副溶血弧菌毒力基因的检测研究

为了解不同来源的副溶血弧菌携带毒力基因的情况,对杭州地区临床和海产品中分离到的174株副溶血弧菌采用ehelex100法提取基因组DNA,并进行溶血素基因tdh和trh的PCR检测.结果显示,Chelex100法能够简单、快速地提取副溶血弧菌基因组DNA,以满足PCR检测条件的需要.在杭州地区副溶血弧菌感染的病例中,tdh阳性和trh阴性菌占主导地位,其中84株临床分离株中携带tdh基因的比例为92.86%,携带trh基因的比例为2.38%;90株海产品中仅检测出1株tdh阳性菌和2株trh阳性菌,分别占1.11%和2.22%,96.67%海产品中未检测出tdh和trh基因;海产品中携带tdh或trh的副溶血弧菌有增长的趋势,是潜在的危险病源.     

不同条件下副溶血弧菌生物膜形成规律及其天然抑制物质的研究

主要研究了副溶血弧菌在不同培养条件下生物膜形成规律以及天然产物茶多酚、生姜提取物、大蒜提取物对其生物膜形成的影响。结果表明,不同副溶血弧菌菌株形成生物膜能力不同,其中VP-S17形成量最高。一般在培养48~72h时,生物膜达到成熟阶段,之后形成量开始下降。高温、高盐有助于提高副溶血弧菌生物膜的形成,3%盐浓度比1%浓度形成生物膜能力更强;盐浓度相同时,37℃条件下副溶血弧菌形成生物膜含量明显高于25℃。茶多酚、大蒜提取物和生姜提取物能有效抑制副溶血弧菌生物膜的形成,较合适的抑制浓度分别为0.5%、1%和1%。     

粪肠球菌Z096对副溶血弧菌生物被膜及群体感应的抑制作用

为了研究粪肠球菌Z096对副溶血弧菌生物被膜和群体感应（quorum sensing,QS）系统的抑制作用,采用竞争、清除、排阻三种方式模拟Z096与副溶血弧菌在微菌落环境中的相互作用,并进一步探究了Z096的提取物（Z096-E）对副溶血弧菌生物被膜形成、成熟生物被膜清除、细胞表面疏水性、自聚性、QS信号分子AI-2活性、群集泳动能力以及胞外多糖和蛋白合成的影响。结果表明:Z096可通过竞争、清除、排阻的方式与副溶血弧菌相互作用,降低浮游和生物被膜状态的副溶血弧菌细胞数量,干扰副溶血弧菌在载体表面的粘附,且Z096-E能够显著抑制副溶血弧菌生物被膜形成,有效清除成熟生物被膜,1.6 mg/mL的Z096-E处理12 h,副溶血弧菌生物被膜抑制率为70.43%,代谢活性减少率为84.15%;12.8 mg/mL的Z096-E处理副溶血弧菌成熟生物被膜4 h,生物被膜清除率为58.21%,代谢活性减少率为69.84%。而且1.6 mg/mL的Z096-E对副溶血弧菌群集和泳动能力、细胞表面疏水性和自聚性、胞外多糖和蛋白合成的抑制率分别为47.26%、53.56%、63.37%、89.38%、77.65%和51.91%,抑制效果具有浓度依赖性。此外,Z096-E可使副溶血弧菌QS信号分子AI-2活性减弱,表明Z096-E是一种AI-2类群体感应抑制剂,其可通过干扰QS系统,从而影响副溶血弧菌的生理特性。因此,本研究发现了一株能够抑制副溶血弧菌生物被膜的乳酸菌,其提取物Z096-E能作为一种防控副溶血弧菌生物被膜的新型乳酸菌生物制剂,这对消除致病菌生物被膜污染以及开发新型抗菌剂具有积极的作用。     

