凡纳滨对虾抗菌肽的筛选及与DNA的结合机制

探究凡纳滨对虾中一种新型抗菌肽PV13对副溶血性弧菌的抑菌活性及与DNA的结合机制。采用超高效液相色谱-质谱联用技术鉴定凡纳滨对虾体内小分子多肽序列,并采用生物信息学从序列库中分析、筛选得到阳离子抗菌肽PV13(ALPWVLPWALPRALPRVLPR)。通过最低抑菌浓度(MIC)和时间杀伤曲线(Time-kill)测定抗菌肽PV13对副溶血性弧菌的MIC为62.5 μg/mL,可在2 h内将副溶血性弧菌全部杀灭。采用透射电子显微镜观察、细胞内膜通透性测定、DNA凝胶阻滞和圆二色谱仪等评价抗菌肽对副溶血性弧菌的抑菌机制。结果表明,抗菌肽PV13能增加副溶血性弧菌细胞膜内膜的通透性,使得细胞膜变薄,从而进入细胞,与基因组DNA结合来体现其抑菌活性,二者结合程度与肽浓度呈正相关。抗菌肽PV13在PBS和SDS溶液中均呈无规则卷曲结构,与副溶血性弧菌基因组DNA结合后,色谱吸收峰发生明显变化。推测序列中4个重复的亮氨酸-脯氨酸区域可能是其抑菌活性功能域。上述结果对凡纳滨对虾中抗菌肽的筛选及其分子设计具有指导意义,同时也为抗菌肽PV13作为食品新型防腐剂的应用提供理论支持。     

反式肉桂醛对副溶血性弧菌的抑制作用

本研究通过测定TC对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)评价其抑菌效果;随后通过测定TC对副溶血性弧菌生长曲线、生长动力模型、细胞膜完整性及细胞形态的影响探究其可能的抑菌机理;最后,构建副溶血型弧菌污染的鲜虾模型,评价TC对鲜虾中副溶血性弧菌的控制作用。结果表明,TC对副溶血性弧菌的MIC为50～70μg/mL;TC可降低副溶血性弧菌最大生长速率、延长其生长延滞期;TC可使副溶血性弧菌细胞膜完整性显著降低,并使副溶血性弧菌细胞形态干瘪、皱缩;在鲜虾模型中,体积分数0.4%的TC在1 h(4℃)使鲜虾中的副溶血性弧菌降低至检出限以下。研究结果表明,TC有潜力作为天然的抗菌物质应用于鲜虾及其他海产品中有效控制副溶血性弧菌。     

水飞蓟素对副溶血性弧菌的抑制作用

目的 以两种副溶血性弧菌为研究对象,探究水飞蓟素对于副溶血性弧菌的抑制及其作用机制。方法 通过琼脂板稀释法和肉汤稀释法确定水飞蓟素对两株菌的最小抑制浓度（MIC）,然后进一步通过研究水飞蓟素在不同培养基上处理后的副溶血性弧菌的生长曲线、生物膜形成情况、细胞膜完整性及钾离子外流情况的变化,探究水飞蓟素在不同培养基上对副溶血性弧菌的抑制作用及可能的作用机制。结果 水飞蓟素能够抑制生物膜的形成,损害细胞膜,导致细胞变形,显著增加钾离子外流,来抑制副溶血性弧菌的生长,并且不同培养基的抑制作用是不一样的。结论 水飞蓟素能够对副溶血性弧菌产生较强的抑制作用,有作为天然的抗菌物质应用于食品工业的潜力。     

柠檬醛对副溶血性弧菌的抑制作用

有效预防和控制副溶血性弧菌对食品的污染对于保障公众健康具有重要意义。本研究首先利用琼脂稀释法测定7?种植物源活性物质（丁香酸、阿魏酸、绿原酸、硫辛酸、原儿茶酸、原儿茶醛和柠檬醛）对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度,在此基础上选择柠檬醛进行后续实验;通过检测经柠檬醛处理后的副溶血性弧菌生长曲线、细胞膜电位、胞内ATP浓度、细胞膜完整性以及细胞形态的变化,探究柠檬醛对副溶血性弧菌的抑制作用及可能的作用机理。结果表明：柠檬醛相比于其他6?种植物源活性物质对副溶血性弧菌有更好的抑菌效果,其对两株标准菌株和8?株分离菌株的最小抑菌浓度在0.10～0.60?mg/mL范围内;柠檬醛能够引起副溶血性弧菌细胞膜电位去极化、胞内ATP浓度降低及细胞膜完整性下降,同时可使细胞皱缩变形。本研究结果表明柠檬醛具有良好的抑菌功效,并有潜力作为天然的抗菌物质应用于食品工业。     

副溶血性弧菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立

以副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)gyr B基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence single primer isothermal amplification,实时荧光SPIA)检测副溶血性弧菌的方法。实时荧光SPIA在40 min反应时间内,对3株副溶血性弧菌和16株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA检测,结果表明除3株副溶血性弧菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8.2 fg/μL,对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为13.5 CFU/m L;对鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋等4种模拟样品中副溶血性弧菌的检出限均为14.7 CFU/g。研究结果表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便。     

