新生小鼠脊髓神经干细胞体外增殖及其多潜能分化特性

目的:观察新生小鼠脊髓神经干细胞的体外增殖及其分化特性。方法:实验于2005-11/2006-02在安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室完成。①在无菌条件下,利用显微解剖分离新生小鼠(出生后2d内)脊髓,采用原代机械吹打使其成为单细胞悬液,离心,弃去上清液,加入干细胞培养液(含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,20μg/L表皮生长因子,B27辅助培养液),以1×108L-1密度接种于25mL培养瓶中,进行原代培养。②将原代培养7d左右的细胞再次离心,弃去上清,加入干细胞培养液,机械吹打成单细胞悬液,以5×107L-1密度进行传代培养,每六七天传代1次。③机械吹打制成的单细胞悬液,经过传代培养,重新增殖为神经球,采用巢蛋白抗体鉴定培养细胞,用体积分数为0.1的胎牛血清诱导神经干细胞分化后,用神经元和星型胶质细胞标志物微管相关蛋白,胶质纤维酸性蛋白相应抗体检测神经干细胞分化情况。结果:①脊髓源性神经干细胞形态学观察:在细胞培养第3,4天即可见培养基中出现由几个或十几个细胞组成的结构紧密、大小不等的悬浮细胞团块,称之为“神经细胞球”;随着培养时间的延长和多次传代换液,细胞增殖迅速,神经细胞球数目明显增多。②脊髓神经干细胞的分化与鉴定:将神经球转入含体积分数为0.1的胎牛血清的培养液中,数小时内迅速贴壁并开始分化,5d后分化的细胞呈现出3种典型的神经细胞形态;免疫细胞化学检测神经细胞球巢蛋白染色阳性及其分化的神经元和星型胶质细胞微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白分别染色阳性。结论:新生小鼠脊髓存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们可以在体外大量增殖,经过诱导可朝神经元和胶质细胞的方向分化。     

胎鼠纹状体神经干细胞分离培养方法的改进

目的：利用有血清和多聚赖氨酸培养液中加入SD14d胚胎大鼠纹状体区神经干细胞，探讨其分离、纯化神经干细胞操作技术的改进。方法：实验于2003—03／2004-11在广州第一军医大学珠江医院神经外科实验室完成。①选用SD大鼠20只，取孕13～14d的SD大鼠胚胎纹状体，吸管吹打（不超过10次）后，用组织剪剪成1mm，块状，以1．25mL／L的胰酶，在37℃下消化20min，以S—Dulbeeeo改良的Eagle培养基-F12中止消化，采用1000r／min离心10min，显微镜下细胞记数，以1&;#215;10^4／cm^2接种到改良的有血清和多聚赖氨酸铺被的12孔培养板上，培养液为Dulbeeeo改良的Eagle培养基-F12加上B27，加入血清和20μg／L表皮生长因子。7d后用吸管吸取漂浮的细胞球，机械吹打成单细胞悬液，按每培养孔1&;#215;10^4/cm^2细胞行传代再培养，此后5～7d再传代，方法同前。②利用神经干细胞与星形胶质细胞、神经细胞以及成纤维细胞贴壁之间的差异，使细胞分为贴壁和漂浮的两层细胞．分离去掉贴壁的神经细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞以及部分的神经干细胞，得到漂浮的细胞球。③机械吹打后制成单细胞悬液，再传代培养，细胞重新增殖成细胞球，应用免疫细胞化学技术特异性抗原巢蛋白检测最初的细胞球、吹打后的单细胞和重新增殖的细胞球巢蛋白抗原的表达和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。巢蛋白为神经干细胞特异性标记物，其阳性表达表明神经干细胞的存在。结果：①原代培养的纹状体细胞第2天叮见贴壁生长的神经细胞、星形胶质细胞和增殖的细胞球（约10-16个细胞大小），漂浮的细胞开始出芽并增殖；第3天贴壁的细胞球继续增殖（约50个细胞大小），漂浮的细胞则增殖成4-8个大小的细胞球；第4-7天贴壁的细胞球开始分化，漂浮的细胞则继续增殖成约30个细胞大小的细胞球，巢蛋白染色阳性。②漂浮的细胞，吹打后行传代培养，加入表皮生长因子、血清和多聚赖氨酸，细胞仍漂浮生长，1周后增殖成约70-80个细胞大小的细胞球，吸管吹打继续再培养，细胞仍漂浮增殖成细胞球，巢蛋白抗原表现阳性。③免疫细胞化学染色显示原代培养中贴壁的细胞球、吹打后的单细胞、漂浮的细胞球巢蛋白染色阳性，吹打后的细胞若不加入表皮生长因子，则细胞染色显示胶质纤维酸性蛋白和神经丝蛋白阳性。分离纯化后的细胞具有自我更新能力和多分化潜能，有很强的增殖能力。结论：利用有血清和多聚赖氨酸加入的方法分离培养的原代细胞球巢蛋白表达阳性，具有纯化度高，存活时间长的特点。     

