胶质母细胞瘤细胞系GL15生物学特性的实验研究

目的 明确GL15细胞系的生物学特征并探讨表皮生长因子(EGF)对GL15细胞系生物学特征的影响.方法 观察GL15细胞的形态和生长增殖特性,Giemsa染色分析核型,免疫细胞化学行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、增殖细胞核抗原(PCNA)染色,流式细胞仪分析细胞周期,Transwell、MTT法检测EGF对GL15细胞生物学特征的影响,与U251MG和U373MG细胞系进行比较.结果 GL15细胞为典型的胶质母细胞瘤形态,核型分析显示多条染色体均有扩增,其中EGF受体所在的7号染色体数目增加较为明显(4条7号染色体).GFAP和PCNA分别在胞浆和胞核呈阳性表达.EGF可双向调节细胞增殖活性、侵袭性及GFAP蛋白表达.结论 GL15细胞系保持了胶质母细胞瘤的生物学特征,是研究胶质母细胞瘤理想的细胞平台.该细胞系的生物学特性与EGF受体有紧密关系.     

LRIG2基因短发夹RNA表达载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

目的 构建针对富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,建立稳定转染的细胞株,观察其对目的 基因表达的影响.方法 根据GenBank中LRIG2基因序列设计2条RNA干扰序列,命名LRIG2-shRNA1、LRIG2-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil 2载体,转化扩增后进行序列测定.用不同浓度的G418作用于GL15细胞,得到G418对于GL15细胞的筛选浓度.3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑单克隆后扩增获得稳定株.逆转录RT-PCR和Western印迹法分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG2的表达.结果 3种重组表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-LRIG2-shRNA2和pGenesil 2-negative shRNA)经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确.G418对于GLl5细胞的筛选浓度为600μg/ml,筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA2组细胞LRIG2 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-negative shRNA组.结论 成功构建了针对LRIG2基因的shRNA表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA2),转染细胞后可抑制LRIG2基因表达,为研究LRIG2基因的功能提供了基础.     

LRIG1诱导人胶质瘤细胞凋亡与表皮生长因子受体基因关系

目的 研究LRIG1诱导神经胶质瘤细胞的凋亡作用,探讨LRIG1对表皮生长因子受体信号转导通路抑制效应的分子机制.方法 采用Lipofectamine介导的基因转染技术,将质粒pcDNA3.1-LRIG1转染原代神经胶质瘤细胞,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测转染后胶质瘤细胞LRIG1和EGFR mRNA与蛋白水平的变化,Western blot方法检测神经胶质瘤细胞PKCα、Bax、bcl-2蛋白水平的变化.MTT法和流式细胞技术分析细胞的增殖和凋亡的变化.结果 细胞中转染pcDNA3.1-LRIG1组中以LRIG1 mRNA和蛋白质的表达水平较未处理组和转染空载体组明显升高,而EGFR mRNA和蛋白质的表达水平较对照组和转染空载体组明显降低,PKCα、Bax表达上调,bc1-2表达下降,胶质瘤细胞生长受到抑制,凋亡显著增强.结论 LRIG1可能通过参与形成EGFR的负反馈环,从多种途径抑制了肿瘤的生长.     

Mfn2基因过表达对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及EGFR、EGF蛋白表达的影响

目的 通过使人乳腺癌MCF-7细胞过表达线粒体融合素基因-2(Mfn2),研究外源性Mfn2基因对MCF-7细胞增殖及对表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)蛋白表达的影响.方法 实验分为对照组、转染空质粒pEGFP-N1组、转染Mfn2质粒的pEGFP-Mfn2组.转染48 h后,检测各组细胞的转染效率、Mfn2mRNA及Mfn2蛋白表达.检测各组MCF-7细胞增殖情况、各组MCF-7细胞周期分布情况.同时检测各组EGFR及EGF蛋白表达情况.结果 转染48 h后pEGFP-N1组及pEGFP-Mfn2组转染效率分别为(49.15±2.04)％及(51.10±2.18)％,高于对照组[(0.58±0.21)％,P＜0.05];pEGFP-Mfn2组的Mfn2 mRNA及Mfn2蛋白表达均显著高于对照组及pEGFP-N1组(P＜0.05);pEGFP-Mfn2组MCF-7细胞增殖抑制率显著高于其余两组(P＜0.05),细胞周期主要阻滞于G0/G1期;pEGFP-Mfn2组EGFR和EGF蛋白表达水平显著低于其余两组(P＜0.05).结论 Mfn2基因过表达可显著抑制MCF-7细胞增殖,其机制可能与Mfn2基因过表达导致了EGFR及EGF表达下调有关.     

