重组酶聚合酶扩增技术快速检测日本血吸虫核酸方法的建立

目的应用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,建立一种敏感、特异、简便且快速的日本血吸虫核酸检测方法。方法选择Sj28S核糖体基因片段为靶序列,用Primer Premier 5软件设计特异性引物,建立RPA扩增反应,并进行优化以确定最佳反应条件。提取不同虫期日本血吸虫,以及曼氏血吸虫、埃及血吸虫、单尾尾蚴感染钉螺、华支睾吸虫、大片形吸虫、卫氏并殖吸虫和牛带绦虫等基因组DNA,评价所建立方法的特异性和敏感性,并对不同混合比例(1∶10、 1∶50、 1∶100、 1∶250、 1∶500、 1∶1 000、 1∶2 000)的阳性和阴性钉螺基因组DNA的检出性能和重复性进行评价。结果建立的RPA方法可特异地扩增出日本血吸虫216 bp大小的目的基因片段。RPA的最佳反应条件为39℃、 20 min。该方法与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、单尾尾蚴感染钉螺、华支睾吸虫、大片形吸虫、卫氏并殖吸虫和牛带绦虫及阴性钉螺基因组DNA均无交叉反应。针对日本血吸虫成虫基因组的最低检出限为100 fg/μl,针对重组质粒的最低检出限为100拷贝/μl,且血吸虫不同虫期的基因组DNA样本均能被准确检出。应用建立的RPA方法检测不同混合比例钉螺DNA混合样品,结果显示,最低检出比例为1∶1 000。重复性试验结果显示,5次检测结果完全一致,无假阴性和假阳性。结论建立了日本血吸虫RPA检测方法 ,该法敏感性高、特异性好、简便快速,有望用于血吸虫感染的快速检测及风险监测。     

吡喹酮对感染曼氏血吸虫的光滑双脐螺生殖力的影响

感染吸虫的软体动物的病理反应特征常常是不产卵或产卵减少。作者研究了吡喹酮对感染曼氏血吸虫的光滑双脐螺生殖力的恢复作用和它对螺内子胞蚴和发育尾蚴的作用。实验用在实验室饲养的光滑双脐螺成螺(壳直径10～13mm)和在MF1小鼠内保种的曼氏血吸虫作为材料。先将成螺(壳直径10～11mm)感染曼氏血吸虫,感染后6周即     

基于RPA-LFD的日本血吸虫循环核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价

目的结合重组酶聚合酶扩增(RPA)技术及侧流层析试纸条法(LFD)建立日本血吸虫特异核酸片段的快速可视化检测方法,并初步评价其检测日本血吸虫感染小鼠血清中血吸虫循环核酸的应用价值。方法以日本血吸虫非长末端重复序列逆转录转座子SjCHGCS19为靶标,设计RPA引物和探针,以日本血吸虫基因组DNA为模板进行RPA及LFD检测,并优化RPA反应温度及时间,建立日本血吸虫核酸RPA-LFD快速可视化检测方法。用RPA-LFD检测模板量为10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)和10~(-7)ng的日本血吸虫基因组DNA,评价其敏感性;用RPA-LFD方法检测日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫基因组DNA,评价其特异性。制备含0.01、0.1、1、10和100 ng日本血吸虫成虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清。用40条日本血吸虫尾蚴感染小鼠,采集并分离感染前及感染后7、21、35 d小鼠尾静脉血清。提取模拟阳性鼠血清、感染小鼠血清样品中的循环DNA,评价RPA-LFD检测血清中血吸虫特异核酸的可行性及其早期检测价值。结果建立了快速可视化检测SjCHGCS19重复序列的RPA-LFD方法,30～45℃反应10 min即可检出目的片段。RPA最优反应条件为39℃,20 min。RPA-LFD对日本血吸虫成虫基因组DNA的最低检出限为10~(-6)ng (1 fg)。特异性评价结果显示,RPA-LFD检测曼氏血吸虫和埃及血吸虫基因组DNA结果为阳性,检测卫氏并殖吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果为阴性。RPA-LFD方法可成功检出含0.01～100 ng日本血吸虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清以及血吸虫感染后7、21、35 d鼠血清中的游离SjCHGCS19 DNA片段。结论建立了一种快速、可视化检测日本血吸虫循环核酸的RPA-LFD方法,该方法敏感性高,具有检测血吸虫早期感染的潜在应用价值。     