淬灭副溶血弧菌群体感应的乳酸菌益生特性研究

以副溶血弧菌的群体感应为靶标,筛选对副溶血弧菌群体感应和生物被膜形成具有抑制作用的乳酸菌菌株,分析其益生特性。采用哈维氏弧菌BB170生物发光法及结晶紫染色法测定10株乳酸菌淬灭副溶血弧菌群体感应和抑制生物被膜形成的效果,并分析其自聚性、共聚性、疏水性、生物被膜形成能力以及抗菌谱。结果表明,10株乳酸菌对副溶血弧菌生物被膜形成的抑制作用存在明显差异,乳酸菌抑制副溶血弧菌AI-2活性与抑制生物被膜形成具有相关性,其中菌株A10对副溶血弧菌AI-2和生物被膜的抑制率分别为82.92%和87.70%,对副溶血弧菌AI-2活性有促进作用的菌株B11、L18基本对生物被膜形成没有抑制作用;菌株MS1的自聚率和疏水率均达到80%以上,成膜能力强,且其淬灭副溶血弧菌群体感应和抑制生物被膜形成的作用明显,抑制率分别为69.54%和77.32%,抗菌作用强。本研究为乳酸菌源群体感应抑制剂的研究开发提供参考,对乳酸菌资源的充分开发利用具有积极意义。     

副溶血弧菌菌株229基因组测序及其致病因子的注释

本文对从冰冻海鱼中分离到的副溶血弧菌菌株229进行基因组测序,并对注释的基因进行功能聚类分析,以分析其致病因子,为研究其致病机制提供基因组全局水平的数据支持。完成了副溶血弧菌菌株229的基因组测序及组装,所得基因组4.97 Mb,GC含量为43.90%。基因注释获得4940个蛋白质编码基因(CDS),其中1304个CDS具有GO功能注释。WEGO注释显示大量CDS对于副溶血弧菌入侵宿主及随后的代谢过程发挥重要作用。获得了与副溶血弧菌致病性相关的致病因子,包括溶血素(hemolysin)、Ⅲ型因子(TypeⅢsecretion system,TTSS),这些因子位于不同的染色体位点,形成独立的致病因子簇。副溶血弧菌菌株229基因组组装和功能注释为研究副溶血弧菌致病性的遗传学基础提供了有价值的数据。     

原儿茶酸对副溶血弧菌的抑菌和减毒作用

该研究旨在探讨原儿茶酸对副溶血弧菌的抑菌活性和减毒作用,揭示原儿茶酸抑菌的作用机制。通过测定最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration,MIC）、生长曲线、核酸与蛋白质泄漏量、丙二醛（MDA）含量,利用扫描电镜观察副溶血弧菌形态的变化,来评估原儿茶酸对副溶血弧菌的抑菌活性及其对细胞膜完整性和通透性的影响。同时,通过检测亚抑菌浓度（Sub-inhibitory Concentrations,SICs）下原儿茶酸对副溶血弧菌毒力因子合成的影响,研究原儿茶酸对副溶血弧菌的毒力衰减作用。实验结果表明,原儿茶酸的MIC为2 mg/mL,经MIC浓度原儿茶酸处理后,副溶血弧菌发生严重内陷和破裂,上清液中核酸、蛋白质、MDA含量分别是对照组的2.65倍、1.94倍和10.05倍。此外,原儿茶酸在浓度为1/4 MIC时对胞外多糖、胞外蛋白酶、生物被膜的抑制率分别为40.57%、19.79%和26.04%,在浓度为1/2 MIC时的抑制率分别为52.85%、28.38%和34.69%。原儿茶酸主要作用于细胞膜,通过影响细胞膜的完整性和通透性抑制副溶血弧菌的生长,在亚抑菌浓度下便可有效减弱副溶血弧菌毒力。     

锦州笔架山海域海产品中副溶血弧菌的分子流行病学调查

为了解锦州笔架山周边海域海产品中副溶血弧菌的污染状况,实验室随机采集了蓝圆鲹等共103份常见的海产品,按照GB/T 4789.7-2008及PCR方法对副溶血弧菌进行了分子流行病学调查。结果显示,随机抽检的103份样品中,检测出含副溶血弧菌的样品38份,检出率为37%。这表明,锦州笔架山周边海域常见海产品受副溶血弧菌污染十分严重,具有极大的食品安全隐患。     

