低温果胶酶的纯化及酶学性质的研究

进行了低温果胶酶产生菌的筛选,并对低温果胶酶的酶学性质、纯化及动力学常数进行了研究。结果表明:该酶最适酶反应温度25℃,最适酶反应pH为5.8;酶液的pH稳定范围在5～6.4;在25℃保温3h,酶活降至50.5%,在35℃保温2h,酶活降至55.1%,在45℃保温1.5h,酶活降至48.7%,在55℃保温1h,酶活降至43.1%;金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+对低温果胶酶有激活作用,而Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+对低温果胶酶有强烈的抑制作用;当以果胶为底物时,该酶的动力学常数Km为27.86mg/mL,Vmax为152.13μmol/(min·mL);采用不同的处理方法均可使低温果胶酶得到纯化,但40%～85%的硫酸铵分级沉淀纯化效果最好。     

镰刀菌Fo47来源木聚糖酶的异源表达、酶学性质及其对全麦面包品质的影响

为开发新型面粉改良酶制剂,该研究对通过基因组挖掘手段筛选出的一种新型木聚糖酶——镰刀菌Fo47来源木聚糖酶（Fusarium oxysporum Fo47 xylanase,FXYL）,利用毕赤酵母X33首次对其进行异源表达,分析重组FXYL的酶学性质,并初步探究重组FXYL对全麦面包品质的影响。结果表明,摇瓶发酵144 h后,重组毕赤酵母发酵上清液木聚糖酶酶活力为779.64 U/mL;经过Ni-NTA柱层析纯化后,重组FXYL的比酶活为764.33 U/mg;酶学性质研究表明,重组FXYL最适反应pH值为5.0,最适反应温度为45℃,在中温（＜40℃）和pH 5.5～10.0表现出较好的稳定性。重组FXYL的酶学性质较适合面团发酵的偏酸环境;添加重组FXYL能够显著提高全麦面包的比容和弹性,降低全麦面包的硬度和咀嚼性,有望发展为一种新型面粉改良剂。     

重组梅花鹿来源Cu/Zn-SOD的分离纯化及酶学性质

超氧化物歧化酶(SOD)能特异性清除氧自由基,对保护细胞免受氧化损伤具有重要作用。本文构建了表达重组梅花鹿来源Cu/Zn-SOD的毕赤酵母工程菌GS115-p PIC9K-SOD,并对重组SOD进行分离纯化和酶学性质研究。通过10 ku中空纤维柱超滤、DEAE弱阴离子交换层析、高效凝胶色谱分离纯化,重组Cu/Zn-SOD的比活力为1 7647.1 U/mg,回收率为36.84%。对重组Cu/Zn-SOD的酶学性质研究表明,其最适反应pH 8.0,最适反应温度30℃;在pH 5~9之间较为稳定,保温1h后仍能保留80%以上的酶活力;60℃保温1 h酶活保持在90%以上,70℃保温20 min残余酶活力仍有70%以上。重组Cu/Zn-SOD在中性条件下对蛋白酶耐受性较好,然而易受胃酸的酸解导致酶活力丧失。     

嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶A的H297F定点突变、表达及酶学性质变化

利用重叠延伸PCR技术对嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶XynA活性中心附近的H297位点突变为F。将XynA及XynA_(H297)F在大肠杆菌BL21(DE3)中实施了表达、纯化以及酶学性质研究。比较研究野生型木聚糖酶XynA和突变体XynA_(H297)P的酶学性质发现,突变前后木聚糖酶的最适反应pH值均为5.5,在pH 4~10的缓冲液中处理20 h后残余酶活均在90%以上,均具有较好的pH稳定性。XynA最适反应温度为70℃,80℃处理20min后只有10%的残余酶活;XynA_(H297)最适反应温度为75℃,且相同处理条件下XynA_(H297)仍具有30%左右的残余活性,说明突变体的热稳定性有一定程度提高。与XynA相比,XynA_(H297)F的动力学参数Km、Vmax和Kcat均增大,说明突变后酶对底物的亲和力降低,但催化速率有所提高。     