基于重组酶介导核酸等温扩增技术的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法的建立

目的　结合重组酶介导核酸等温扩增技术（recombinase⁃aided isothermal amplification assay,RAA）和核酸试纸条建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法。方法　以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,设计并合成引物、荧光探针,建立日本血吸虫核酸试纸条检测方法。通过检测不同拷贝数的含SjG28基因片段的重组质粒和不同浓度的日本血吸虫成虫基因组DNA,对该方法敏感性进行评价;通过检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA,对该方法特异性进行评价。结果　以重组质粒为模板,建立的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法最低检测限为10拷贝/μL;以成虫基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/μL。该方法检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA结果均为阴性。结论　本研究结合RAA技术和核酸试纸条建立了一种可快速、简便、可视化检测日本血吸虫特异性基因片段的核酸试纸条法。     

曼氏血吸虫尾蚴特异性钙结合蛋白的免疫化学研究

作者曾报道编码曼氏血吸虫8kDa尾蚴特异性的钙结合蛋白(CaBP)基因的克隆、定序及表达。本文对此蛋白的有关功能进行了免疫化学研究。 成虫取自感染曼氏血吸虫7周的小鼠肝脏。每4天收集一次光滑双脐螺逸出的尾蚴。胞蚴按两个时间取自双脐螺的肝脏(HP):     

在软体动物中间宿主中血吸虫基因的差异分布

本文应用DNA探针识别自然感染螺体内单个血吸虫的基因型,从而为估计中间宿主中血吸虫的分布提供较精确的方法,并首次研究了螺体内血吸虫基因型的分布。 从巴西的Cabana和Barreiro de Baixo(螺感染率分别为26.0％和11.4％)采集自然感染曼氏血吸虫的双脐螺,送往Purdue大学进行曼氏血吸虫的遗传学分析。将两小鼠     

结合重组酶介导的核酸等温扩增和荧光探针快速检测日本血吸虫基因片段

目的结合重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification, RAA)和荧光探针方法建立日本血吸虫特异性基因片段的快速检测方法。方法以日本血吸虫G28 (Sj G28)基因片段作为靶序列,应用DNAMAN 7.0软件设计合成引物及荧光探针,建立荧光RAA反应体系。扩增不同拷贝数的Sj G28重组质粒,评价荧光RAA检测的敏感性;分别以日本血吸虫、曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫基因组为模板进行荧光RAA检测,以评价该方法的特异性。采用荧光RAA分别检测500、 200和50条日本血吸虫尾蚴感染的兔粪中虫卵DNA。分别在50只阴性钉螺中混入1、 2、 3、 4、 5、 10只阳性钉螺,并提取DNA进行荧光RAA检测。结果以不同拷贝数的Sj G28重组质粒为模板进行荧光RAA扩增,在5 min时即可观察到明显的荧光信号,随着拷贝数的不断降低,检测到荧光信号的时间也随之延长,不同拷贝数的扩增均在10 min内完成,最低可检出的质粒浓度为10拷贝/μl。以曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫及华支睾吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。不同数量尾蚴感染的兔粪中提取的DNA样品经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在15 min内完成。含不同数量阳性钉螺的50只阴性钉螺提取的日本血吸虫DNA经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在10 min内完成。结论本研究建立的可检测日本血吸虫核酸片段的荧光RAA方法,反应快捷,敏感性和特异性均较高。     

藁杆双脐螺密度和静水沉速的测定

目的了解曼氏血吸虫的中间宿主藁杆双脐螺的生态水力学特性。方法采用排水体积法和沉降管法分别测定了双脐螺的密度和静水沉速。结果藁杆双脐螺的密度在1.04~1.16 g/cm~3之间,平均密度为1.08 g/cm3;其静水沉速在2.32~12.92 cm/s之间。结论藁杆双脐螺的生态水力学特性与钉螺有所不同,在研究采用水利措施防控藁杆双脐螺扩散中应考虑其特性。     

寄生虫与无脊椎动物宿主相互关系的研究:血吸虫、肝片吸虫和某些肺螺之间共同抗原——原肌球蛋白的协同进化

以往已证明血吸虫与螺宿主存在着共同抗原。此后人们就此进行了大量深入细致的研究。本文报道用4种抗曼氏血吸虫原肌球蛋白(SMTM)单抗1C_1,1F_(10),1G_6,3D_2与日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、肝片吸虫、湖北钉螺、切口小泡螺、盘螺、膀胱螺、水蛭、黑腹果蝇等无脊椎动物原肌球蛋白反应的结果。     

曼氏血吸虫在三种双脐螺中的发育

在巴西,曼氏血吸虫的中间宿主有B.tenagophila、藁杆双脐螺、光滑双脐螺三种双脐螺。本文比较研究了这三种螺的毛蚴感染水平及每天的尾蚴逸出数。 用实验室饲养的长度分别为8—10mm、8—10mm、4—7mm的上述三种双脐螺,进行曼氏血吸虫发育的比较研究。每种螺200只,     

