细胞穿膜肽与人表皮生长因子在大肠杆菌中的重组融合表达

该研究构建了细胞穿膜肽Pep-1和人表皮生长因子hEGF融合基因（epEGF）的重组表达质粒PGEX-4T-1-epEGF,并成功转化大肠杆菌BL21（DE3）得到重组大肠杆菌株BL21（DE3）/PGEX-4T1-epEGF。通过IPTG诱导发酵,制备重组融合人表皮生长因子蛋白,并初步尝试建立纯化研究,有效实现了人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的可溶性表达。该研究通过发酵条件优化,发现发酵过程中温度、诱导剂浓度、诱导时间、培养基都是影响蛋白表达量的关键因素;温度在20 ℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间8 h、培养基为TB液体培养基,目的蛋白占总蛋白的量达到21.58%,蛋白浓度为0.13 mg/mL。菌体破碎液上清经过GST亲和层析融合蛋白纯度达到66.82%,阴离子交换层析后融合蛋白纯度达到92.57%。该研究成功在大肠杆菌中表达出可溶形式的hEGF,且纯化工艺较简单,为hEGF的进一步开发利用提供了参考。     

植物甜蛋白monellin基因工程菌表达条件的研究

将带有monellin基因的重组分泌型表达载体pETMO转入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组工程菌株BMC33。经IPTG诱导,其所含有的甜蛋白基因可高效表达。研究不同的表达条件对甜蛋白表达水平的影响,得到优化发酵条件:装液量为50 mL/250 mL三角瓶,当培养液OD值达0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓为0.9mmol/L,32℃诱导5 h。此时,甜蛋白monellin表达量可高达细菌可溶性蛋白的44.8%。     

重组降血压肽发酵培养基及发酵条件的优化实验研究

以纯化的融合蛋白包涵体表达量为考核指标,对重组降血压肽发酵培养基的组成和发酵条件进行了优化实验研究。以富含疏水性氨基酸的麦胚水解物为基础培养基,通过正交实验,优化得到大肠杆菌BL21-MF3A3制备重组降血压肽的麦胚培养基配方为:酵母粉0.5%、麦胚酶解物C2.0%、葡萄糖0.5%和NaCl0.5%。对发酵过程中的诱导条件进行正交优化实验,得到最佳的诱导条件为诱导温度32℃、诱导起始OD6001.4和诱导时间10h,在此条件下包涵体表达量可达到535mg·L-1。     

重组大肠杆菌制备珍珠贝源抗氧化肽发酵条件优化

为进一步提高实验室前期构建的产抗氧化肽重组工程菌株DE3-p EGX6p-1-PFMAP制备珍珠贝源抗氧化肽的制备效率,通过摇瓶发酵过程中发酵条件包括诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、培养基、摇床转速和接种量的单因素优化实验确定最佳发酵条件,并进一步利用正交实验优化50 L发酵罐发酵条件,结果表明摇瓶和50 L发酵罐最佳发酵条件一致,均为诱导温度30℃、诱导时间4 h、IPTG浓度0.2 mmol/L、培养基p H7、摇床转速220 r/min和接种量5%(v/v)。该工艺操作方便、过程简单、时间短,能高效制备出目的蛋白,为珠母贝源抗氧化肽的下一步工业化应用提供了有力技术支撑。     

人源内皮抑素在大肠杆菌中的可溶性表达

为高效制备人源内皮抑素(human endostatin, hEDN),解决其在大肠杆菌中的可溶性表达。该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中分别构建了hedn单基因、融合标签共表达和融合表达系统,将重组菌在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导下进行摇瓶发酵,通过SDS-PAGE分析及串联飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight/ionization time of flight, MALDI-TOF/TOF)鉴定hEDN的表达情况。结果表明,在构建的重组菌中只有含有谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase, GST)促溶标签的重组菌株BL21(DE3)/pGEX-6p-1-hedn能成功实现hEDN融合蛋白的可溶性表达。进一步地,通过改变诱导温度、诱导时间、诱导剂IPTG浓度及加入诱导剂IPTG时间来优化hEDN融合蛋白的表达条件,最终确定hEDN融合蛋白的最佳发酵条件为20℃,8...     

