麦芽根中5'-磷酸二酯酶和5'-磷酸单酯酶的提取

建立一种高效快速的从麦芽根中提取5'-磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的方法.通过将麦芽根粉碎后,取一定粒度的麦芽根加一定量的去离子水浸泡,过滤后得粗酶液.用紫外分光光度法测定5'-磷酸二酯酶和5'-磷酸单酯酶的酶活,研究粉碎粒度、料液比、抽提温度、抽提时间等因素对麦芽根中5'-磷酸二酯酶和5'-磷酸单酯酶提取的影响.将原料粉碎至100目,以去离子水为提取剂,于4℃提取20h,料液质量比为1:10,5'-磷酸二酯酶的酶活力可达160U/ml.该法简单、快速、准确、适应性强,为5'-磷酸二酯酶的提取与检测提供了有效的工具.     

高活力5′-磷酸二酯酶制备及水解RNA的研究

目的:获得高活力5′-磷酸二酯酶液,提高核酸RNA酶解效率。方法:采用超滤和盐析技术对从麦芽根浸提液中纯化5′-磷酸二酯酶工艺进行研究,采用单因子试验法优化酶解工艺条件。结果:浸提液依次经过5万Da超滤膜浓缩、40%饱和度硫酸铵盐析、5万Da超滤膜脱盐后,酶活力可达1 500U/ml;第1次超滤膜透过液可作为浸提液循环使用,酶活力是水浸提的1.15倍;第2次超滤膜透过液浓缩5倍后,可回收56.46%硫酸铵,浓缩母液可按1∶2比例循环使用;在底物浓度5.8%、酶用量8%、反应时间2h条件下,RNA酶解率可达95%。结论:初步建立了适合工业化规模的核苷酸生产新工艺。     

利用麦芽根抽提液降解RNA生产5′-核苷酸

国内核苷酸生产目前多采用液体深层发酵或固体培养桔青霉得到5′-磷酸二脂酶,以降解核酸成为5′-单核苷酸。啤酒厂有大量的副产物麦芽根,其中含有降解RNA的各种酶类。用水浸泡麦根后,将抽提液经过适当的热处理,用     

DNA/RNA分子中的3′,5′-磷酸二酯键之刍议

3′,5′-磷酸二酯键是生物学、生物化学及有机化学等相关学科中一个重要名词和考点，然而对其释义及内涵的理解在国内外各教材、文献及网络平台上却不同，长期以来是一个争论热点。现利用基团和化学键的基本概念、酯化反应机理及影响因素、磷酸的结构等知识，结合3′,5′-磷酸二酯键的形成机制即核苷酸从头合成途径和核酸合成的相关过程，对3′,5′-磷酸二酯键进行系统剖析和探讨，明确其本质及内涵，体现教学要注重多学科知识的交融和思维的培养。     

紫色马铃薯类黄酮3，′5′-羟化酶基因（StF3′5′H）的克隆及分析

类黄酮3′,5′羟-化酶（ flavonoid 3′,5′-hydroxylase, F3′5′H）是植物花青素生物合成途径中的一个关键酶,紫色土豆（ Solanum tueb or sum） F3′5′H基因的克隆将为花青素合成调控和花青素代谢工程研究提供优质基因资源。研究采用RACE技术克隆了紫色土豆F3′5′H基因的cDNA全长序列,用生物信息学方法对其核苷酸和蛋白质序列进行了分析,并用半定量PCR 技术分析了F3′5′H基因在不同组织中的表达情况,同时研究了赤霉素和蔗糖处理后F3′5′H基因表达与花青素积累之间的相关性。研究结果表明,克隆的紫色土豆F3′5′H的cDNA全长为1854 bp,包含一个1530 bp的完整ORF,共编码509个氨基酸。生物信息学分析表明,StF3′5′H基因推测编码的氨基酸序列与其它植物的F3′5′H蛋白的相似性很高。 StF3′5′H基因的表达具有组织特异性,在紫色土豆根、茎和叶柄中都有表达,其中在叶柄中表达最强,而在块茎、叶轴和叶片中几乎检测不到StF3′5′H基因的表达。赤霉素和蔗糖能促进紫色土豆StF3′5′H基因的表达,进而促进花青素的积累。     