串珠镰孢菌来源的角质酶基因的克隆表达及其酶学性质

克隆一个来源于串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme Sheld)的角质酶基因,该基因全长693 bp,编码231个成熟的氨基酸。克隆的角质酶基因构建到pPIC9K质粒,获得重组表达载体,转入毕赤酵母(Pichia pastoris Gs115)中进行高效表达。经甲醇诱导96 h,测得重组酶酶活为71.68 U/mL,经纯化获得比活力为2490.1 U/mg。对纯化后的角质酶进行酶学性质分析结果表明,其最适反应pH为9.0,在pH5.0~9.0范围内之间重组角质酶的酶活相对稳定;最适反应温度为35 ℃,在40 ℃条件下保温1 h酶活力保持70%以上。KCl、Triton X-100、MnCl₂、SDS对该酶活有促进作用,NaCl、BaCl₂、CuSO₄、Tween-20、FeSO₄、ZnSO₄、NiCl₂、EDTA、Tween-80对该酶活有抑制作用。     

嗜热芽孢杆菌2004产β-甘露聚糖酶产酶条件优化和酶学性质

对芽孢杆菌2004 β-甘露聚糖酶进行了产酶条件优化、初步纯化及其酶学性质的研究.条件优化结果:1.5 g/dL槐豆胶,2 g/dL蛋白胨,培养温度为40 ℃,250 mL三角瓶装液量为70 mL,其他因素影响不大.此最佳产酶条件下,嗜热芽孢杆菌2004 12 h的产酶水平平均为41.92 U/mL,比原来提高了30倍.培养液离心得到上清液,经硫酸铵沉淀,Sephadex G-200分子凝胶过滤和DEAE纤维素离子交换,酶比活达到722 U/mg,纯化了23.94倍,收率为35.1 %.该酶的最适反应温度为70～80 ℃;反应的最适pH值为5.8～6.0;pH值稳定范围为4.0～9.0.金属离子Mg2 和K 对酶略有激活作用.适当浓度的Mg2 不仅对酶有激活作用,还对酶的热失活具有保护作用.     

草菇半纤维素酶系统的诱导、分布及初步定性

以蔗糖、果胶、羧甲基纤维素或木聚糖为碳源培养草菇 (Volvariellavolvacea) ,对所产生的半纤维素酶进行初步研究发现 ,半纤维素酶系主要是由木聚糖诱导 .半纤维素酶中的木聚糖酶分布在胞外 ,木糖糖苷酶分布在胞内 ,阿拉伯糖苷酶胞内胞外都有分布 .木聚糖酶的最适反应温度为 6 0℃ ,最适反应 pH为 5 .8,在pH 5 .4～ 7.0时比较稳定 ,保温 1h酶活的半衰温度是 5 5℃ .木糖糖苷酶的最适反应温度为 5 5℃ ,最适反应 pH为 6 .6 ,在 pH 6 .6～ 7.4时比较稳定 ,保温 1h酶活的半衰温度是 5 2℃ .阿拉伯糖苷酶的最适反应温度为 6 0℃ ,最适反应pH为 5 .0 ,在 pH 4 .6～ 6 .2时比较稳定 ,保温 1h酶活的半衰温度为 6 0℃ .     

甘薯叶中SOD的分离纯化研究

通过比较几种提取的方法对纯化的倍数和酶活收率的影响,得到了甘薯叶上清液的较优提取纯化方法,即采用热变性,有机物丙酮沉淀及凝胶过滤纯化相结合的方法。热变性最佳时间为15min、温度为60℃,加入丙酮的量为其粗酶液的1.4倍。经凝胶过滤纯化,最终SOD酶活收率为61.5%,蛋白质去除率为97.9%,比活力达到1126.87U/mg,纯化倍数为30.32。     