胎鼠纹状体神经干细胞分离培养方法的改进

目的:利用有血清和多聚赖氨酸培养液中加入SD14d胚胎大鼠纹状体区神经干细胞,探讨其分离、纯化神经干细胞操作技术的改进。方法:实验于2003-03/2004-11在广州第一军医大学珠江医院神经外科实验室完成。①选用SD大鼠20只,取孕13～14d的SD大鼠胚胎纹状体,吸管吹打(不超过10次)后,用组织剪剪成1mm3块状,以1.25mL/L的胰酶,在37℃下消化20min,以S-Dulbecco改良的Eagle培养基-F12中止消化,采用1000r/min离心10min,显微镜下细胞记数,以1×104/cm2接种到改良的有血清和多聚赖氨酸铺被的12孔培养板上,培养液为Dulbecco改良的Eagle培养基-F12加上B27,加入血清和20μg/L表皮生长因子。7d后用吸管吸取漂浮的细胞球,机械吹打成单细胞悬液,按每培养孔1×104/cm2细胞行传代再培养,此后5～7d再传代,方法同前。②利用神经干细胞与星形胶质细胞、神经细胞以及成纤维细胞贴壁之间的差异,使细胞分为贴壁和漂浮的两层细胞,分离去掉贴壁的神经细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞以及部分的神经干细胞,得到漂浮的细胞球。③机械吹打后制成单细胞悬液,再传代培养,细胞重新增殖成细胞球,应用免疫细胞化学技术特异性抗原巢蛋白检测最初的细胞球、吹打后的单细胞和重新增殖的细胞球巢蛋白抗原的表达和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。巢蛋白为神经干细胞特异性标记物,其阳性表达表明神经干细胞的存在。结果:①原代培养的纹状体细胞第2天可见贴壁生长的神经细胞、星形胶质细胞和增殖的细胞球(约10～16个细胞大小),漂浮的细胞开始出芽并增殖;第3天贴壁的细胞球继续增殖(约50个细胞大小),漂浮的细胞则增殖成4～8个大小的细胞球;第4～7天贴壁的细胞球开始分化,漂浮的细胞则继续增殖成约30个细胞大小的细胞球,巢蛋白染色阳性。②漂浮的细胞,吹打后行传代培养,加入表皮生长因子、血清和多聚赖氨酸,细胞仍漂浮生长,1周后增殖成约70～80个细胞大小的细胞球,吸管吹打继续再培养,细胞仍漂浮增殖成细胞球,巢蛋白抗原表现阳性。③免疫细胞化学染色显示原代培养中贴壁的细胞球、吹打后的单细胞、漂浮的细胞球巢蛋白染色阳性,吹打后的细胞若不加入表皮生长因子,则细胞染色显示胶质纤维酸性蛋白和神经丝蛋白阳性。分离纯化后的细胞具有自我更新能力和多分化潜能,有很强的增殖能力。结论:利用有血清和多聚赖氨酸加入的方法分离培养的原代细胞球巢蛋白表达阳性,具有纯化度高,存活时间长的特点。     

大鼠胚胎脑源性神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：分离培养大鼠胚胎脑源性神经千细胞，并进行增殖分化鉴定。 方法：实验于2005—06／12在中国科学技术大学生命科学学院周江宁研究室进行。①自孕14dWistar大鼠胚胎分离大脑皮质及皮质下组织，经机械吹打分离成单细胞后，利用无血清原代及传代培养方法，在添加重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子和B27添加剂的DMEM／F12（1：1）培养基中进行悬浮培养，获得具有克隆能力的细胞群；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆。②从培养基中撤除生长因子和B27添加剂，换成含体积分数为0．1的胎牛血清的DMEM／F12培养基，将培养的细胞球接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的培养皿，诱导分化。③以免疫荧光细胞化学技术，用神经干细胞的特异性单克隆抗体（巢蛋白）和增殖细胞单克隆抗体（5一溴脱氧尿苷嘧啶）鉴定克隆细胞，以鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力。④以免疫荧光细胞化学技术，用神经细胞的特异性抗体（神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂）鉴定分化细胞，以鉴定神经干细胞的多向分化潜能。 结果：①从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力，表达神经上皮干细胞蛋白抗原和增殖细胞抗原。②在血清诱导下，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞3种神经细胞的特异性抗原。 结论：运用上述方法分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多向分化潜能和具有神经干细胞的特异性抗原。     