5′-核苷酸的合成方法比较

5′-核苷酸在农业、食品和医药行业有着广泛的用途。比较了目前5′-核苷酸的工业和实验室合成方法,包括化学合成法,微生物发酵法,酶解法和酶催化法。     

5′-磷酸腺苷对小鼠脾细胞氧化应激损伤的保护作用

目的研究5′-磷酸腺苷（5′-AMP）体外抗氧化和对体外氧化损伤脾细胞的损伤修复能力。方法用化学比色法测定5′-AMP体外清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH自由基）的能力;建立过氧化氢（H2O2）氧化损伤体外培养小鼠脾细胞模型,用MTT法检测5′-AMP修复受损伤脾细胞的作用,并分析其对细胞抗氧化体系及抗氧化能力的影响。结果5′-AMP具有剂量依赖性的体外抗氧化和清除活性氧能力,添加0.5mmol/L、1mmol/L、5mmol/L和10mmol/L5′-AMP均能显著修复H2O2诱导的脾细胞氧化损伤（P〈0.05）,总抗氧化能力和抗氧化酶类活力（P〈0.01）,5′-AMP添加量大于1mmol/L时,可显著降低丙二醛（MDA）含量（P〈0.01）。其细胞培养液的氧自由基（ROS）水平逐渐降低,5′-AMP添加量为10mmol/L时,ROS水平接近对照组水平。结论5′-磷酸腺苷能显著修复氧化损伤,具有显著的抗氧化作用。     

红细胞嘧啶-5′-核苷酸酶的纯化及其抗血清的制备

利用UMP-ADH-Sepharose4B亲和层析的方法纯化正常人红细胞嘧啶-5′-核苷酸酶（P5′N, EC.3.1.3.5）.结果表明：利用UMP-ADH-Sepharose4B亲和层析柱可有效、专一性吸附P5′N,纯化液经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条蛋白质带,测定纯化物相对分子质量28×10³,等电点（pI）5.2. 纯化物免疫家兔后,得兔抗人P5′N抗血清,为探讨遗传性及获得性P5′N缺陷奠定了基础.     

5′-磷酸二酯酶高产菌株的选育和发酵培养条件的优化

以ATCC14994为出发菌株,采用紫外线与亚硝基胍相结合的多次诱变育种,获得1株5′-磷酸二酯酶高产菌株HAT2228.通过单因子和正交试验对该菌株的产酶发酵条件进行了优化,优化发酵产酶条件为:蔗糖5%,酵母膏0 3%,蛋白胨0.3%,K2HPO4 0.8%,KH2PO40.8%,MgSO4 0.2%,ZnSO4 0.2%,培养基起始pH6 0,接种量10%,培养温度30℃,摇床转速120r/min,发酵时间48h.在优化条件下,HAT2228的产酶水平达1 329u/ml.     

响应面法优化红花籽粕5-羟色胺衍生物提取工艺

利用单因素实验及响应面法优化红花籽粕5-羟色胺衍生物的提取工艺。通过单因素试验考察提取溶剂、原料粒度、提取时间、提取温度、液料比对红花籽粕5-羟色胺衍生物提取得率的影响,确定各因素的适宜水平。在此基础上,以5-羟色胺衍生物提取得率为响应值进行Box-Behnken中心组合试验设计,并建立二次回归方程,得到红花籽粕5-羟色胺衍生物的最佳提取工艺条件:提取溶剂为无水乙醇、原料粒度为32目、提取时间为2.4 h、提取温度为89℃、液料比为19∶1,此条件下,红花籽粕5-羟色胺衍生物的提取得率可达0.34%。     

人肝刺激因子基因5′-侧翼序列克隆和结构分析

为探讨人肝刺激因子(human hepatic stimulator substance,hHSS)基因表达调控的分子机制,分离人了hHSS基因组DNA,克隆其5′-侧翼序列4890bp,与GenBank比对后,将hHSS基因定位于人16号染色体。通过逆转录PCR(RT-PCR)和5′RACE确定hHSS基因转录起始位点,为进一步研究hHSS基因启动子活性及转录调控特点提供了必要的实验依据。     