人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达

通过将乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b（＋）上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b（＋）-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37 ℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37 ℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca2＋、K＋、Na＋、Mg2＋、Mn2＋都对酶有激活作用,且Mg2＋效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。     

乳源性免疫活性肽在E.coli BL21中分泌表达的诱导条件优化

设计4个乳源性免疫活性肽的目的基因后,利用基因重组技术成功构建原核表达载体pTYB11,并将重组质粒转化到E.coli BL21中,通过改变异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)的浓度、培养时间和培养温度,设计正交试验来优化乳源活性小肽的IPTG诱导表达条件,使目的蛋白可在E.coli BL21中高效表达。依据15% SDS-PAGE电泳分析得到融合蛋白的表达量,选出最适诱导条件为IPTG终浓度0.1～0.2mmol/L,在12～15℃条件下培养20h,得到大小为59.2kD左右的融合目的蛋白,其表达量可占总蛋白表达量的40%,经Western Blotting鉴定正确。     

草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位预测、克隆、表达及其免疫原性分析

应用IEDB、DNAStar、DNAMAN和Snap Gene等生物信息学工具对草莓轻型黄边病毒外壳蛋白的氨基酸残基序列进行分析。选择一段抗原性较强的肽段(位于外壳蛋白27~38氨基酸残基处),依据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性化学合成了该肽段的DNA编码序列(AE)。AE片段克隆至E.coli表达载体pET32a(+)的Eco RⅠ和XhoⅠ位点,获得重组质粒pET32a(+)-AE。含AE片段的开放阅读框长561 bp,编码了一个187氨基酸残基的重组融合蛋白,理论分子质量为20.29kD。重组质粒pET32a(+)-AE分别在E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta中进行了诱导表达和条件优化。重组融合蛋白在E.coli Rosetta中的最佳表达条件为1.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、35℃诱导表达2 h,产率为13.22 mg/L;在E.coli BL21(DE3)中的最佳表达条件是为0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导表达2 h,产率为9.55 mg/L。重组融合蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、质谱鉴定表明,其含有所预测的草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位肽段AE。AE重组融合蛋白经Ni~(2+)亲和色谱纯化、EK酶切、分子筛除去融合蛋白标签后,免疫产蛋鸡。从免疫鸡所产鸡蛋中提取鸡卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,Ig Y),Dot-Blot检测抗体结合活性。结果表明,所提取的IgY可特异性识别AE肽段和SMYEV外壳蛋白。这一结果表明所预测的AE肽段具有较好的免疫原性。     

重组人基质金属蛋白酶2(MMP-2)血红素样蛋白表达优化

为确定重组大肠杆菌(BL21(DE3)/PET42a-PEX)最佳表达条件。在单因素实验的基础之上,以目的蛋白PEX表达量为响应值,应用Box-Behnken中心组合设计建立数学模型,进行响应面分析。响应面分析确定的最优因素水平组合为:LB培养基pH为7.50,诱导时菌液OD600为0.60,IPTG诱导浓度为0.60mmol/L,诱导培养时间为5.0h。对此工艺条件进行验证得到目的蛋白PEX表达量为20.98mg/L。结果显示,优化了基因重组大肠杆菌表达人PEX的条件,为实现基因重组原核工程菌发酵法制备重组PEX奠定了基础。     