抗曼氏血吸虫成虫的单克隆抗体可识别童虫的表面抗原

本文叙述了用曼氏血吸虫成虫分离的表皮制剂免疫小鼠获得单克隆抗体的方法。这种抗体能杀死童虫并可识别童虫的表面抗原。实验采用曼氏血吸虫波多黎各株和光滑双脐螺。成虫从感染6周的仓鼠门静脉中检获,尾蚴用Ramalho-Pinto法发育为童虫,肺部童虫可从感染1000条尾蚴的CBA/Ca     

巴西藁杆双脐螺对3株曼氏血吸虫的敏感性

人工湖等水利工程可能成为淡水螺的孳生地 ,增加人类及动物感染血吸虫的机会。作者在人工湖周围地区藁杆双脐螺的发生和分布的流行病学调查的基础上 ,研究了藁杆双脐螺对曼氏血吸虫毛蚴的敏感性。根据最近两年来螺的种群研究结果 ,选择湖区周围曼氏血吸虫病主要流行的地区进行调查。实验所需的 1 9个藁杆双脐螺种群中 ,大部分在流行区获得 ,另外两个对照种群来自于其它地区。螺分别暴露于 5个曼氏血吸虫毛蚴 (从 3株曼氏血吸虫分离获得 ,分别为CM、EC和PB株 )。观察感染的阳性率和尾蚴前期发育时间。暴露 6 0d后 ,尾蚴未逸出但仍然存活的…     

曼氏血吸虫和埃及血吸虫单性和交叉配对感染仓鼠后成虫的发育

在非洲同时流行曼氏血吸虫和埃及血吸虫,人们常同时感染这两种血吸虫。本文作者采用一个毛蚴感染亚历山大双脐螺及热带小泡螺后逸出的尾蚴感染仓鼠,就这两种血吸虫的雌、雄成虫之间的相互作用对血吸虫在宿主体内的发育及产卵的影响进行了评价。 将仓鼠分成三组:第一组为单性感染组,即用单性毛蚴感染亚历山大双脐螺和热带小泡螺,用每种螺所选出的约200条尾蚴经皮下接种感染仓鼠;第二组为异种交叉配对感染组,即埃及血吸虫雄虫与曼氏血吸虫雌虫     

左旋和右旋吡喹酮对感染日本血吸虫和曼氏血吸虫小鼠杀虫效果的比较

吡喹酮(PZQ)是一种由相同比例的同分异构体,左旋(L)和右旋(D)吡喹酮构成的外消旋化合物。本文报道了L-PZQ和D-PZQ对感染日本血吸虫和曼氏血吸虫小鼠的杀虫效果。实验所用药物系上海第六制药厂提供,日本血吸虫日本株和曼氏血吸虫波多黎各株已在实验室用雄性ICR小鼠在片心钉螺、光滑双脐螺中传代十年以上,从20个以上的感染螺中收集各血吸虫种的尾蚴在3小时内用于感染。雄性ICR小鼠(5周龄)用盖玻片法感染日本血吸虫尾蚴30条,或用尾部浸水感     

基于重组酶介导核酸等温扩增反应的曼氏血吸虫 基因检测方法的建立

目的　建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（Recombinase?aided amplification, RAA）。方法　以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光RAA法反应体系。分别以不同拷贝数的含121 bp基因片段的重组质粒及不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA法扩增,评价该方法的敏感性;分别以日本和埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,评价其特异性。结果　建立的荧光RAA法可在39 ℃、20 min内特异性扩增曼氏血吸虫基因组DNA。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/μL;以基因组DNA为模板,荧光RAA法最低可检测浓度为0.1 fg/μL。以日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于曼氏血吸虫DNA检测的荧光RAA法,该方法反应快捷、操作简便,敏感性和特异性均较好。     

基于重组酶介导等温扩增技术的广州管圆线虫 核酸检测方法的建立

目的　建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的广州管圆线虫核酸检测方法。方法　选择广州管圆线虫内转录间隔区1（ITS1）基因序列作为靶基因序列,设计、合成并筛选出特异性最强的引物和探针,构建用于广州管圆线虫核酸检测的基础及荧光RAA检测方法。分别以含检测靶基因片段序列的不同拷贝数重组质粒以及不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以广州管圆线虫、曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫及小管福寿螺和藁杆双脐螺螺体基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了用于广州管圆线虫核酸检测的荧光RAA法,该方法可在37 ℃ 20 min内对广州管圆线虫特异性DNA片段实现实时扩增。以含靶基因片段序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板时,该法最低检出限分别为10拷贝/μL重组质粒和100 pg/μL基因组DNA;以曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫及小管福寿螺和藁杆双脐螺螺体基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于广州管圆线虫核酸检测的荧光RAA法,其检测简便快速,具备较好的敏感性和特异性。     