木聚糖酶基因XynB在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

目的:将来源于Thermotoga maritima的酸性耐高温木聚糖酶基因Xyn B通过密码子优化整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高效表达木聚糖酶Xyn B的毕赤酵母工程菌并研究其酶学性质。方法:通过分子克隆手段构建目的基因重组质粒以及二拷贝重组质粒,并将重组质粒导入毕赤酵母进行发酵表达,用DNS法测定发酵液酶活,并对酵母工程菌分泌的木聚糖酶进行一系列的酶学性质研究。结果:木聚糖酶的最适p H和温度分别为6.0和60℃;在p H4~6之间,稳定性较好,相对比酶活均在80%以上;在60℃和70℃保温2 h残留酶活分别为80%和70%左右;Co~(2+)对木聚糖酶活性有较明显的促进作用,Fe~(2+)、K~+和Zn~(2+)对酶的活性有微弱的促进作用,而Cu~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Na~+对木聚糖酶活性有不同程度的抑制作用。TLC检验该木聚糖酶可以将木聚糖水解为二糖和少量单糖。通过10 L发酵罐发酵,最大酶活达到了8000 U/m L。结论:木聚糖酶在毕赤酵母中实现了高效表达,并获得了木聚糖酶的最适反应条件等一系列酶学性质,该酶性质优良适合用于饲料添加剂。     

草菇木聚糖酶的纯化提取和酶学性质

草菇产胞外木聚糖酶通过各级浓缩和纯化,获得接近电泳纯蛋白.通过SDS PAGE测得相对分子质量为24500.木聚糖酶为糖基化修饰的蛋白,含有质量分数20.24%的糖.O 糖基化能增加木聚糖酶的活性,O 和N 糖基化都能提高木聚糖酶的稳定性.5min反应,草菇木聚糖酶在60℃和pH值5.65时活性最高.在此条件下,该酶的Km值为3.87mg/mL,Vmax为1250IU/mg.纯酶的稳定pH值为6.54,57℃时半衰期为1h.     

嗜热木聚糖酶的克隆表达及其在酶解生产低聚木糖中的应用

目的:为了获得一种耐高温的木聚糖酶,并对其生物特性进行表征,使其能够更有效地应用于低聚木糖的制备。方法:首先通过生物信息学分析,确定来自厌氧孢子菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903的木聚糖酶(CsXynB)基因序列,然后扩增CsXynB基因,以pET-20b为载体,构建重组质粒,将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,重组酶通过热处理和镍柱亲和层析纯化获得纯酶,将纯酶用于后续酶学性质和降解木聚糖的研究。结果:通过生物信息学方法研究表明,CsXynB属于糖苷水解酶第10家族。CsXynB的最适反应温度为80℃,最适反应pH为6.5。在65℃以内,pH为5.5~7.5的条件下重组木聚糖酶的稳定性较高。以榉木木聚糖为底物时,CsXynB的K_m,V_max和K_cat值分别为1.8 mg/mL,46.0 U/mg和60.7 s-1。在65℃、pH6.5条件下,以榉木木聚糖为底物,木聚糖酶CsXynB反应1 h,生成的低聚木糖的主要成分为木二糖和木三糖。结论:CsXynB是一种极具特点的耐高温木聚糖酶,可以催化水解木聚糖生成高含量的木二糖和木三糖,在生产低聚木糖的应用中具有潜在价值。     

构巢曲霉产植酸酶的酶学特性分析

从构巢曲霉AnP-16菌株发酵液中纯化单一组分的耐热耐酸植酸酶,并对酶学特性进行分析,为其在食品工业中的应用提供理论依据。通过硫酸铵盐析、离子交换层析和疏水层析纯化植酸酶,SDS-PAGE电泳测定其分子量。结果表明,从该菌株发酵液中纯化到了单一组分的植酸酶,纯化倍数60.8倍、回收率41.6%,酶分子量约52 kDa。植酸酶最适作用温度和pH分别为55 ℃和pH4.0,在pH3.0~6.0范围酶活性较高,pH2.0~7.0下孵育3 h,仍能保持80%以上活性。植酸酶耐热性好,70 ℃孵育1 h仍能保持81%活性。Hg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+ 5 mmol/L浓度下对酶活性有明显抑制作用,但Ca2+和Mg2+在1和5 mmol/L浓度时均增强酶活性;有机溶剂甲醇和乙醇在2%浓度有激活作用;SDS抑制酶活性,但其它表面活性剂(Triton X-100和Tween 80)和有机溶剂(丙酮和异戊醇)对酶活性无明显影响。植酸酶有宽泛的底物特异性,但对植酸钠的催化活性最强,其K_m值为0.576 mmol/L。基于植酸酶耐酸耐热及宽广的底物催化活性,其有望应用于粮油食品加工领域,提高食品的营养价值。     