壳聚糖盐酸盐对几种水产致病菌的抑菌性研究

目前,对虾疾病仍然是困扰对虾养殖业的一大难题,由弧菌属（Vibrio）细菌引起的弧菌病（Vibriosis）是其中危害最大的细菌性疾病,给水产养殖业造成了严重的经济损失。本实验以副溶血弧菌、哈维氏弧菌和鳗弧菌为供试菌种,采用滤纸片扩散法对壳聚糖盐酸盐进行抑菌实验研究。在此基础上进一步采用96孔板法测定了壳聚糖盐酸盐对副溶血弧菌、哈维氏弧菌和鳗弧菌的最小抑菌浓度（MIC）,结果表明：壳聚糖盐酸盐对3种供试菌株均具有抑菌作用,最小抑菌质量浓度因供试菌的不同而不同,副溶血弧菌为2.5 mg/mL,哈维氏弧菌和鳗弧菌为3.25 mg/mL。     

副溶血弧菌临床分离株的血清分型及毒力基因分析

副溶血弧菌是一种以鱼类、贝类等海产品为主要传播载体的嗜盐性食源性致病菌。近年来,由该菌引起的食物中毒病例呈明显上升趋势。本文采用11种O抗体和8种K抗体,针对来自舟山、宁波、上海浦东和金山的58株副溶血弧菌食物中毒临床分离株(2006-2009年)进行血清型及毒力基因分析。菌株血清分型结果表明:上述4地致病性副溶血弧菌以O3群和K6型为主,共分为22个血清型。其中主要流行株为O3:K6型,占67.72%(107/158);其次为O1:K6,O3:K68,O1:K25,O1:K56,O2:K3等。菌株的来源地分析结果表明:上海金山临床分离株的血清型最复杂,表现出明显的多样性;舟山血清型较单一。利用PCR方法对上述158株副溶血弧菌的主要毒力因子——耐热溶血素基因(tdh)和耐热相关溶血素基因(trh)进行检测,结果发现,其阳性率分别为96.84%(153/158)和3.80%(6/158)。其中(tdh+/trh+)6株,(tdh+/trh-)147株和(tdh-/trh-)5株。结论:杭州湾4地致病性副溶血弧菌流行菌株血清型为O3:K6,且不同地区血清型差异较大;除极少数菌株外,绝大部分菌株都携带tdh或者trh。     

副溶血弧菌生物膜的形成及壳聚糖的抑制作用

考察了不同来源的副溶血弧菌生物膜的形成能力,分析了不同培养条件对副溶血弧菌生物膜形成的影响,并进一步研究了壳聚糖对生物膜形成的抑制作用。采用结晶紫法测定生物膜形成量,XTT法检测生物膜的代谢活性,苯酚-硫酸法测定生物膜的胞外多糖,分析不同浓度壳聚糖对副溶血弧菌生物膜的抑制效果。结果表明,不同菌株生物膜形成条件不同,成膜能力不同,在蟹壳上更易形成生物膜。壳聚糖表现出了较好的抑制副溶血弧菌生物膜形成的能力,最低抑菌浓度下对生物膜形成的抑制率可达70.98%,胞外多糖的减少率为78.04%,代谢活性抑制率为46.83%。     

基于多组学技术解析副溶血弧菌的致病性

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,在海水和淡水中均能定植,对水产品的安全造成严重威胁。为探讨副溶血弧菌的致病性,采用多组学技术分别从蛋白、转录和代谢3个水平分析比较海水和排污口附近增养殖区污水培养的副溶血弧菌。结果表明,两种培养条件下的副溶血弧菌存在97个差异蛋白,其中上调蛋白50个,包括极性鞭毛蛋白FlaA、环AMP接受蛋白以及Cbb3-型细胞色素c氧化酶等与副溶血弧菌致病性和定植过程有关的蛋白质;下调蛋白47个,包括延长因子Tu、转录调节因子和ATP依赖的RNA解旋酶SrmB等。对18个差异蛋白进行mRNA水平的验证,其中10个mRNA表达与蛋白表达呈现正相关性。此外,不同培养条件的副溶血弧菌存在苹果酸、甜菜碱、丝氨酸、精氨酸、次黄嘌呤核苷酸、三磷酸鸟苷及黄嘌呤核苷等差异代谢产物。根据多组学分析结果,两种培养条件的副溶血弧菌在蛋白和代谢水平上出现较大差异,这些差异均与致病性以及蛋白质合成有关,表明增养殖区环境的恶化能够增强副溶血弧菌致病数量和定植能力,导致水产品食用风险增加。     

