分别收集同一孔中生长于羊膜和培养板表面的细胞,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测色素上皮衍生因子（PEDF）、钙黏蛋白（N—cadherin）、β-连环蛋白（β—catenin）以及细胞连接相关蛋白的表达情况;同时收集培养3周时的细胞行透射电子显微镜和扫描电子显微镜检查,比较不同载体培养的ARPE-19细胞在超微结构方面的区别。结果与对照组相比,实验组细胞增生的速度明显变缓,两组细胞增生情况比较差异有统计学意义（F=41．760,P=0．000）。苏木精-伊红染色结果显示,同一培养孔内实验组的细胞密度明显低于对照组,说明羊膜对ARPE-19细胞增生的影响不是通过细胞分泌的可溶性因子的作用。RT—PCR结果显示,实验组细胞连接相关蛋白claudin 1、N—cadherin和PEDF mRNA在培养细胞上的表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义（t=15．828,P=0．000;t=6．839,P=0．002;t=14．667,P=0．000）;Connexin 43的表达低于对照组,差异有统计学意义（t=3．358,P=0．024）。超微结构分析发现羊膜载体上的细胞呈典型的多边形RPE细胞表型,分化现象明显,而普通培养板培养的RPE细胞形态主要呈梭形,细胞层厚薄不均。结论去上皮羊膜为载体培养的RPE细胞增生速度变慢,但培养的细胞分化程度较高,提示羊膜可作为RPE细胞体外培养的良好载体,用于制备移植所需功能成熟的RPE细胞片层。     

腺病毒介导人内皮抑素感染视网膜色素上皮细胞的可行性研究

目的探讨以腺病毒为载体对体外培养的人视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelial，hRPE）细胞进行人内皮抑素（human endostatin，hES）感染，获得高效表达hES转基因细胞的可行性。方法常规培养hRPE细胞，传代至第3～第5代后．应用携带有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein．GFP）的hES重组腺病毒按感染复数30进行感染。培养24h后，在荧光显微镜下计数培养的hRPE细胞的GFP表达阳性率：用免疫组织化学法观察hES在已感染hRPE细胞中的表达情况；提取hRPE细胞总RNA，采用RT—PCR技术对产物行琼脂糖凝胶电泳：用Western blot法检测感染hRPE细胞培养上清液中hES的表达水平。结果hES重组腺病毒感染后，hRPE细胞形态正常，感染后24h，GFP即呈100％表达．弥漫整个胞质；免疫组织化学法观察可见，hRPE细胞浆内呈棕黄色的阳性反应．而在感染空载腺病毒的对照组中细胞胞浆无染色；RT—PCR反应可见，细胞裂解产物中有hES阳性条带：Western blot法检测结果表明，培养上清液中有hES蛋白的表达。结论hES重组腺病毒载体能有效感染体外培养的hRPE细胞．并稳定表达hES蛋白。     

人血管生成素-1基因真核表达载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达

目的构建人血管生成素-1（Ang-1）基因的真核表达载体,并检测其在人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）中的表达,为进一步研究Ang-1防治糖尿病视网膜病变（DR）的血管渗漏提供实验依据。方法提取人胎盘组织中的总RNA,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）特异性扩增Ang-1编码区序列,亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1。将pEGFP-N1-Ang-1导入UC-MSCs,然后应用含质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基对人UC-MSCs进行培养,荧光显微镜下观察Ang-1在人UC-MSCs中的表达,Western blot法检测重组体的表达。结果 RT-PCR法成功克隆人Ang-1基因编码区序列,纯度为1.82;PCR扩增的片段长度为1.5 kb,与预期片段大小相近。双酶切鉴定法可识别重组pEGFP-N1-Ang-1转染质粒,目的基因与预期基因序列的同源性为100%。人UC-MSCs转染的pEGFP-N1/Ang-1质粒能够表达Ang-1蛋白,呈现绿色荧光。转染pEGFP-N1的人UC-MSCs和对照组人UC-MSCs均未见相应的Ang-1蛋白表达。结论成功地克隆出人的Ang-1基因并构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ang-1,为将Ang-1基因转染至人UC-MSCs治疗DR奠定了基础。