Sulfolobus tokodaii strain 7高温酸性α-淀粉酶基因在大肠杆菌中克隆表达及其酶学性质

以超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7基因组DNA为模板,通过PCR扩增高温酸性α-淀粉酶基因ST0817,将此基因克隆至表达载体pET15b,并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21-CodenPlus(DE3)-RIL,获得重组大肠杆菌工程菌。通过热处理、镍柱亲和层析和分子筛层析,得到纯化重组酶,SDS-PAGE分析表明,该酶分子量为53.0 kDa。酶学性质研究表明,该酶最适温度和pH分别为75℃和5.5;具有较强的热稳定性和pH稳定性,在85℃处理8 h保持50%左右活力,在pH 5.2处理120 min仍保持50%活力。此酶对不同底物水解活性不同,直连淀粉>可溶性淀粉>支链淀粉>β-极限糊精>糖原>环糊精>普鲁兰糖;该酶对有机溶剂、变性剂和金属离子具有一定抗性。     

酸性木聚糖酶固态发酵条件与粗酶性质研究

利用单因素和正交试验对实验室选育的黑曲霉XZ-3S(Aspergillus niger XZ-3S)菌株的发酵条件进行了研究.得到试验因素的产酶条件为天然原料麸皮与玉米芯的比例为5∶3,接种量1.0％(孢子悬液,孢子浓度5×107个/mL),料水比例1∶1.7,培养基初始pH值为7.5,培养温度28℃、培养时间65h,其间翻曲2～3次,在上述条件下木聚糖酶的活力可达23612.38IU/g干曲.酶学性质初步研究显示,酶的最适反应温度和pH值分别为50℃和5.0,低于50℃、pH3.0～8.0酶稳定.     

Characterization of a thermostable family 10 endo-xylanase (XynB) from Thermotoga maritima that cleaves p-nitrophenyl-beta-D-xyloside

Thermotoga maritima MSB8 possesses two xylanase genes, xynA and xynB. The xynB gene was isolated from the genomic DNA of T. maritima, cloned, and expressed in Escherichia coli. XynB was purified to homogeneity by heat treatment, affinity chromatography and ion-exchange column chromatography. The purified enzyme produced a single band upon SDS-PAGE corresponding to a molecular mass of 42 kDa. At 70 degrees C, the enzyme was stable between pH 5.0 and pH 11.4, and it was stable at temperatures of up to 100 degrees C from pH 7.0 to pH 8.5. At 50 degrees C, XynB displayed an optimum pH of 6.14 and at this pH the temperature for optimal enzyme activity was 90 degrees C. XynB exhibited broad substrate specificity and was highly active towards p-nitrophenyl-beta-D-xylobioside with K(m) and k(cat) values of 0.0077 mM and 5.5 s(-1), respectively, at 30 degrees C. It was also active towards p-nitrophenyl-beta-D-xyloside. The initial product of the cleavage of p-nitrophenyl-beta-D-xyloside was xylobiose, indicating that the major reaction in the cleavage was transglycosylation, not hydrolysis.     

新型耐热耐酸普鲁兰酶的分离纯化与酶学特性分析

从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF发酵液中分离纯化普鲁兰酶(PulXF)并研究其酶学性质。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,纯化得到一种电泳纯的PulXF。纯化倍数8.16倍,比活力为309.28 U/mg。SDS-PAGE检测得单条带,表明PulXF为单亚基蛋白,分子量63.7 kDa。在50~80 ℃,pH4.5~8.0范围内,酶能保持高活性,最适反应温度60 ℃,最适pH5.0。在较广的pH范围内(pH3.0~8.0),28 ℃下,经过24 h酶活能保持80%以上活性。K_m值和V_max分别为0.92 mg/mL和11.90 μmol/min。酶活测定及TLC分析显示PulXF对普鲁兰多糖有强水解活性,终产物麦芽三糖;对支链淀粉和可溶性淀粉有较弱活性,对直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精和糖原无活性。表明从泡盛曲霉XF分离的PulXF属于I型普鲁兰酶。Ca2+、Zn2+和Mg2+能够促进酶的活性,其中Ca2+激活作用最强。而PulXF在5%浓度的SDS、CTAB、Tween 80和30%的乙醇中保持高稳定性。基于PulXF在苛刻环境下的高稳定性及高活性,很有希望在淀粉加工、食品饮料等领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中使用。     

