利用PCR结合膜芯片技术检测结核分支杆菌的实验研究.

目的:探讨聚合酶链反应(PCR)结合膜芯片技术用于检测结核分支杆菌的方法.方法:标记生物素的特异性引物,扩增17株菌标本IS6110插入序列的245 bp目的基因,结合膜芯片杂交检测结核分支杆菌基因.结果:15株结核分支杆菌标本中有12株扩增出245 bp目的基因,2株大肠杆菌及阴性对照标本PCR扩增结果为阴性.经膜芯片杂交,12株结核分支杆菌标本中有11株显色结果为阳性,其余显色结果为阴性.PCR结合膜芯片检测结核分支杆菌的灵敏度为73.3%,特异度为100%.结论:PCR结合膜芯片技术是一种具有发展潜力的检测结核分支杆菌的方法.     

结核分支杆菌扩增体系的建立、优化及评价

目的 建立并优化结核分支杆菌PCR反应扩增体系,并对所建立的体系进行评价。方法根据GenBank找到结核分支杆菌基因序列,在Primer Premier V5．0软件上设计结核分支杆菌特异性引物。并对反应体系中MgCl2、引物、dNTP浓度以及引物退火温度优化后建立结核分支杆菌PCR反应扩增体系。通过对,IB标准株、TB临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序、灵敏性试验以及特异性试验对PCR反应体系进行综合评估。结果TBPCR反应体系阳性扩增结果为在琼脂糖凝胶电泳上出现245bp的条带。Mga2、引物以及dNTP在TBPCR体系中优化后最佳终浓度分别为：4mmnol／L、0．04μmol／L以及0．3mmol／L。TBPCR体系的退火温度优化后为55℃。,IB标准株及11B临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序结果与GenBank中公布的序列完全一致。TBPCR反应体系对其它细菌无交叉反应。检测限度为10拷贝／止的DNA。结论TB PCR反应体系能够快速对TB标准株、TB临床分离株及临床标本进行结核分支杆菌的鉴别。     

用PCR-RFLP技术检测皮肤感染性肉芽肿组织中的分支杆菌

目的:探讨用聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法快速检测皮肤感染性肉芽肿组织中的分支杆菌.方法:皮肤感染性肉芽肿患者的组织标本5份,提取组织DNA进行巢式PCR扩增,对PCR产物分别用Hha Ⅰ、Mbo Ⅰ、BstU Ⅰ3种限制性内切酶进行酶切,聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行RFLP分析,并与培养结果进行比较.结果:从2份临床诊断为游泳池肉芽肿的组织标本中检测出海分支杆菌,从1份诊断为皮肤感染性肉芽肿的标本中检测出结核分支杆菌,此3例结果与培养鉴定结果完全一致.另两份标本分别检测出结核分支杆菌和偶发分支杆菌.结论:用PCR-RFLP方法可以快速鉴定皮肤感染性肉芽肿中的分支杆菌,可协助临床进行疾病的早期诊断和及时治疗.     

用PCR-SSCP技术检测结核分支杆菌rpoB, KatG, rpsL基因突变

目的：用PCR－SSCP技术检测肺结核患者痰及分离株结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，了解耐药分子机制及探索痰标本结核分支杆菌耐RFP，INH，SM直接检测的可行性，方法：对32例耐INH，RFP，SM肺结核患者临床痰标本及30株耐INH，RFP，SM结核分支杆菌临床分离株行PCR－SSCP方法检测rpoB,KatC,rpsL基因突变，结果：32份耐多药临床痰标本中rpoB,KatG,rpsL基因扩增产物SSCP其电泳条带与结核分支杆菌标准株H37Rv电泳条带相比，基因突变阳性分别为28／32，19／32，23／32，30例结核分支杆菌临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变阳性为28／30，18／30，22／30，结论：PCR－SSCP方法敏感，特异，可快速检测结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，适合于临床肺结构患者痰标本耐药性的快速检测。     