固定化5′-磷酸二酯酶及其在核苷酸生产中的应用

钛氯活化纤维素固定5’-磷酸二酯酶,使酶活回收率达到70%以上。用这种固定化酶在75℃、pH5.2的条件下降解0.5%浓度的酵母核酸(RNA),用酶量可减少到1.75u/ml底物,酶活利用率可提高6倍以上。核酸降解率可达70%以上。     

5′—磷酸二酯酶高产菌株的选育和发酵培养条件的优点

以ATCC14994为出发菌株,采用紫外线与亚硝基胍相结合的多次诱变育种,获得1株5′-磷酸二酯酶高产菌株HAT2228.通过单因子和正交试验对该菌株的产酶发酵条件进行了优化,优化发酵产酶条件为蔗糖5%,酵母膏0 3%,蛋白胨0.3%,K2HPO4 0.8%,KH2PO40.8%,MgSO4 0.2%,ZnSO4 0.2%,培养基起始pH6 0,接种量10%,培养温度30℃,摇床转速120r/min,发酵时间48h.在优化条件下,HAT2228的产酶水平达1 329u/ml.     

固定化尿苷-胞苷激酶和聚磷酸激酶偶联催化制备5′-胞苷酸

尿苷-胞苷激酶作为生物体核苷酸代谢补偿途径中的重要催化剂，可以催化胞苷的磷酸化反应合成5′-胞苷酸 (简称胞苷酸)，但需要NTP作为磷酸供体。为了提高胞苷酸的生产效率，文中首先使用大肠杆菌分别异源表达来源于嗜热栖热菌Thermus thermophiles HB8的尿苷-胞苷激酶和来源于类球红细菌Rhodobacter sphaeroides的聚磷酸激酶，其中尿苷-胞苷激酶用于催化胞苷和ATP形成胞苷酸，聚磷酸激酶则用于ATP的循环再生。然后，使用D403金属螯合树脂吸附Ni2+形成固定化载体，再利用固定化载体特异性吸附重组酶形成固定化酶。最后，单因素优化实验确定固定化酶的催化反应条件，在30 ℃、pH 8.0的条件下，以60 mmol/L胞苷和0.5 mmol/L ATP为底物，可实现5批次的高效连续催化反应，胞苷酸平均摩尔得率达到91.2%。上述制备方法反应成本低，产物得率高，酶利用率高，在工业生产中具有较好的应用潜力。     

鸡8个功能基因5′-侧翼区与内含子的SNP多样性比较

本研究旨在探讨鸡功能基因5′-侧翼区的单核苷酸多态性(SNP)水平。作者以白来航鸡、隐性白洛克鸡、杏花鸡、丝羽乌骨鸡、固始鸡、红色原鸡为材料,扩增了GH、DDBC1、RIKEN、RASGRP3、IGF1、THRSP、VIP及PRL共8个基因的5′-侧翼区DNA序列。扩增序列全长为8,399bp,SNP的总数为161个,平均每52bp出现一个SNP。8个功能基因5′-侧翼区核苷酸多样性的θ均值和π均值分别为0.00620±0.00110和0.00559±0.00100。比较检验表明,5′-侧翼区的SNP多样性显著低于内含子区域。5′-侧翼区是基因表达的一个重要调控区域,在分子进化和系统发生过程中承受着比内含子区域更大的选择压,其较低的SNP多样性是适应性较好的表现。Tajima检验与Fu和Li检验表明,与鸡繁殖性状显著关联的VIP基因和PRL基因很可能是人工选择或自然选择的目的基因。     