RNA干扰技术对SKOV3细胞EGFR表达的抑制作用

目的 探讨RNA干扰(RNAi)技术对卵巢腺癌细胞株SKOV3表皮生长因子受体(EGFR)表达的抑制作用.方法 体外化学合成EGFR序列特异性双链RNA(dsRNA),用lipofectamin 2000转染SKOV3细胞,采用RT-PCR和Western blotting技术检测EGFR mRNA和蛋白水平的变化,通过水溶性四唑盐(WST-1)比色法检测细胞增殖力,采用细胞黏附和移动实验检测细胞体外黏附和移动能力,通过细胞侵袭重建基底膜实验检测细胞体外侵袭能力.结果 序列特异性dsRNA-EGFR对SKOV3细胞EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为73.65%和58.94%.dsRNA-EGFR组在转染后24、48、72 h细胞增殖抑制率分别为22.54%、35.76%、31.07%;dsRNA-EGFR组在30 min和90 min黏附实验中的黏附率分别下降12.11%和18.66%;转染dsRNA-EGFR后细胞体外移动和侵袭能力的抑制率分别为25.47%和22.08%.结论 化学合成的dsRNA可抑制卵巢癌SKOV3细胞EGFR表达,抑制细胞增殖、移动、黏附和侵袭力.     

TRIM22通过PI3K/AKT信号通路调控胶质母细胞瘤增殖、侵袭和迁移的研究

目的：探讨基因TRIM22在人脑胶质母细胞瘤中的表达及对增殖、侵袭和迁移等生物能力的影响。方法：通过TCGA数据库分析胶质母细胞瘤组织和正常脑组织中TRIM22表达水平,采用实时定量PCR（qRT?PCR）和Western blot 两种方法分别检测胶质母细胞瘤细胞系U87和U251中TRIM22 mRNA和蛋白表达水平。应用Lipofectamine 3000将2种TRIM22?siRNA分别转染至U87及U251细胞中,再分别通过qRT?PCR和Western blot检测胶质母细胞瘤细胞中TRIM22敲低效率。 应用CCK?8法、细胞平板克隆形成实验来评估TRIM22敲低后对于细胞增殖能力的影响;应用细胞划痕实验和Transwell实验检测TRIM22敲低后细胞侵袭和迁移能力的变化。应用Western blot检测TRIM22敲低对PI3K/AKT信号通路蛋白和上皮间质化标记蛋白（N?cadherin、Vimentin、E?cadherin）表达的影响。结果：在U87及U251细胞中敲低TRIM22后,细胞增殖、侵袭和迁移都明显减弱,p?AKT（S473）、N?cadherin、Vimentin表达水平则明显降低,E?cadherin表达水平明显升高。结论：TRIM22可能通过调节PI3K/AKT信号通路调控胶质母细胞瘤增殖、侵袭和迁移能力。     

靶向EGFR基因RNA干扰对人卵巢癌SKOV_3细胞增殖的抑制作用

目的 利用RNA干扰技术下调表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的表达,观察其对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响.方法 构建针对EGFR基因的siRNA真核表达载体,转染入卵巢癌SKOV_3细胞中,并筛选稳定表达siRNA的转化克隆,RT-PCR及Western blot分别检测EGFR mRNA和蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,克隆形成实验及MTY法检测细胞克隆形成率及细胞体外的增殖情况.结果 成功构建表达质粒pGenSil-HK、pGcnSil-EGFRI和pGenSil-EGFR2,并转染SKOV,细胞,通过G418筛选后获得稳定转染克隆,RT-PCR及Western blot分析表明转染pGenSil-EGFRI、pGenSil-EGFR2后的细胞EGFR mRNA和蛋白表达均受到了明显抑制,FGFR mRNA抑制率分别为41.87%和68.07%,蛋白表达抑制率分别为45.21%和70.25%.与未转染组和pGenSil-HK组相比,pGenSil-EGFR2组细胞凋亡比例显著增加,G_1期细胞增多,而S期细胞减少(P<0.05);转染pGenSil-HK组克隆形成率为(0.82±0.03),转染pGenSil-EGFR2组克隆形成率为(0.61±0.04),二者比较差异显著(P<0.05),MTT显示细胞培养36 h后,pGenSil.EGFR2组的细胞生长均显著低于未转染组和转染pGenSil-HK组(P<0.05).结论 靶向EGFR基因RNA干扰能够阻抑卵巢癌SKOV_3细胞中的EGFR表达,诱导细胞凋亡、调控细胞周期再分布、抑制细胞增殖.     

小干扰RNA沉默EGFR基因对卵巢癌细胞侵袭力的影响

目的 通过小干扰RNA(siRNA)沉默表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,旨在探讨其对卵巢癌SKOV3细胞体外侵袭力影响.方法 体外构建靶向EGFR基因siRNA质粒和阴性对照质粒, Lipofectamin 2000介导转染到SKOV3细胞中.实验分空白对照组、非特异性转染组、特异性转染组.采用RT-PCR和免疫细胞化学法检测EGFR基因mRNA和蛋白表达水平;采用平板克隆形成法检测细胞生长增殖能力;采用Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭力.结果 特异性转染组细胞EGFR mRNA 的表达与其他两组相比明显减弱(F=50.45,q=12.87、11.72,P<0.01),EGFR 蛋白表达明显下调(F=61.54,q=14.58、11.46,P<0.01);细胞生长增殖能力减弱(F=130.12,q=21.12、18.15,P<0.01);体外侵袭力明显降低(F=34.09,q=11.26、8.34,P<0.01).结论 siRNA可以有效抑制SKOV3细胞EGFR基因的表达,从而抑制SKOV3细胞增殖和侵袭能力.     