碱性木聚糖酶产生菌株的分离鉴定与产酶分析

目的：分离1?株高产碱性木聚糖酶菌株。方法：以木聚糖为唯一碳源,从造纸厂活性污泥中筛选1?株高产碱性木聚糖酶细菌,采用3,5-二硝基水杨酸法定糖法测定菌株产木聚糖酶的活力,并通过生理、生化特征以及16S?rRNA基因序列分析比对对菌株进行鉴定。结果：菌株YD01所产木聚糖酶的最适pH值为8.0,最适温度为50?℃;在pH?10和80?℃时,仍有87%和85%的剩余酶活力,具有较好的耐碱性及较高的热稳定性。最终发酵产酶水平为36.85?U/mL。结论：鉴定该菌株为蛾微杆菌（Microbacterium imperiale）,所产生的木聚糖酶具有较高的碱耐受性和热稳定性。     

黄杆菌褐藻胶裂解酶的高效表达及其在褐藻寡糖制备中的应用

研究黄杆菌褐藻胶裂解酶基因（rFlAlyA）在枯草芽孢杆菌中的高效表达,高密度发酵48 h最高酶活力为2 550 U/mL,蛋白质量浓度达4.5 mg/mL。经(NH4)2SO4沉淀和SP强阳离子交换柱纯化后得到电泳级纯酶,分子质量约为30 kDa。褐藻胶裂解酶rFlAlyA最适pH值为7.5,在pH 4.0～11.0范围内可保持80%以上酶活力;最适温度为50 ℃,在50 ℃及以下可保持80%以上酶活力。底物特异性分析表明,rFlAlyA特异性降解聚甘露糖醛酸片段,最短链底物为甘露糖醛酸三糖。rFlAlyA在最适条件下酶解褐藻酸钠4 h后还原糖质量浓度达33 mg/mL,底物转化率为70.1%,电喷雾电离-质谱分析酶解产物的聚合度（degree of polymerization,DP）为1～8,离子色谱分析显示DP=3时相对含量最高,为34.0%。结果表明,经枯草芽孢杆菌高效表达的rFlAlyA可用于制备褐藻寡糖。     

β-呋喃果糖苷酶的生产及对甜菊苷和莱鲍迪A苷的酶法改性研究

用Arthrobacter sp.10137生产一种β-呋喃果糖苷酶(FFase),SDS-PAGE检测纯化后的酶分子质量为48.7ku左右,酶的比活力为19.81U/mg。纯酶的最适pH值和温度分别为6.5和40℃,并在pH6～8及40℃以下稳定。纯酶对甜菊苷和莱鲍迪A苷改性的最适条件是:酶量为15U/mL,莱鲍迪A苷和甜菊苷与蔗糖的摩尔比分别为0.0005:1和0.0012:1,反应时间为15h。在最适条件下,莱鲍迪A苷和甜菊苷的最大转化率分别为69.4%和72.0%。     

根霉胞内α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp.A01的菌丝体破碎液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了54.8倍,总酶活回收率达到27.3%,在SDS-PAGE上显示相对分子质量为85.6 ku的单一条带,凝胶过滤表明该酶表观相对分子质量为302 ku。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为55℃,表观Km值为(0.242±0.027)mmol/L,表观kcat/Km值为4.089×105L/(mol.s);对蜜二糖和棉子糖有弱的水解作用,水解速度依次为138.3μmol/(h.mg)、19.7μmol/(h.mg)。水解活性受Fe2+和Fe3+的显著激活,但受Mn2+、Cu2+、Hg+和Mg2+等离子的强烈抑制。该酶活性在pH4.0～8.2保持稳定,在50℃时保温90 min,残余酶活达到了48%。