基于弧菌毒力基因多重PCR法的建立及其在副溶血弧菌毒力基因检测中的应用

针对副溶血弧菌常见的11种毒力基因(tox R、Collagenase、tox S、trh、tdh、tlh、Ure R、Fla A、omp W、Asp A、fur),建立了两套六重PCR检测体系,应用于副溶血弧菌环境分离株和水产品分离株的毒力基因分布情况调查。在调查的248株副溶血弧菌中,鞭毛丝蛋白基因Fla A、外膜蛋白基因omp W和铁吸收调节蛋白基因fur的分布最广(100%),其次为碱性丝氨酸蛋白酶基因Asp A(99.60%),胶原蛋白酶基因Collagenase、不耐热性溶血毒素基因tlh以及毒力调控基因tox R和tox S的分布率均在90%以上且tox R和tox S的分布极为相似,尿素酶基因Ure R的分布极少(1.21%),而耐热直接溶血素基因tdh和耐热相关溶血素基因trh在这248株副溶血弧菌中没有检出。本研究建立的多重PCR检测体系能快速、高效地检测多个毒力基因的分布情况,为副溶血弧菌的毒力机制研究和风险评估提供方法和依据。     

漳州水产养殖环境中副溶血弧菌的流行状况分析

为探究漳州市养殖环境中副溶血弧菌流行状况和基因多态性,无菌采集2019年1～7月份本地区7个养殖场中罗非鱼、石斑鱼和虾的新鲜样品。用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium, TCBS）对样品的疑似副溶血弧菌进行分离纯化,用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增tlh基因和16S rDNA基因片段并测序,鉴定疑似菌株。用随机扩增多态性法（random amplified polymorphic DNA, RAPD）对分离株进行分型。实验共采集228份样品,微生物学初筛得到111株疑似菌株,PCR检测并测序鉴定69株为副溶血弧菌,阳性率为30.26%。RAPD技术对分离株分型,得到了较清晰的电泳条带,分析指纹图谱发现69株副溶血弧菌可分为9个主要类型,遗传相似性在83%～100%范围内。养殖场中的水产品一定程度上受到副溶血弧菌的污染,且不同水产品、不同养殖场、不同时间副溶血弧菌的污染程度都不同。     

应用蛭弧菌清除牡蛎中潜在致病弧菌的研究

本实验以从深圳湾海底沉积物中分离得到的两株蛭弧菌菌株506、菌株512,对31株常见的牡蛎致病弧菌进行了裂解能力实验,探索了它们的裂解谱。结果表明,蛭弧菌506可裂解31株试验宿主菌中的29株,512则可以裂解其中24株,而两株蛭弧菌的协同裂解能力高达100%。该结果展示了蛭弧菌在消除牡蛎致病菌及牡蛎活体内残留食源性致病菌的可行性。此外,我们测定了盐度对这两株蛭弧菌生长情况的影响,结果表明在10-45‰的盐度范围内,蛭弧菌均能生长,最适盐度为30‰;同时我们还研究了其对牡蛎养殖水体和肠道中副溶血弧菌的清除作用,数据表明蛭弧菌可以有效地清除牡蛎养殖环境和体内的副溶血弧菌,试验第7d,实验组水体中和牡蛎肠道副溶血弧菌浓度对数值比对照组分别低5.59和3.39,显示了其在清除牡蛎中弧菌的能力。     