酒糟大黄鱼抗菌肽FAH34的抑菌活性及热稳定性

副溶血性弧菌为常见的食源性致病菌，是影响海洋食品安全性的主要危害因子。本研究从酒糟大黄鱼中鉴定一种抗菌肽FAH34(氨基酸序列为KTISFILK)，研究其对副溶血性弧菌的抑菌活性及热稳定性。结果表明，肽FAH34对副溶血性弧菌的最低抑菌浓度(MIC)值为7.80 μg/mL，在FAH34作用3 h后，细菌数从5.06 lg (CFU/mL)降至0 lg (CFU/mL)，显示出很强的抑菌活性。透射电镜观察发现，肽FAH34是通过破坏细菌细胞膜结构，使胞内物质外渗，从而达到杀菌的效果。经80 ℃、30 min及121 ℃、15 min处理后，肽FAH34仍能保持原有的抑菌活性，对人体LO₂细胞活力(>90%)无显著影响。FAH34应用在鱼肉及腌制液中，可将其中副溶血性弧菌数量控制在0~0.40 lg(CFU/mL)范围。结论:FAH34是一种对溶血性弧菌具有热稳定性的新型抗菌肽，可作为生物防腐剂应用于水产腌制食品中。     

柠檬草精油对副溶血性弧菌的抑菌活性及机制

目的:探究柠檬草精油(LG-EO)对副溶血性弧菌的抑菌活性和机理。方法:通过测定LG-EO对副溶血性弧菌的最低抑制浓度(MIC)、时间-杀灭分析、上清液中AKP活性、电导率和蛋白质泄漏量、细胞形态、膜电位、呼吸链脱氢酶活力及胞内DNA的含量和结构等,研究LG-EO对副溶血性弧菌的抑菌活性和机制。结果:LG-EO对副溶血性弧菌的MIC范围80~120 μg/mL,在80~280 μg/mL处理浓度范围,其杀灭效果随浓度和时间的增加而提高,240 μg/mL LG-EO处理10 min即可灭活全部副溶血弧菌。与高于MIC的LG-EO共培养,副溶血弧菌细胞壁、膜的完整性被破坏,导致上清液中AKP活性、蛋白质含量和电导率上升,细胞边界模糊和内容物流失。菌体细胞膜电位、呼吸链脱氢酶和ATP酶活性等显著降低。基因组DNA的核酸电泳和紫外吸收光谱提示,DNA在LG-EO作用下流失严重并与主要成分柠檬醛发生互作。结论:柠檬草精油对副溶血性弧菌有较强的抑菌作用,LG-EO通过破坏细胞壁、膜构造,干扰细胞能量代谢,造成DNA流失或变性等快速杀灭副溶血性弧菌。本研究为探明LG-EO的抑制致病性弧菌机理奠定良好的基础,在水产品加工业中具有广泛的应用潜力。     

牡蛎副溶血性弧菌原位LAMP方法的建立

副溶血性弧菌是造成海产品食源性疾病的重要病原菌之一。为精确定位副溶血性弧菌在牡蛎鳃、外套膜、内脏团、闭壳肌中的分布,明确副溶血性弧菌的组织亲嗜性和侵染进程,研究基于环介导等温扩增技术（LAMP）和原位杂交技术,建立牡蛎副溶血性弧菌原位LAMP检测方法。利用该方法发现副溶血性弧菌经鳃组织过滤,在内脏团消化道快速扩增并蔓延至闭壳肌和外套膜等外围组织,属于Ⅳ型发病机制。该方法同步实现对副溶血性弧菌的高灵敏度和精确定位检测,为进一步研究牡蛎应对副溶血性弧菌的免疫反应奠定了基础。     

副溶血性弧菌ERIC-PCR分型及毒力基因检测研究

目的:建立副溶血性弧菌ERIC-PCR分子分型技术,分析副溶血性弧菌标准菌株及分离株基因组DNA ERIC-PCR指纹图谱,并对副溶血性弧菌毒力基因进行检测,以了解不同来源副溶血性弧菌毒力基因携带情况.方法:提取副溶血性弧菌基因组DNA,以肠杆菌基因间共有重复序列(ERIC)为引物进行PCR扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析仪对图谱进行观察分析,并以相似性系数构建聚类图;通过PCR方法对直接耐热溶血素(TDH)和耐热直接相关溶血素(TRH)进行检测.结果:26株副溶血性弧菌均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,ERIC-PCR可将26株菌分为12个型,分辨力指数为0.926;只在临床分离株中检测到TDH基因,而除一株标准菌株外,所有菌株都未检测到TRH基因.结论:研究显示ERIC-PCR可从分子水平对副溶血性弧菌基因组DNA进行快速指纹图谱分析,同时结合毒力基因检测,能够为副溶血性弧菌食物中毒疾病的预防和流行病学调查提供科学依据.     

PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究

目的：建立用DNA碱基序列检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP )的方法。方法：根据副溶血性弧菌toxR基因设计扩增引物和测序引物,先用PCR特异性地扩增目的片段,再制备单链模版在测序引物引导下用焦磷酸测序法检测DNA碱基序列,检测的序列为CCAA GGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT,则判断为副溶血性弧菌。结果：扩增引物和测序引物表现出良好的特异性,PCR扩增结果,20株VP均扩增出大小137bp的DNA片段,而创伤弧菌等对照菌株未扩增出DNA条带。焦磷酸测序结果,20株副溶血性弧菌均测出与预期相符的DNA碱基序列,而其他对照菌株未测出DNA 碱基序列或检测结果与测序引物后的序列不匹配。VP标准菌株ATCC 17802试验菌株发生A-T突变,密码子CCU变成CCA,而两个密码子都是脯氨酸的密码子。结论：建立的方法特异性高, 整个试验可在21h-27h完成,是快速检测VP有效手段。