蓝粒小麦花青素合成途径中的查尔酮合酶基因和类黄酮3′5′-羟化酶基因3′末端的克隆和表达分析

采用RT-PCR和RACE方法从蓝粒小麦(Triticum aestivum L.×Thinopyrum ponticum(Podp.)Z.W.Liu et R.R.-C. Wang)发育种子中克隆到两个查尔酮合酶基因(TaCHS.t1,TaCHS.w1),分别编码394个氨基酸,二者核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为96.0%和98.9%;而且克隆到一个类黄酮3′5′-羟化酶基因(F3′5′H)3′-末端.分别从长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum(Podp.)Z.W.Liu et R.R.-C.Wang)、蓝粒小麦、白粒小麦和中国春基因组中分离到查尔酮合酶基因(CHS)的全长序列(ThpCHS.tg,TaCHS.bg,TaCHS.wg,TaCHS.csg),它们的核苷酸序列之间具有很高的同源性,且均含有一个内含子(intron),序列差异主要在内含子.通过DNA序列比较,发现一个CHS与亲本之一的长穗偃麦草基因组同源性达100%,一个CHS与另一白粒亲本基因组同源性达99%,表明来自于父、母本的CHS在蓝粒发育的种子中均表达.Southern杂交结果表明CHS在小麦中的拷贝数至少有4个,不同颜色的蓝粒小麦、白粒小麦间拷贝数基本一致,但都与长穗偃麦草有差异,根据以上结果初步判定CHS在蓝粒小麦中属于一个多基因家族.Reverse Northern分析表明CHS在开花后15 d发育的蓝粒小麦中具有较强的表达;花后21 d F3′5′H和DFR的转录本积累显著高于CHS,基本上检测不到CHS的表达.这三个基因在蓝粒小麦中的表达顺序与其他植物花青素合成途径中的基因表达次序一致:CHS先于F3′5′H,F3′5′H先于DFR.实验还表明F3′5′H和DFR在幼叶中表达也较强,CHS仅在发育种子中表达,具有组织特异性.花后21 d,F3′5′H在白粒、蓝粒小麦和中国春种子中均强烈表达,蓝粒小麦CHS和DFR转录本比白粒小麦多.因此,认为在蓝粒小麦中存在花青素生物合成途径,在蓝色色素形成过程中,该途径中的结构基因受到调节基因的调控.     

一种用于检测5′-核苷酸磷酸二脂酶的荧光底物合成方法

本文利用间苯二酚为原料合成4-甲基伞形酮,继而经过磷酸酯化,缩合等反应过程合成4-甲基伞形酮-5′-胸腺嘧啶核苷磷酸二酯。反应过程中对胸腺嘧啶核苷的3′位羟基未加任何保护,缩合反应特异地发生在核苷的5′位羟基上。产品经过DEAE-葡聚糖凝胶柱层析分离纯化。利用纸层析、吸收光谱和酶学反应特征鉴定都证明合成的产品对于5′-核苷酸磷酸二酯酶具有专一性,可以用于5′-核苷酸磷酸二酯酶活性测定以及其同工酶谱分析。     

低温对水稻幼苗叶片质膜5′-核苷酸酶活性的影响(简报)

水稻幼苗经冷处理（1℃,150μmol／m2s,2d）处理后,叶片质膜5′-核苷酸酶活性明显下降,而经低温锻炼（14℃,75μmol／m2s,3d）的叶片质膜5′-核苷酸酶活性则有提高,锻炼后的幼苗再经冷处理,其5′-核苷酸酶活性与冷害前相近。CaCl2浸种可减轻冷对5′-核苷酸酶活性的伤害程度。     

5-碘吲哚酚[3]苯基膦酸酯的合成及应用

本文利用苯基氧氯化膦和N-乙酰-5-碘吲哚酚为原料,建立了5-碘吲哚酚[3]苯基膦酸酯铵盐的合成和纯化方法。并报道该产品的紫外光谱、红外光谱、元素分析等理化性质,以及作为酶底物的应用情况。实验结果说明,合成的产品经提取和重结晶可达到层析纯。氢、氮、碳元素分析数据与理论结构计算值相符。产品在常温条件下保存两年以上无结构变化,受酶催化的专一性好,能用于磷酸二酯酶分析和组织化学研究。     

用于肝癌检测的酶底物——5′-(5-碘吲哚酚-[3])胸腺嘧啶核苷酸的制备

检测人血清中5′-核苷酸磷酸二酯酶同工酶谱的变化,是诊断人类原发性肝癌的一个有效的血清酶学方法。和甲胎蛋白诊断法协同,可使肝癌的诊断符合率自80％提高到约94％。减少了甲胎蛋白诊断肝癌存在的假阴性问题,具有重要的临床诊断意义。 检测5′-核苷酸磷酸二酯酶(5′-NPDase)同工酶的底物,5′-(5-碘吲哚酚-[3])胸腺嘧啶核苷酸,我所潘禄兴等已有直接合成法报道。本文在潘禄兴等工作基础上对工艺作了改进,使产率有了明显提高。