多重连接探针扩增对5种牛病毒同步检测方法的建立

现有的动物疫病诊断技术多是针对单一病原检测,而动物疫病的流行通常是多种病原混合感染,目前的诊断技术不能很好地满足国境口岸快速、高通量检疫的需求,一直以来多重检测技术的研究是动物疫情监测、疫病控制领域关注的焦点。本试验在前期猪病混合感染诊断研究基础上,进一步利用多重连接探针扩增(MLPA)技术,以蓝舌病病毒(BTV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛地方流行性白血病病毒(EBLV)和口蹄疫病毒(FMDV)为研究对象,分别设计这5种牛病毒的MLPA探针,将这5种探针混合,建立可以同时检测这5种病毒的MLPA扩增方法。特异性试验表明:每种病毒的探针都是特异的,只能识别各自的目的片段,不能扩增出其他相关病毒,探针之间也不存在交叉反应;敏感性试验结果表明:5重MLPA扩增的最低检测限可以达到单个病毒核酸的2 000个拷贝。经过对136份临床样品的检测,该方法与现有荧光PCR方法的符合率达到100%,能够正确地检测出每份阴、阳性样品及混合感染样品。本研究建立的5种病毒MLPA检测方法可以实现1次采样,1次分析,同时检测5种牛病毒的目的,该技术特异性强、敏感性高,加之其多重性检测的优势,有望成为未来疫病检测的新方向。     

数字PCR技术及对动物疫病检测应用

数字PCR是近年发展起来的一种核酸绝对定量的检测技术,与传统的PCR和荧光PCR技术相比,数字PCR具有较好灵敏度、准确度和重复性,可实现绝对定量分析,为动物疫病的早期诊断和病原的定量检测提供了一个新平台。本文介绍了数字PCR的技术原理,并对该技术在动物疫病检测领域的中应用进行综述。随着数字PCR技术的发展,相关动物疫病配套检测试剂的研发,数字PCR技术将在动物疫病中得到广泛应用。     

数字PCR技术在动物疫病诊断中的应用进展

数字PCR技术是一种能够进行绝对定量的核酸检测技术,与实时荧光定量PCR技术相比,该技术敏感性更高、定量不依赖于标准曲线、对反应抑制物的耐受能力也更高。目前,该技术在转基因检测、物种鉴定、疾病诊断、病原微生物鉴定和精确定量分析等领域具有较广阔的应用前景。论文对数字PCR的发展历史、原理、优缺点及在动物疫病诊断中的应用进行了综述,以期为提高动物疫病诊断能力的提供借鉴。     

聚合酶螺旋反应（PSR）在病原微生物快速检测中的研究进展

聚合酶螺旋反应（polymerase spiral reaction,PSR）是基于环介导等温扩增技术（LAMP）和聚合酶链式反应（PCR）建立的一种新型恒温体外核酸扩增技术,其利用混合引物的设计思路和BstDNA聚合酶的链置换活性,实现了在体外等温条件下的核酸扩增,表现出灵敏性及特异性较PCR显著提高,引物设计较LAMP简单等优点,在保证检测灵敏、特异的同时,耗时相对较短,且操作简便,对仪器设备要求低,可肉眼直观判定结果,特别适用于公共卫生、动物健康、食品安全和生物防御等领域的快速诊断。本文介绍了PSR技术的原理及其在病原微生物检测方面的应用,以期为相关领域的检测技术研究提供参考。     

分子前沿技术在传染病诊断中的应用

分子检测方面的最新研究显示,直接检测临床样本中的微生物核酸能够为诊断提供快速、敏感和多重检测方法。其中,最引人注目的是MassTag PCR、GreeneChip、非偏离高通量焦磷酸测序(UHTS)技术,在一些病原分离和培养条件比较苛刻病例中获得成功应用。当怀疑某个特定病原时,可以运用MassTag PCR进行样品筛选。GreeneChip通常是用于初筛失败或检测的病原超出MassTagPCR检测范围。当怀疑有新病原而GreeneChip并不能检测出候选病原时,就需要采用UHTS技术。本文综述了这些分子前沿技术在传染病诊断中的应用。     

高通量测序技术检测鸽群中病毒感染状况

为了解我国鸽子病毒感染状况,采用高通量测序方法,对华东地区肉鸽携带的病原进行了检测,共检测到5种主要感染病原,包括禽轮状病毒、鸽圆环病毒、鸽星状病毒、鸽冠状病毒和鸽微RNA病毒B。除鸽圆环病毒外,其余4种病毒均在我国鸽群中首次被发现。该检测结果对我国的鸽群疫病监测和防控具有重要意义,同时证实高通量技术能够检测出动物群体中的主要感染病原,是动物疫病检测的新思路,有利于全面掌握动物病原感染状况,及时预警、处置和防控动物疫病的发生。     