痰液标本不同检测方法对结核杆菌检测比较

目的比较不同检测方法检测痰液标本结核分支杆菌的检测效果,为检测方法的选择提供参考。方法60份拟诊为肺结核患者的痰液标本分别用涂片抗酸染色法、结核分支杆菌培养法和荧光定量法（RT—PCR）检测,分析三种检测方法的检出率、检测时间及检测成本。结果RT—PCR检出率为95．0％,菌培养法检出率为70．0％,染色法检出率为55．0％。RT-PCR检出率高于菌培养法及染色法;菌培养法检出率高于染色法,染色法检出时间低于菌培养法及RT-PCR法,且检测成本低于菌培养法及RT—PCR法;RT—PCR法检出时间低于菌培养法,但检出成本高于菌培养法。结论不同的检测方法痰液结核分支杆菌的检测效果存在差异,应依据临床用途选择应用。     

结核病临床标本中结核分支杆菌利福平耐药基因型的快速测定

目的：建立快速测定结核临床标本中结核分支杆菌RFP耐药性的方法，探讨其应用价值。方法：应用PCR－SSCP银染色法和EB染色法对58株结核分支杆菌临床分离株和17例临床标本的rpoB基因进行分析。结果：PCR－SSCP分析结核分支杆菌rpoB基因的敏感性为1～10PgDNA；通过SSCP图谱分析可特异检测结核分支杆菌的rpoB基因突变。32株RFP耐药株中30株（93．8％）发生rpoB基因突变，呈现四种类型的异常SSCP图谱；26株RFP敏感株中1株（3，8％）有rpoB突变。2例涂片阳性培养阳性结核性疾标本有rpoB基因突变，与常规药敏试验相符；5例涂片阳性培养阴性和10例涂阴培阴的结核性标本均未发现rpoB基因突变。结论：大部分结核分支杆菌RFP耐药性产生是由于其rpoB基因突变所致，采用PCR－SSCP方法可快速测定结核病临床标本中结核分支杆菌RFP耐药基因型。     

利用噬菌体裂解法快速检测结核分支杆菌

目的　研究噬菌体裂解法在结核分支杆菌快速检测及鉴定中的价值。方法　应用噬菌体裂解法和涂片法、L -J培养法检测 2 70份临床确认的肺结核患者的痰标本以及 3株结核分支杆菌标准株、1 4株非结核分支杆菌和 7株非分支杆菌。结果　 3株结核分支杆菌标准株噬菌体裂解试验均为阳性 ,而 1 4株非结核分支杆菌和 7株非分支杆菌均为阴性。 81份L -J培养阳性和 1 89份L -J培养阴性的痰标本中 ,噬菌体裂解试验分别有 77份(95 1 % )、1 7份 (9 0 % )阳性 (P >0 0 5 )。涂片检查阳性仅 70份 (2 5 9% ) ,阴性 2 0 0份 (74 1 % ) ,而应用噬菌体裂解实验可以检测出 94份 (34 8% )阳性 ,其中有 2 5份为涂片阴性的标本 (P <0 0 5 )。结论　噬菌体裂解法可以简便、快速地检测结核分支杆菌 ,全程只需 2d ,并且具有较高的敏感性和特异性     

牛鼻腔分泌物非结核分支杆菌分离培养结果分析

目的调查非结核分支杆菌在牛中的感染情况。方法对174头牛鼻腔分泌物，按中国防痨协会1995年11月颁布的“结核诊断细菌学检验规程”进行非结核分支杆菌分离培养和鉴定。结果从174份标本中分离出分支杆菌88株，阳性率为50.5％，其中草分支杆菌占22．7％、偶然分支杆占21.5％、戈登分枝杆菌占17．3％、不产色分支杆菌占14．8％、土分支杆菌占10．2％、龟脓肿分支杆菌占9．1％和鸟胸分支杆菌占2.2％。结论非结核分支杆菌在牛中存在的现象应引起重视，其毒力对人类的影响应进一步研究，以便采取有效的措施，保护人群的健康。     