不同年龄段大鼠脊髓源性神经干细胞的体外培养及鉴定

背景：不同年龄段神经千细胞的增殖及分化特性目前未见报道。目的：观察不同年龄段人鼠脊髓源性神经干细胞的体外分离、培养及鉴定。方法：取不同年龄大鼠的脊髓,制成单细胞悬液,用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和B27的DMEM／F12培养基,以细胞浓度5.0×10^5L^-1进行原代培养,每隔3d传代1次。结果与结论：不同年龄段大鼠的脊髓中均可培养出细胞,其形态为结构紧密、大小不等的悬浮细胞球,称之为“神经干细胞球”;经过传代后单细胞又迅速增殖成球且数目明显增多。提示不同年龄段大鼠脊髓中均能够在体外培养出神经细胞球。     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的：观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。 方法：实验于2004-10／2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞（家属知情同意），采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成：DMEM／F12（1：1），表皮生长因子20μg／L，碱性成纤维细胞生长因子20μg／L，重组人白血病抑制因子10μg／L，N2添加剂（终浓度为10mL/L）。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。 结果：①人胚脊髓神经干细胞形态学观察：原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球，形态较规则，呈圆形，细胞边界清楚，折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后，细胞团生长速度明显加快；传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果：神经干细胞球，巢蛋白染色阳性；可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 结论：人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

新生小鼠海马、嗅球及皮质神经干细胞的分离培养及鉴定

背景：从体外分离培养出高纯度、生物学性能均一的神经干细胞,建立起一套完整的神经干细胞培养体系,是进行神经干细胞研究的基础。 目的：建立新生小鼠海马、嗅球、皮质组织神经干细胞的分离培养体系,并对其生物学特性进行分析。 方法：分离新生昆明小鼠海马、嗅球、皮质组织,采用机械分离和胰酶消化法提取原代神经干细胞。采用无血清培养技术、机械吹打和酶消化法进行传代培养神经干细胞。以体积分数为10%的胎牛血清诱导分化神经干细胞。对神经干细胞及其分化产物行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色鉴定。 结果与结论：从新生小鼠海马、嗅球、皮质可提取出具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞,经巢蛋白、CD133免疫荧光染色检测呈阳性;神经干细胞经胎牛血清诱导后可分化为β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞,并证实染色阳性细胞为神经元和星形胶质细胞。该实验建立了一套神经干细胞体外分离培养、纯化、鉴定、诱导分化方案,为后续神经干细胞研究的顺利进行奠定了实验基础。     

胎鼠神经干细胞的生长、增殖及分化特点观察

目的：建立神经干细胞的分离、培养、分化及鉴定技术；观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点。方法：分离胎鼠大脑皮质及皮质下组织，经消化及机械吹打后，用悬浮培养的方法，获得细胞克隆；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆；用免疫细胞化学方法，鉴定神经干细胞。结果：从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力；原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性；单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论：用此方法分离、培养的细胞具有自我更新和分化潜能、有很强的增殖能力，是属于中枢神经系统的干细胞。     

胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞的分化

背景:在神经干细胞移植治疗帕金森病中,移植细胞的数量及多巴胺能神经元的分化比率是必须解决的问题,而有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化是解决问题的关键所在.目的:探讨胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化.方法:分离妊娠12d小鼠胚胎腹侧中脑,经胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,离心过滤后机械方法传代培养5～7d的神经球,分组进行诱导分化10～12d,待80%细胞从神经球迁移出来,分化为单细胞时,进行免疫细胞化学鉴定及流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞率.结果与结论:神经球细胞表达巢蛋白抗原,能分化为神经元特异性烯醇化酶和胶原纤维酸性蛋白阳性细胞.胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β在体外能明显提高中脑神经干细胞分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元的比例,胶质源性神经营养因子诱导组、白细胞介素1β诱导组和两者联合应用均较空白对照组比例高,尤其是两者联合应用作用更显著,说明胶质源性神经营养因子、白细胞介素1β可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元.     