基于支持向量机的重组大肠杆菌产脂肪酶MAS1的发酵建模与优化

该研究以来源于海洋放线菌（Streptomyces sp.）W007脂肪酶MAS1为研究对象,将其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并优化了发酵条件。首先,通过单因素实验确定重组大肠杆菌表达脂肪酶的最佳诱导时间为对数生长后期,最佳异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度为0.6 mmol/L,最佳诱导pH值为6.5,最佳诱导温度为20 ℃。然后,用R语言rsm包设计Box-Behnken试验,并在7 L发酵罐中进行发酵试验以得到Box-Behnken实验数据。最后,通过支持向量机（Support Vector Machines,SVM）-遗传算法（Genetic Algorithm,GA）计算得到重组大肠杆菌BL21（DE3）表达脂肪酶MAS1的最优发酵条件：IPTG浓度为0.65 mmol/L、诱导温度23 ℃、诱导pH值为6.7时,理论脂肪酶MAS1酶活力为2 276.99 U/mL。在7 L发酵罐中,使用优化后的发酵条件进行重组大肠杆菌BL21（DE3）培养时,得到最大脂肪酶MAS1酶活力为2 316.02 U/mL,比未优化之前（1 733.33 U/mL）提高了33.61%。上述结果表明SVM-GA在重组大肠杆菌发酵条件优化方面具有较好的性能,为脂肪酶MAS1的高效制备提供了一定的研究依据。     

重组融合蛋白MBP-PAI的表达、纯化及酶活测定

为了解决亚油酸异构酶(Linoleic Acid Isomerase,PAI)在大肠杆菌中形成包涵体的问题,选择麦芽糖结合蛋白(Maltose-Binding Protein,MBP)标签和低温诱导表达系统pColdV,构建了大肠杆菌重组表达菌株E.coli BL21(pCold-Mpai),并对其诱导表达条件进行了优化。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白MBP-PAI成功表达,重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导温度15℃、IPTG添加量0.1 mmol/L、诱导时间12 h,在该诱导条件下,与未融合MBP的PAI相比,MBP-PAI的可溶性表达量为后者的18倍、酶活为后者的1.5倍。经过MBPTrap HP亲和层析柱纯化后,MBP-PAI纯蛋白质的比酶活为1.58 U/mg,能够转化亚油酸形成反10,顺12-共轭亚油酸。     

表达金丝桃素合成酶的基因工程菌发酵工艺研究

采用摇瓶发酵试验，分别对影响工程菌生长和表达的条件：培养基初始pH值、诱导温度、诱导时间、诱导物浓度等进行了考察，优化了重组大肠杆菌的发酵条件，确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺，即工程菌在pH值为7．4、温度为25℃、IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖）浓度为0．8mmol／L时蛋白表达量最高。     

金黄色葡萄球菌SaeP蛋白表达条件的优化

对金黄色葡萄球菌SaeP蛋白在大肠杆菌中的表达工艺进行优化,提高SaeP蛋白的表达量,为深入研究Sae系统对金黄色葡萄球菌产生毒力因子的机制提供支持。通过单因素法以及全面实验法确定最佳的宿主菌、诱导剂浓度、诱导温度以及诱导时间。结果表明:将通过无限克隆法(Restriction Free Cloning, RF)构建的重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主中,用浓度为0.5 mmol/L的IPTG,在16℃条件下诱导8 h,金黄色葡萄球菌SaeP蛋白的相对表达量最高金黄色葡萄球菌SaeP蛋白的最高表达量占总蛋白的35.14%,较原诱导条件提高25.49%。     

Lg-Flo1蛋白N端的诱导表达及活性研究

研究了Lg-Flo1蛋白N端的诱导表达条件及与甘露糖的结合活性。将构建的巴氏酵母Lg-FLO1基因N端序列的重组表达载体p ETFL1进行双酶切验证,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过菌落PCR鉴定阳性转化子,并进行诱导表达,利用SDS-PAGE检测不同诱导条件对目的蛋白N-Lg-Flo1表达的影响,并对目的蛋白进行变性溶解、纯化、复性及活性测定。结果表明,酶切证实重组表达载体含有N-Lg-FLO1基因片段;在LB培养基中的表达量高于TB培养基;和IPTG相比,乳糖诱导同样可以表达含量较高的目的蛋白且成本较低。以乳糖作为诱导剂,终质量浓度为0. 2 g/L,诱导温度37℃,诱导6 h,目的蛋白的表达量均高于30%;荧光光谱分析表明,复性后的N-Lg-Flo1蛋白具有与甘露糖结合的活性。该研究为大规模生产絮凝蛋白并以此为原料制备糖的特异性吸附剂奠定了基础。     

