Pokemon表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建Pokemon表达慢病毒载体。方法通过PCR扩增Pokemon cDNA,将Pokemon cDNA连接于GV165载体,经测序确认后,将GV165/Pokemon与pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染至293T细胞中,收获病毒,通过Real time PCR测定滴度;将Pokemon表达慢病毒载体侵染293T细胞通过免疫荧光和Western blot检测Pokemon表达慢病毒载体的转染效率和Pokemon的表达能力。结果在感染Pokemon慢病毒载体293T细胞中能检查到Pokemon-GFP融合蛋白的表达。结论成功构建表达Pokemon的慢病毒载体。     

人类微小RNA-1246慢病毒抑制载体的构建及对宫颈鳞癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建并鉴定微小RNA(miRNA)-1246慢病毒抑制载体,并探讨miRNA-1246下调对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响.方法 针对miRNA-1246成熟体的反义核苷酸片段设计引物并合成目的基因miRNA-1246-down,应用基因重组技术将目的基因克隆到空载质粒GV280中,通过酶切、PCR、DNA测序验证重组慢病毒质粒(GV280-miRNA-1246-down)的构建是否成功,将GV280-miRNA-1246-down、Helper 1.0、Helper 2.0共转染293T细胞获得重组慢病毒,浓缩提纯病毒液并检测病毒滴度,再用重组病毒液感染宫颈鳞癌细胞SiHa,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)验证GV280-miRNA-1246-down在SiHa细胞的表达情况,用嘌呤霉素筛选GV280-miRNA-1246-down稳转细胞株.将SiHa细胞分为空白组(NC组)、阴性病毒组(NC-LV组)、miRNA-1246下调组(miRNA-1246-down-LV组),用细胞计数的方法检测细胞的生长率,用Transwell检测细胞侵袭能力.结果 (1)对菌落进行PCR鉴定筛选构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确.(2)慢病毒将目的基因miRNA-1246-down成功导入SiHa细胞中,同时达到稳定表达,转染率达90％以上,在荧光显微镜下能直接观察到GFP.(3) miRNA-1246-down-LV组SiHa细胞增殖数低于其他两组(P＜0.05),细胞穿膜次数较其他两组减少(P＜0.05).结论 miRNA-1246慢病毒抑制载体构建成功,miRNA-1246稳定下调的SiHa细胞株建立成功.在SiHa细胞中miRNA-1246下调可抑制宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖以及侵袭能力.     

Math1基因重组慢病毒的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建携带Math1基因的重组慢病毒载体,检测其滴度,检测其在293T细胞中的表达.方法 PCR扩增Math1基因,将其连入慢病毒栽体pLenti-GFP中;在感受态细胞DH5α中培养扩增,并行Math1基因的测序鉴定;将重组的慢病毒四质粒共转染293T细胞,收获并浓缩病毒;感染293T细胞和提取细胞DNA后用实时定量PCR法检测病毒滴度.用逆转录PCR和westem blot法检测Mathl基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结果 构建的慢病毒载体pLenti-Math1-GFP经测序分析证实基因序列正确.四质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度约为3X10"Tu/L.逆转录PCR和Western blot法均能检测Math1基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结论 成功构建携带Math1基因的重组慢病毒,并能在293T细胞中表达.     

小窝蛋白-1重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建小窝蛋白-1（Cav-1）重组慢病毒载体，并在293T细胞和小鼠中验证Cav-1过表达。方法将Cav-1基因克隆至慢病毒载体GV287，然后利用酶切、PCR扩增鉴定、阳性克隆鉴定及测序验证构建Cav-1重组慢病毒。将Cav-1重组慢病毒转染至293T细胞，通过荧光检测慢病毒转染效果，采用Westernblot法检测Cav-1蛋白表达情况，同时转染C57BL6小鼠，免疫组化法检测小鼠肺组织中Cav-1的表达情况。结果经酶切、PCR扩增鉴定以及阳性克隆测序，提示Cav-1重组慢病毒构建正确。荧光检测显示转染Cav-1重组慢病毒后的293T细胞可见强荧光，Westernblot法检测结果显示目的基因可表达，小鼠肺组织中Cav-1呈强阳性表达，且实时定量PCR检测Cav-1重组慢病毒滴度为1.3×1012copies/ml，达到可利用标准。结论采用本研究方法可成功构建Cav-1重组慢病毒载体。     

Robo1RNA干扰慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的 构建Roundabout (Robo1) siRNA慢病毒载体,并在SKOV3卵巢癌细胞中鉴定其转染及基因沉默效果.方法 根据GenBank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,制备Robo1 DNA片段,在T4 DNA连接酶作用下,将线性化的病毒载体GV118与DNA片段制备合成GV118-siRNA目的 质粒,转化感受态细胞,对于长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对比分析,重组病毒质粒与另外2种辅助包装原件载体质粒通过LipofectamineTM2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度;并检测病毒载体在工具细胞SKOV3卵巢癌细胞中的转染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot方法 检测Robo1 siRNA慢病毒对SKOV3中Robo1的干扰作用.结果 成功构建Robo1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,病毒滴度为2×109 TU/mL;用该病毒体外转染SKOV3卵巢癌细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率大于90%;RT-PCR和Western blot方法 检测Robo1基因沉默的效率分别为76.7%、56.0%.结论 成功构建了Robo1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,该病毒载体在体外转染SKOV3卵巢癌细胞的效率较高,且具有显著的基因沉默效果.     