重组酶聚合酶扩增结合电化学DNA传感器检测日本血吸虫方法的建立

目的联合重组酶聚合酶扩增及电化学DNA传感器检测技术,建立一种敏感、特异且简单的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)核酸检测方法。方法提取日本血吸虫基因组DNA,以Sj R2基因片段为靶序列,设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物与探针,与电化学DNA传感器(EC)检测技术联合,将探针固定于多通道电极芯片进行界面RPA扩增及电化学检测,建立日本血吸虫核酸等温检测方法。优化RPA反应条件,通过检测10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8ng日本血吸虫基因组DNA,评价RPA-EC方法的敏感性;通过检测10 ng日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫及华支睾吸虫的基因组DNA,评价RPA-EC方法的特异性。取10只6~8周龄C57成年小鼠,每鼠经腹部贴片感染40条日本血吸虫尾蚴,分别于感染前(0 d)和感染后7、21、35 d收集尾静脉血清,验证RPA-EC方法检测感染动物动态血清DNA中Sj R2基因片段的可行性。结果RPA-EC联合检测方法可在37℃、30 min内完成SjR2基因片段的界面快速扩增及检测,成虫基因组DNA的最低检出限可达10^-8ng,与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫及华支睾吸虫基因组DNA无交叉反应,具有较好的特异性。日本血吸虫感染小鼠实验结果显示,RPA-EC联合检测方法可高敏感检出感染后7、21、35 d等不同感染期小鼠血清中的SjR2基因片段。结论本研究所建立的RPA-EC联合检测方法敏感性高、特异性好、操作简便,具有一定的应用前景。     

双脐螺感染曼氏血吸虫相关神经递质研究进展

曼氏血吸虫是一种严重威胁人类健康的重要寄生虫,其中间宿主为扁卷螺科双脐螺。当前关于双脐螺感染曼氏血吸虫的研究逐渐从宏观向微观发展,大量的功能基因和蛋白被报道。神经递质是机体调节神经活动的重要物质,在双脐螺和血吸虫体内广泛分布,不仅参与调控宿主和寄生虫的基本生理行为,还对感染后双脐螺产卵、应激防御以及进入宿主的寄生虫发育等起到重要调控作用。目前已发现五羟色胺、多巴胺、组胺、乙酰胆碱、谷氨酸和一氧化氮等6类常见的神经递质与双脐螺感染曼氏血吸虫相关,本文从生理、生化以及组织定位表达等方面对上述6类神经递质进行综述,以期为双脐螺与血吸虫相容性研究提供参考。     

血吸虫中间宿主浦氏双脐螺的时空遗传变异

作者采用随机扩增多态性DNA(randamamplified polmorphic DNA,RAPD)分析曼氏血吸虫中间宿主浦氏双脐螺(Biomphalariapfeifferi)种群在特定时间和空间上的遗传变异。     

钉螺感染目平外睾吸虫的分泌物及其对杀灭不同时间再感染日本血吸虫幼虫的进一步观察

目的 湖北钉螺(Oncomelania hupensis)先感染目平外睾吸虫(Exorchis mupingensis)虫卵后,再间隔不同时间感染日本血吸虫(Schistosoma japonicum)毛蚴,观察螺体分泌物的强度对血吸虫幼虫损害和被杀灭情况的关系。方法 钉螺感染目平外睾吸虫后分别于21 d、37 d、55 d、70 d和85 d再感染血吸虫毛蚴。钉螺经双重感染后4-82 d, 作钉螺整体连续埋蜡切片、染色制片和全片观察,并记录血吸虫幼虫残体数。结果与结论 单独感染外睾吸虫的钉螺,和两吸虫感染间隔时间为21-85 d的钉螺,螺体都产生大量血淋巴细胞和分泌物,它们会围攻再侵入的日本血吸虫早期幼虫并侵入其体内,血吸虫幼虫结构发生异常、停止发育直至死亡。两种吸虫双重感染的间隔时间愈长,螺体血淋巴细胞数随时间增加而逐渐减少;而螺体分泌物不断增多,并见于血吸虫幼虫残骸内,螺体攻击血吸虫幼虫的效力愈强。这现象在单独感染日本血吸虫的钉螺体内未见到。