北京市通州区食源性疾病监测病例中副溶血弧菌的病原特征分析

目的 了解通州区2015—2021年食源性疾病监测病例中副溶血弧菌的脉冲场凝胶电泳（PFGE）优势带型、耐药情况和毒力基因携带情况,为副溶血弧菌感染防控和治疗提供参考数据。方法 对2015—2021年通州区定点监测医院门诊腹泻病例的粪便样本进行副溶血弧菌分离培养,对其进行血清分型、毒力基因检测、PFGE聚类分析及药敏试验。结果 2 828份粪便标本中检出副溶血弧菌100株,检出率为3.54%,每年7~9月是检出高峰月份。不同年份副溶血弧菌检出率差异具有统计学意义（χ²=53.94,P<0.001）。100株副溶血弧菌中有一株未携带tlh基因,89.00%的菌株携带致病性毒力基因tdh。副溶血弧菌优势血清型为O3∶K6（66/100）,其次是O4∶K8（9/100）。98株菌副溶血弧菌（2株降解）PFGE分型结果显示副溶血性弧菌有39个PFGE带型,命名为V1-V39,条带相似度在79.6%~100%之间,基因分布呈高度多态性,V22和V25是通州区副溶血弧菌的优势带型。菌株对头孢唑林的耐药率最高（32.00%）,其次是氨苄西林（14.00%）和多黏菌素E（13.00%）,对四环素类、氯霉素类、氨基糖苷类、碳青霉烯类四类药物100%敏感。结论 通州区2015—2021年食源性疾病监测病例中检出的副溶血弧菌主要是O3∶K6型tdh⁺- trh^-菌株,对头孢唑林,氨苄西林和多黏菌素E耐药。PFGE图谱主要流行菌株带型相似度在93.1%以上,存在暴发风险,食品安全相关部门需做好副溶血弧菌监测及暴发预警工作,预防食源性疾病暴发。     

纳豆菌的分离、鉴定及其副溶血弧菌拮抗作用

从纳豆和纳豆菌制剂中分离、纯化得到9个芽孢杆菌菌株,经生理生化实验鉴定其中6株为纳豆芽孢杆菌。首先采用琼脂扩散法研究纳豆菌在不同温度(37、32、28℃)和不同发酵时间(12、24、36、48h)的发酵液对副溶血弧菌的拮抗作用。然后,选择优势菌株BN-5在28℃时与副溶血弧菌共培养,以研究纳豆菌对副溶血弧菌生长的影响。结果表明,37℃纳豆菌发酵液均有明显抑菌效果,抑菌效果随发酵温度的降低和发酵时间的延长而迅速减弱;纳豆菌初始浓度/副溶血弧菌初始浓度≥100时,在24h以内可以有效抑制弧菌生长。     

Western 斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌

目的：对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的直接耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)进行分离纯化,建立Western 斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌的方法。方法：用直接耐热溶血毒素免疫小鼠得到特异性抗血清,利用棋盘方法确定免疫血清最佳工作浓度,并对致病性与非致病性副溶血弧菌分别进行特异性测定。结果：最佳免疫血清最佳工作浓度为1:3200;检测致病性副溶血弧菌为阳性,非致病性副溶血弧菌属呈阴性。结论：Western 斑点印迹法技术可以特异性检测致病性副溶血弧菌,灵敏度高、操作简单,可用肉眼判定结果。     

褶牡蛎体内菌落结构分析及创伤弧菌的定量检测

食用被致病菌污染的牡蛎常引起食品安全问题。采用16S rDNA克隆文库法研究褶牡蛎体内的菌落结构,用荧光定量PCR技术对样品体内的副溶血弧菌、沙门氏菌、创伤弧菌和钩端螺旋体进行定性、定量检测。研究结果表明:褶牡蛎体内的优势菌属为螺旋体属和类杆菌属,分别占总菌数的39.21%和23.53%;样品中含有创伤弧菌,含量为(8.48±0.48)×103cfu/g,而副溶血弧菌、沙门氏菌和钩端螺旋体未检测到。     

东部沿海贝类中副溶血弧菌的分布及特征

为调查我国东部沿海城市零售贝类中副溶血弧菌的分布情况及其血清型和分子特征.共采集了288个贝类样品,采用MPN-PCR方法进行定量研究,分离得到的菌株用RAPD方法进行分子分型并考察其毒力基因携带情况.结果显示,贝类中副溶血弧菌含量季节分布明显,夏季显著高于其他季节(P＜0.05);共分离得到172株副溶血弧菌,其中1...     

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7 CFU/100 mL时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。