含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建心脏阿霉素反应蛋白（CARP）基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素（ADR）心肌病中的作用及机制奠定基础。方法：将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA（shRNA）序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果：基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍（P=0.01）,shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%（P=0.02）。结论：成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。     

小鼠BTLA基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建小鼠B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因重组慢病毒载体,探讨BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞增殖及活化的影响。方法:以小鼠脾脏组织总RNA为模板,逆转录为c DNA,通过PCR技术扩增BTLA基因,构建p WPTS-m BTLA慢病毒载体,磷酸钙法感染人胚肾上皮细胞株293T细胞。RT-PCR及Western blot法检测BTLA m RNA和BTLA蛋白表达,50%组织培养感梁剂量(TCID50)法检测重组慢病毒滴度。通过感染p WPTS-m BTLA及p WPTS-GFP慢病毒载体的293T细胞与小鼠脾脏T淋巴细胞混合培养,初步研究BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞活化与增殖的影响。结果:成功构建小鼠p WPTS-m BTLA慢病毒载体,并制备高滴度病毒颗粒(1.3×108pfu/ml)。通过对比实验组与对照组小鼠脾T淋巴细胞的增殖结果 ,发现4 d及8 d T细胞的增殖效应均明显受抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),且这种抑制作用在0~8 d内具有时间依赖性。结论:过表达BTLA基因的293T细胞与小鼠脾T淋巴细胞混合培养后对其增殖及活化有抑制作用,提示成功构建具有生物学效应的小鼠BTLA基因重组慢病毒载体。     

大鼠PEDF44mer慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建大鼠色素上皮衍生因子（PEDF）44mer基因的慢病毒表达载体并检测其表达.方法 化学合成PEDF 44mer-6his,亚克隆入GV206载体,测序鉴定.挑取阳性克隆转染293T细胞,实时荧光定量PCR法测定病毒滴度.将已构建的病毒转染293T细胞,RT-PCR和Western blot法检测44mer-6his表达.结果 阳性克隆测序与设计的44mer基因序列完全一致,44mer慢病毒构建成功.实时荧光定量 PCR法检测病毒滴度为2.00E＋9 TU/ml.44mer慢病毒转染293T细胞后,RT-PCR检测到44mer表达.Western blot显示44mer-6his融合蛋白表达阳性.结论 成功设计构建了PEDF 44mer慢病毒,为进一步研究44mer在缺血性心肌病中的作用和机制奠定基础.     

NOC2L基因重组慢病毒表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建NOC2L基因重组慢病毒并使其在293T细胞中表达。方法通过设计引物及PCR扩增获得NOC2L全基因片段,将pCDH-GFP载体分别用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切制备线性化载体;NOC2L全基因片段和线性化载体经切胶回收后,通过同源重组反应将NOC2L全基因片段连接到线性化的pCDH-GFP载体上,构建pCDH-NOC2L-GFP慢病毒表达载体;通过菌落PCR、质粒双酶切、测序等方法对构建的NOC2L基因重组慢病毒表达载体进行鉴定,利用构建的pCDH-NOC2L-GFP包装NOC2L慢病毒并使用该慢病毒感染293T细胞。结果菌落PCR、质粒双酶切和测序结果显示成功将NOC2L基因连接到pCDH-GFP载体上,使用构建成功的pCDH-NOC2L-GFP转染293T细胞,能够成功转染及包装NOC2L基因重组慢病毒,同时包装好的NOC2L基因重组慢病毒能够成功感染293T细胞并过表达293T细胞中的NOC2L基因。结论采用本研究方法能成功构建NOC2L基因重组慢病毒表达载体。     