长春地区非结核分枝杆菌试验结果分析

目的:证明检测非分枝杆菌对临床诊断及选用抗结核药物起关键作用。方法:应用BG/ALERT3D检测法、改良罗氏(L-J)培养法及分枝杆菌的鉴定程序。结果:从516份临床患者标本中检测出213株结核分支杆菌,其中结核分支杆菌(188/213)、牛型分支杆菌(14/213)、非结核分支杆菌(11/213),结核分支杆菌的培养阳性率为37.8%。结论:按MTC鉴定程序对213株结核分支杆菌进行了鉴定,11株为非结核分支杆菌,其中海分支杆菌3株、堪萨斯分支杆菌3株、胞内氏分支杆菌2株、偶然分支杆菌2株、鸟分支杆菌1株,长春地区非分支杆菌约占5.2%左右。     

PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测

目的 探讨采用直接检测结核病人痰标本中rpoB基因和KatG基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药性。方法 用PCR-SSCP技术分析对35例耐INH(或含耐异烟肼)，63例耐RFP(或含耐RFP)的肺结核病人痰标本和20例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。结果 以结核分支杆菌H37RV为对照，63例耐RFP痰标本中57例PCR扩增阳性，其中46例SSCP图谱与H37RV标准株有差异，rpoB突变率为65．2％。35例耐INH肺结核病人痰标本有20例扩增阳性，15例SSCP图谱与H37RV标准株有差异，突变率为42．8％。20例非结核病人痰标本rpoB基因和KatG基因扩增均为阴性。结论 PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。     

噬菌体裂解法与BACTEC-460法检测结核分支杆菌的应用比较

目的 :比较研究噬菌体裂解法与BACTEC - 46 0法在结核分支杆菌快速检测及鉴定中的价值。方法 :应用噬菌体裂解法和BACTEC - 46 0法检测 3株结核分支杆菌标准株、13株非结核分支杆菌和 7株非分支杆菌以及 2 70份临床确认的肺结核患者的痰标本。结果 :噬菌体裂解试验 3株结核分支杆菌标准株均为阳性 ,而 13株非结核分支杆菌和 7株非分支杆菌均为阴性 ;BACTEC - 46 0法 3株结核分支杆菌和 13株非结核分支杆菌均可生长 ;2 70份肺结核患者的痰标本应用噬菌体裂解法和BACTEC - 46 0法进行检测两者的阳性率相近 ,分别为 4 4.4 % (12 0 / 2 70 )和 4 6 .7% (12 6 / 2 70 ) ,二者差异无显著性 (p >0 .0 5 )。噬菌体裂解法检测的报告时间为 2d ;BACTEC - 46 0培养的阳性报告时间 2～2 7d、平均为 8.7d ,阴性报告时间为 4 2d。结论 :噬菌体裂解法与BACTEC - 46 0法相比 ,可以简便、快速地检测结核分支杆菌 ,全程只需 2d ,并且具有较高的敏感性和特异性 ,是一种崭新的结核分支杆菌快速检测方法。     

几种方法检测结核分支杆菌的比较

目的：评价聚合酶链反应（PCR）,细菌培养,抗酸染色,荧光染色对结核病的诊断价值。方法：PCR检测43例临床标本中结核分支杆菌（MTB）DNA,并与常规细菌学检测作对比。结果：PCR检测法敏感性为48.8%,荧光染色法为44.2%。细菌培养为32.6%,抗酸染色法为25.6%。结果表明,PCR法检测结核分支杆菌较抗酸染色法更敏感。结论：PCR法具有简便快速的特点。对结核病有较高的诊断价值。     

聚合酶链反应—微孔板杂交法检测结核分支杆菌的临床应用及其评价

目的：对聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核分支杆菌的临床适用性和可行性进行评价。方法：收集1130份临床标本，用抗酸染色、培养、PCR电泳、PCR微孔板杂交法分别进行结核杆菌的检测。并结合临床诊断和疗效观察对实验结果进行分析。结果：100份临床证实杂交法未查出阳性，1030份高度怀疑含有结核杆菌的体液标本的检测结果。以PCR微孔板杂交阳性检出例数最高（481/1030），其次为PCR电泳（406/1030）、培养（365/1030）以及抗酸染色（256/1030）；X^2检测结果显示PCR微孔板杂交的结核杆菌阳性检出例数与其它三种方法比较的呈显著或极显著差异。结论 PCR-微孔板杂交方法是一种特异、灵敏、准确、快速的结核杆菌检测方法。具有广泛推广应用的价值。     