鲑精蛋白基因工程菌高效表达条件的优化

为了提高鲑精蛋白基因工程菌融合蛋白的表达量,本文对工程菌的发酵培养基组分、培养基初始pH值、发酵种子接种量、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时机、诱导时间等因子进行了筛选。试验结果表明,培养基组分、诱导温度、诱导时机和诱导时间是影响融合蛋白表达量的主要因素。经筛选,最佳发酵条件是以PYJ-2为发酵培养基,37℃下培养3～5h后,以5mmol/L的乳糖诱导工程菌6～8h表达融合蛋白,融合蛋白表达量从18.90%提高到40.10%。     

海洋假单胞杆菌褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的高效表达和活性检测

利用PCR方法从假单胞杆菌基因组DNA扩增胞外褐藻胶裂解酶的全基因和缺损片段,构建表达质粒pQE30-aly32和pQE30-aly165,并在大肠杆菌M15中成功表达。表达的重组蛋白大部分存在于包涵体中,经洗涤,变性和复性,镍柱亲和层析纯化,获得了电泳纯的Aly32和Aly165。酶活性检测发现,仅Aly165具有较强活性,108 u/mg,该酶对poly(G)和poly(M)都有活性,对poly(M)更敏感。对表达体系进行优化,确定IPTG的最佳浓度为0.6mmol/L,最佳诱导菌液密度OD600为0.5~0.6,最佳表达时间为3h,28℃低温诱导可以提高重组蛋白的可溶性,可溶性蛋白相对表达量达到25%。     

重组耐热融合型左聚糖蔗糖酶的表达优化

为提高重组耐热融合型左聚糖蔗糖酶(TPS-SacB-T305A)在大肠杆菌中的表达量,在单因素条件优化的基础上,将重组耐热融合型左聚糖蔗糖融合酶的水解活力(OD_540nm)作为响应值R进行Box-Behnken实验。所得优化条件为：接种量3.0%(v/v),诱导时间为20 h,IPTG浓度为0.9 mmol/L,诱导温度为23℃,此时响应值R=1.33。利用此优化条件在摇瓶中发酵产重组耐热融合型左聚糖蔗糖酶,经破细胞提取粗酶液,其水解活力的均值达123 U/mL,比单因素优化结果提高了28.65%。本研究为该新型重组酶的后续应用性质和耐热机理的深入研究提供了实验材料和研究基础。     

花生过敏原Ara h2.02原核表达方法条件的研究

将重组质粒pET-32a(+)-Arah2.02转化表达宿主菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS—PAGE电泳分析,结果显示表达的蛋白大小约为38kDa。进一步用通用His标签抗体进行Western Blotting检测,结果表明成功克隆表达了花生过敏原Arah2.02。为获得较多的重组蛋白Arah2.02,分别对IPTG浓度、摇床转速、诱导温度和时间等条件进行选择,确定最佳条件为:IPTG浓度0.3mmol/L,摇床转速220r/min,诱导温度37℃,诱导时间2h。     

耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化

通过摇瓶实验对产耐高温α-淀粉酶的重组菌E.coli BL21的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α-淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖0.5g/L,酵母粉15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵4h,诱导时间为6h,IPTG添加量为0.8mmol/L,接种量为体积分数3%的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的1.29倍,酶活力达到8.754U/mL,是原来的1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的1.24倍。     

乳糖诱导葡萄球菌肠毒素A基因在大肠杆菌中的表达

以乳糖作为诱导剂代替传统方法中的IPTG,分别从菌龄、诱导剂浓度、诱导时间及诱导剂的添加方式等方面,对乳糖诱导金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxins A,SEA)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达进行了研究。结果表明,重组大肠杆菌表达SEA的优化条件为:在对数生长期(OD600约为0.6),一次性添加终浓度为0.5 mmol/L的乳糖诱导6 h。目标蛋白的表达量占菌体总蛋白质的36.9%,略低于以IPTG为诱导剂时38.1%的表达量。乳糖价格仅为IPTG的1%左右,因此,在SEA的大规模制备中,使用乳糖作为诱导剂可以大大节约成本。