人血管生成素1基因慢病毒表达载体的构建及其在脐带间充质干细胞的表达

目的 通过基因重组技术构建人血管生成素-1(Ang-1)基因慢病毒表达载体,并检测其在人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的表达及对hUC-MSCs免疫抑制能力的影响。 方法 应用Trizol法从hUC-MSCs提取总RNA,反转录获取cDNA,PCR扩增获得编码Ang-1的序列克隆到GV287载体中。将重组GV287-Ang-1载体质粒和慢病毒包装质粒pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染293T细胞,收集病毒上清,纯化浓缩测定病毒滴度。采用荧光显微镜观察转染效率,Western blotting法检测Ang-1蛋白表达,并通过CCK8试剂盒检测T淋巴细胞增殖活性。 结果 Ang-1基因扩增PCR产物与预期大小一致。重组慢病毒GV287-Ang-1质粒经PCR和DNA测序分析显示,所得结果与目的基因序列一致且插入方向正确。包装慢病毒浓缩悬液滴度为2×10⁸TU/mL,最佳感染复数为8。GV287-Ang-1转染组细胞Ang-1表达显著高于未转染组和GV287转染组。过表达Ang-1的hUC-MSCs对T淋巴细胞的增殖抑制显著高于单纯的hUC-MSCs。 结论 成功构建携带Ang-1基因的慢病毒载体GV287-Ang-1,并可有效转染hUC-MSCs过表达Ang-1蛋白,且能显著提高hUC-MSCs的免疫抑制能力。     

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建

目的：构建过表达VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体,为勃起功能障碍基因治疗的研究提供有效工具。方法：根据GenBank中基因信息,设计合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法扩增目的基因片段,运用基因重组技术将其克隆至慢病毒表达载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,经酶切、测序对重组质粒进行验证。将重组质粒和Helper1.0、pHelper2.0辅助质粒共转染293T细胞,包装双基因过表达慢病毒并测试其滴度。结果：经酶切和测序鉴定表明VEGF和Smad7双基因重组慢病毒载体构建成功,荧光法测定重组慢病毒滴度高（2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重组慢病毒能高效转染293T细胞,Western blot检测显示VEGF和Smad7蛋白在靶细胞中过表达。结论：成功构建了携带VEGF和Smad7基因并能正确表达的高滴度的重组慢病毒载体。     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素(PTHLH)基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒(含EGFP基因)上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒(pGC-FU)和过表达PTHLH的慢病毒(pGC-FU/PTHLH);或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

膀胱平滑肌细胞乙酰胆碱M3受体干扰RNA慢病毒载体的构建

目的 构建膀胱平滑肌细胞（bladder smooth muscle cells,BSMCs） M₃型受体干扰RNA慢病毒载体。方法 合成4条M₃受体干扰序列,构建GV118-sh-M₃慢病毒载体,测序验证序列。将GV118-sh-M₃慢病毒载体与质粒pHelper1.0、pHelper 2.0三个载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用荧光法检测4组病毒滴度。体外原代培养BSMCs,4组GV118-sh-M₃慢病毒（KD1、KD2、KD3和KD4）转染BSMCs,观察绿色荧光蛋白表达并通过RT-PCR、Western blotting法检测各组干扰效率。结果 成功构建4个GV118-sh-M₃慢病毒载体,测序结果符合设计序列。4组GV118-sh-M₃慢病毒滴度分别为2×10⁸、6×10⁸、5×10⁸和5×10⁸ TU/mL。分别转染BSMCs后,KD1组绿色荧光蛋白表达量最高且干扰效率最高。结论 成功包装并筛选了GV118-sh-M₃慢病毒载体,为后续进一步研究干扰M₃受体在神经源性膀胱中的作用奠定了基础。     

表达UGT1A1重组腺相关病毒载体的构建

目的 获得表达胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸酶（UGT1A1）基因；构建UGT1A1重组腺相关病毒载体，制备腺相关病毒。方法 设计、合成引物，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）从HepG2细胞总RNA中扩增UGT1A1基因，最终连接于pAAV—MCS．双酶切、PCR鉴定阳性重组质粒。并在HEK293T细胞表达，制备高滴度重组腺相关病毒。结果 成功扩增了人类UGT1A1基因．构建表达UGT1A1基因重组腺相关病毒载体。并成功表达于HEK293T细胞。结论 本实验构建的人类UGT1A1重组腺相关病毒将为因UGT1A1活性不足导致的高胆红素血症的基因治疗奠定基础。     

DDX46基因慢病毒载体的构建及其在人膀胱癌细胞中的表达

目的 构建DDX46基因低表达慢病毒载体,并检测其在人膀胱癌细胞中的表达效果,为DDX46基因在人膀胱癌细胞中的研究奠定基础.方法 应用实时荧光定量检测5637细胞和T24细胞中DDX46 mRNA表达水平,以寻找合适的细胞系进行实验.分别以DDX46基因序列和普适型阴性序列为模板,设计合成靶点序列,并合成寡核苷酸双链,定向克隆到慢病毒质粒GV115,合成重组质粒shDDX46和shRNA,分别称之为实验组和对照组.将不同重组质粒与pHelper 1.0和pHelper 2.0分别转染293 T细胞以包装成慢病毒颗粒后感染5637细胞和T24细胞.应用实时荧光PCR定量检测重组慢病毒感染5637细胞和T24细胞后DDX46mRNA表达水平,判断其干扰效率.结果 5637细胞和T24细胞均高丰度表达DDX46mRNA,其结果(用ΔCt值表示)分别为(6.53±0.08)和(8.48±0.11);重组慢病毒感染膀胱癌细胞后,在5637细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.32±0.01),低于对照组(1.00±0.10),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为67.70％;在T24细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.11±0.01),低于对照组(1.00±0.03),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为89.00％.结论 成功构建DDX46基因低表达慢病毒载体,为研究DDX46基因在膀胱癌细胞中的作用奠定了基础.     