新生大鼠海马神经干细胞培养及皮质醇和氟西汀对其增殖的影响

目的：探索新生大鼠海马神经干细胞培养及鉴定方法，观察高浓度的皮质酮和抗抑郁剂氟西汀对其增殖的影响。方法：2004-02／06在解放军军事医学科学院毒物药物研究所完成。分离新生第1天大鼠的海马组织，将其制成单细胞悬液后置于无血清条件培养基中进行培养，用免疫细胞化学技术对所培养的细胞特性进行鉴定，用四甲基氮唑兰法观察高浓度的皮质酮和氟西汀对其增殖的影响。结果：从新生大鼠海马分离得到的细胞接种于含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子两种丝裂原刺激因子的条件培养基中，可以持续分裂增殖形成细胞克隆(神经球)，该神经球可以表达神经上皮干细胞蛋白(巢蛋白)。神经球中可以探测到外源性给与的细胞增殖特异性的标记物Brdu。撤除培养基中的丝裂原后，所培养的细胞可以分化，并且分化后可以表达成熟神经元的标志物神经元特异性烯醇化酶或星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白。四甲基氮唑兰法显示，高浓度的皮质酮(100—500μmol／L)可以使吸光度(A570nm)明显降低。而氟西汀(0．5～1．0μmol／L)则使之升高。结论：用此方法分离得到的细胞具有神经干细胞的特性。高浓度的皮质酮可以抑制新生大鼠神经干细胞的增殖，氟西汀可以促进新生大鼠神经干细胞的增殖。     

The characteristics of interpretation of results of analysis of protein amount in urine of pregnant women

The adequacy of implementation of present proteinuria diagnostic thresholds under examination of pregnant women was examined. The analysis was applied to all urine samples of pregnant women from December 2009 to March 20010. The amount of protein in urine was concurrently evaluated by turbidimetric analysis with sulfosalicylic acid, colorimetric analysis with pyrogallol red, "dry chemistry" technology (the diagnostic strips). It is established that the mentioned techniques of analysis of protein in urine provide independent results. The results of colorimetric analysis are characterized by better precision and adequacy. However, in case of pregnant women the diagnostic threshold of protein concentration should be shifted from 0.120 to 0.150 g/l.     

超声评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响

目的 探讨超声在评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响的价值。方法 回顾性收集经病理学证实为头颈部肿瘤、放疗前后的颈动脉超声资料以及其他基线资料完整的患者93例,比较放疗前后放疗侧颈动脉和非放疗侧颈动脉粥样硬化斑块和溃疡斑块的总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积。结果 放疗前后颈动脉超声检查的平均间隔时间为（6.1±1.9）年;放疗前放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积与非放疗侧比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;放疗后放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积均较非放疗侧加重,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论 放疗可导致头颈部肿瘤患者颈动脉粥样硬化斑块的形成和进展,且斑块具有易损性特点。     

《中国内镜杂志》主编雷光华教授简介

雷光华男,1970年12月生,骨科学博士,一级主任医师,二级教授,博士生/后导师。国家"万人计划"领军人才,教育部"长江学者"特聘教授,科技部"中青年科技创新领军人才",国家卫生计生突出贡献中青年专家,享受国务院政府特殊津贴专家,国家临床重点专科骨科和运动医学学科带头人,全国青年岗位能手,湖南省"芙蓉学者"特聘教授,湖南省科技领军人才和骨科学科领军人才,湖南省普通高校学科带头人,湖南省首届"优秀科技工作者",中南大学"湘雅名医"。     

超声诊断主动脉窦瘤

本文报告31例主动脉窦瘤患者,全部用二维超声(2DE)和多普勒超声检查。其中手术治疗24例,超声符合22例,符合率为92％。误诊2例,误诊率为8％。故超声实际诊断主动脉窦瘤29例中右冠窦瘤18例(62％),无冠窦瘤7例(24％),二叶瓣型主动脉窦瘤4例(14％)。窦瘤破入/膨入右室和右房内的例数分别为16例和13例。本病主要的合并症为主动脉瓣关闭不全和室缺。通过分析我们认为二维加多普勒超声是诊断主动脉窦瘤最有价值的无创技术。