痰培养阴性结核患者利福平耐药基因的直接分子检测

目的：探讨分子药敏检测对临床痰培养阴性患者治疗中结核用药的指导。方法：以结核分支杆菌rpoB基因保守区序列作引物行巢式PCR结合直接测序检测培养阴性结核者痰标本rpoB基因。结果：107例痰nPCR结果24例呈阳性，该24例nPCR阳性产物经全自动测序，其中8例存在有义突变，提示利福平耐药，余16例未见突变。结论：巢式PCR结合直接测序可快速检测痰培养阴性标本rpoB基因突变，对临床用药有指导价值。     

结核分支杆菌异烟肼耐药基因的杂交检测

目的：探讨耐异烟肼结核分支杆菌的编码基因KatG和inhA基因的扩增以及突变情况。方法：采用PCR扩增技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因扩增；利用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因突变检测。结果：25株敏感株、35株耐药株KatG和inhA基因扩增均阳性；25例临床结核病人痰标本中KatG基因扩增阳性率为80％，inhA基因扩增阳性率为68％。结论：耐异烟肼菌株的基因突变率明显高于药物敏感株；PCR一寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏的特性能够为临床检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性提供初步依据。     

聚合酶链反应试剂对检测痰结核分支杆菌的影响

杭州市第二人民医院陈刚等为观察聚合酶链反应(PCR)的试剂对检测痰结核分支杆菌的敏感性和特异性的影响,对205例结核病和105例非结核病患者的痰标本同时进行三个厂家生产的PCR试剂检测、普通细菌培养和抗酸染色法涂片检测,再对PCR假阳性的痰普通细菌培养结果进行分析,试找出PCR假阳性的其它因素。 结果发现,三种不同引物序列和扩增产物片段长度的PCR试剂对结核性痰标本的阳性率分别为     

结核分支杆菌耐药分子机制的检测技术的研究

目的：探讨结核分支杆菌对异烟肼、利福平耐药的分子机制，建立快速检测耐药分支杆菌基因型的分子生物学方法。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR—SSCP)同时检测结核分支杆菌敏感株和耐异烟肼、利福平耐药株的KayG基因、rpoB基因突变。结果：78株结核分支杆菌临床分离株均未发现KatG、rpoB基因缺失。以结核分支杆菌H37RV为对照，36株药物敏感株的KarG、rpoB基因SSCP图谱均正常。42株同时耐异烟肼和利福平的多耐药株中，KatG和rpoB基因突变率分别为66．7％(28／42)，90．5％(38／42)。结论：结核分支杆菌耐异烟肼、利福平耐药性的产生是由于KatG基因和rpoB基因突变所致。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性。     

生物芯片法在结核分支杆菌检测中的应用价值探讨

目的 探讨生物芯片法在结核分支杆菌诊断中的价值.方法 对生物芯片法的特异度、重复性和灵敏度进行方法学评价,并用生物芯片法检测79例临床怀疑结核的患者标本和56例非结核患者标本,将其结果同传统抗酸染色法进行比较.结果 在方法学实验中,生物芯片法重复性好,特异性高,灵敏度高.临床试验中,79例怀疑结核标本,生物芯片法检出率为49.4%(39/79)高于抗酸染色法19.0%(15/79),差异有统计学意义(χ2=13.87,P<0.05); 而56例非结核患者检测结果均为阴性.结论 生物芯片法是一种快速、灵敏度好、特异性高、重复性好的结核分支杆菌辅助诊断方法.同时生物芯片法能区分结核分支杆菌和非结核分支杆菌,在流行病学、临床诊断和治疗上有着重要意义.     

利用PCR反应检测肾结核病人尿标本结核菌的探讨

目的探讨聚合酶链反应(PCR)检测肾结核病人尿标本结核菌的特异性。方法采用PCR方法检测。结果10例肾结核病人尿标本PCR阳性率为80%,10例非结核泌尿系统感染病人尿标本PCR检查结果均为阴性。结论PCR敏感性强,与临床符合率高,是一种较为理想的检验方法。     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法，探讨荧光PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针，并构建标准品。对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本，应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。结果荧光定量PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100％、30％。结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法，具有重要的应用价值。