人促甲状腺激素受体HEK 293T细胞稳定表达株的构建

目的 构建人促甲状腺激素受体（hTSHR）稳定表达株,用于研究抗甲状腺新药。方法 AgeⅠ/NheⅠ双酶切载体GV266和hTSHR基因,T4连接酶连接构建GV266-hTSHR表达质粒。转染GV266-hTSHR到293T细胞后,Western blot证明hTSHR表达。用Opti-MEM、Lipofectamine 2000、辅助质粒在293T细胞构建GV266包装质粒。qPCR测定包装病毒滴度。用GV266包装质粒、GV266-hTSHR表达质粒共转染293T细胞获得GV266-hTSHR-293T稳定表达株。绿色荧光蛋白(GFP)荧光鉴定稳定表达株。结果 GV266-hTSHR构建物阳性大肠杆菌克隆的DNA测序结果与hTSHR序列比对100%吻合。Western blot显示,过表达hTSHR的 HEK 293T细胞出现相对分子质量为62×103的目的条带。qPCR测定包装质粒滴度达到了2×108 TU/mL。GV266-hTSHR-293T细胞稳定表达株表达GFP荧光。结论 构建了GV266-hTSHR表达质粒,获得了GV266-hTSHR-HEK 293T稳定表达株,为研究抗甲状腺多肽提供了必要的实验材料。     

KCTD10基因干扰RNA慢病毒载体的构建

目的:构建KCTD10干扰RNA慢病毒载体.方法:合成KCTD10干扰序列,构建GV248-KCTD10-RNAi慢病毒干扰载体,利用PCR与测序验证阳性克隆.将KCTD10 siRNA干扰病毒载体与质粒pHelper1.0和质粒pHelper2.0三个载体共同转染293T细胞,使细胞合成并分泌释放病毒颗粒.收集病毒颗粒并检测病毒滴度.结果:GV248-KCTD10-RNAi慢病毒载体成功被连接转化,测序结果与设计序列一致;共转后收获KCTD10 siRNA慢病毒颗粒,检测其滴度为5×108TU/mL.结论:成功包装了KCTD10 siRNA慢病毒颗粒,为后续进一步研究KCTD10基因在糖尿病视网膜病变中的作用奠定了基础.     

NSPc1-siRNA重组慢病毒的构建及其对U87细胞NSPc1基因的沉默效应

【目的】构建包装NSPc1-si RNA慢病毒颗粒,并在U87胶质瘤细胞中鉴定其感染及基因沉默效果。【方法】根据Gen Bank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,制备合成GV118-si RNA目的质粒,转化感受态细胞,对于长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对比分析,重组病毒质粒与另外2种辅助包装载体质粒通过Lipofectamine TM2 000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度;并检测病毒颗粒在目的细胞U87胶质瘤细胞中的感染效率,实时荧光定量PCR（RT-PCR）和Western blotting方法检测NSPc1 si RNA慢病毒对U87中NSPc1的干扰作用。【结果】成功构建NSPc1 si RNA慢病毒载体GV118-si RNA,重组病毒滴度为4×10^8TU/ml;用该病毒体外感染U87胶质瘤细胞,当感染复数（MOI）为10时,感染效率大于90%;RT-PCR和Western blotting方法检测NSPc1基因沉默的效率分别为66.4%、60.0%。【结论】成功构建了NSPc1 si RNA慢病毒载体GV118-si RNA,该重组病毒包装后在体外感染U87胶质瘤细胞的效率较高,且具有显著的基因沉默效果。     

人类醛糖还原酶类似蛋白1 siRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建人类醛糖还原酶类似蛋白1（ARL-1）siRNA幔病毒载体。方法设计针对于ARL-1Mma的siRNA,将siRNA连接于pENTRTM／U6载体,经测序确认后,通过免疫印迹和AI也-1酶活性鉴定验证ARL-1siRNA慢病毒载体的功能。结果ARL-1siRNA慢病毒载体能有效地沉默HCT8细胞内ARL-1的表达,降低HCT8细胞内ARL-1的酶活性。结论获得了能有效抑制细胞内ARL-1蛋白表达的ARL-1siR-NA慢病毒。