RNA干扰技术对SKOV3细胞EGFR表达的抑制作用

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术对卵巢腺癌细胞株SKOV3表皮生长因子受体(EGFR)表达的抑制作用。方法体外化学合成EGFR序列特异性双链RNA(dsRNA),用lipofectamin 2000转染SKOV3细胞,采用RT-PCR和Western blotting技术检测EGFR mRNA和蛋白水平的变化,通过水溶性四唑盐(WST-1)比色法检测细胞增殖力,采用细胞黏附和移动实验检测细胞体外黏附和移动能力,通过细胞侵袭重建基底膜实验检测细胞体外侵袭能力。结果序列特异性dsRNA-EGFR对SKOV3细胞EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为73.65%和58.94%。dsRNA-EGFR组在转染后24、48、72 h细胞增殖抑制率分别为22.54%、35.76%、31.07%;dsRNA-EGFR组在30 min和90 min黏附实验中的黏附率分别下降12.11%和18.66%;转染dsRNA-EGFR后细胞体外移动和侵袭能力的抑制率分别为25.47%和22.08%。结论化学合成的dsRNA可抑制卵巢癌SKOV3细胞EGFR表达,抑制细胞增殖、移动、黏附和侵袭力。     

Association of expression of Leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2 gene with invasiveness of pituitary adenoma

The Leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains-2(LRIG2) gene expression in pituitary adenoma and its correlation with tumor invasiveness were studied.The expression of LRIG2 mRNA and protein in human pituitary adenoma obtained surgically was detected by RT-PCR(39 cases) and immunohistochemical staining(30 cases).It was found that LRIG2 was mostly localized at the nucleus of the pituitary adenoma cells.Its expression was significantly higher in the invasive cases than in the non-invasive cases.LRIG2 protein was positive in 14 cases out of 21 cases of invasive adenoma,but only 2 cases were positive in 9 cases of non-invasive adenoma.The positive expression rate of LRIG2 mRNA was 91.3% in invasive cases(total 23 cases) and 62.5% in non-invasive cases(total 16 cases),respectively.LRIG2 gene is overexpressed in invasive pituitary adenoma.It may play an important role in pituitary adenoma invasiveness and further studies are necessary to elucidate the mechanism under this phenomenon.     

Tip30基因表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响

目的：分析Tip30表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。方法：聚乳酸-羟乙酸(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)纳米粒介导腺相关病毒质粒pAAV-Tip30真核表达质粒转染HepG2细胞。RT-PCR检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2,MMP-9和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)mRNA水平;Western印迹 检测MMP-2和MMP-9蛋白表达水平;Transwell法检测肝癌细胞迁移能力;四氮唑盐(MTS)法和细胞集落形成实验检测细 胞增殖能力;细胞-细胞黏附试验、细胞-基质黏附实验检测Tip30表达对肝癌细胞黏附能力的影响。结果：过表达Tip30 基因的HepG2肝癌细胞明显降低了MMP-2,MMP-9的mRNA表达和蛋白的翻译;肝癌细胞的增殖、锚定非依赖性生长及 肝癌细胞迁移能力均明显受到抑制。结论：体外实验研究证明Tip30基因可抑制肝癌细胞侵袭转移的能力。     

Notch 1 对舌麟状细胞癌Tca8113细胞表皮生长因子受体表达的影响及其意义

目的：将编码Notch 1胞內域（NICD）转染人舌麟状细胞癌（舌麟癌）Tca8113细胞,探讨Notch 1在Tca8113细胞中的作用及其对表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响。方法：采用脂质体法将编码NICD的pRAMIC-IRES2-EGFP目的质粒和pIRES2-EGFP对照质粒分别转染人舌麟癌Tca8113细胞,实验分为目的质粒pRAMIC-IRES2-EGFP转染组、对照质粒pIRES2-EGFP转染组和非转染组。采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫细胞化学法观察细胞中Notch 1mRNA及蛋白和EGFR mRNA及蛋白表达水平,MTT法检测Tca8113细胞的增殖活性并计算细胞存活率。结果：转染后,与非转染组和对照质粒pIRES2-EGFP转染组比较,pRAMIC-IRES2-EGFP目的质粒转染组Notch 1 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,而EGFR mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,细胞存活率明显降低（P<0.05）。与非转染组比较,对照质粒pIRES2-EGFR转染组Notch 1 mRNA和蛋白表达水平、EGFR mRNA和蛋白表达水平及细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05）。结论：Notch 1对舌麟癌Tca8113细胞增殖的影响可能与EGFR的表达下调有关。     

Effect of over-expressed LRIG3 on cell cycle and survival of glioma cells

This study examined the effects of over-expression of leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 3 (LRIG3) on the cell cycle and survival of human glioma cell line U87 and U251 and explored t...