当前和未来禽类肠道病毒和其他病毒的检测方法

核酸技术作为监测和鉴定病原的第一步正在被广泛使用,新一代PCR技术RT-PCR是一种在试验进行中可以看得见的反应.在PCR作为主流诊断技术的同时,建立在核酸基础上的新一代诊断技术正在形成,如检测遗传物质的环介导扩增技术(LAMP)和基因芯片技术.……     

多重连接探针扩增技术及其在疾病诊断中的应用

多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是将核酸杂交和PCR链式扩增相结合的一项高通量检测技术。自2002年首次报道以来,该技术的研究和应用取得了很大进展,目前已广泛用于遗传性疾病的基因检测、肿瘤预后及病原生物高通量检测领域。介绍了多重连接探针扩增技术的原理,探讨了该技术在疾病诊断中的应用,以期为多重连接探针扩增技术的科学合理应用提供参考。     

非洲猪瘟诊断技术研究进展

非洲猪瘟防控目前暂无安全有效疫苗可用,因此快速、可靠的检测方法对其防控至关重要。目前应用的非洲猪瘟诊断技术主要表现在病原、核酸、抗原与抗体四个方面:病原检测主要有红细胞吸附和病毒分离方法,核酸检测目前已开发出实时荧光定量PCR(qPCR)、多重PCR(mPCR)、微滴数字PCR(ddPCR)、巢氏PCR(nested-PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、交叉引物扩增技术(CPA)、原位杂交技术(ISH)以及生物传感器技术等,抗原检测常用荧光抗体试验(FAT)、抗原ELISA、侧向流动免疫色谱分析(LFA)等,而抗体检测主要通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光抗体试验(IFA)、胶体金快速免疫层析法(GICA)、免疫印迹法(IBT)等方法。每种诊断技术都有其特点,从而为不同情况下的A SFV诊断提供了多种选择。未来,其他技术如CRISPR等与上述技术的结合应用,以及不同诊断技术的联合应用,将成为非洲猪瘟诊断技术发展的趋势。     

环介导等温扩增技术及其在动物疫病诊断中的应用

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplifi cation,LAMP）技术是一门新兴的分子生物学检测技术,因其具有特异性强、敏感性高、简单、快捷及不需要昂贵的仪器设备等特点,受到了生物医学研究者的高度关注。目前,该方法已经被广泛应用于各种病原微生物检测。本文综述了近年来LAMP在动物疫病检测中的具体应用实例和目前的研究进展,并对LAMP方法在动物疫病诊断中的应用前景做了展望。     

分子生物学诊断技术的应用(一)

随着分子生物学技术的飞速发展,尤其是分子遗传学的进步,大大提高了动物病原的诊断水平。动物病原的实验室诊断技术已从常规的病原分离鉴定以及抗原和抗体的免疫学检测,进入到可对病原基因序列和结构直接进行测定的分子生物学水平,同时也促进了疫病快速诊断技术发展。近几年随着国家对市县级动物疫病防控设备投资逐年加大,疫病防控诊断平台建设不断加强,兽医技术人员希望普及动物分子生物学诊断技术。本刊特邀湖北省农业科学院畜牧兽医研究所杨峻研究员对分子生物学诊断技术在兽医学科领域的应用进行概述,为大家在实际应用时提供参考。主要内容包括核酸探针技术、单克隆抗体技术、核酸扩增、核酸电泳、免疫印迹技术、图谱分析、核酸序列分析、DNA芯片技术等。     

生物芯片技术在动物疫病及畜产品安全检测中的应用概述

生物芯片是一种以膜、玻璃、硅等固相介质为载体,能快速并行处理多个生物样品,并对其所包含的各种生物信息进行解析的微型器件,它具有快速、高效、并行处理及分析自动化能力,它最大的优点在于高通量、并行化、微型化。在生物芯片上,单位面积内可以高密度地排列大量的生物探针,已经实现产业化的生物芯片每平方厘米可排列5～10万个探针。借助生物芯片技术,一次实验就可同时检测多种疾病或分析多种生物样品。生物芯片技术目前不仅广泛用于各研究领域,而且一些成熟的产品已经进入公共卫生领域,为畜产品安全检测、动物疫病预防等方面提供了全新检测手段。     

鉴别牛5种重要病毒的LAMP-基因芯片方法的建立

为建立牛的主要疫病的快速、准确及高通量鉴别诊断技术,以赤羽病病毒(AKV)、牛白血病病毒(BLV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)5种牛传染病病原为研究对象,将LAMP技术与微流控芯片技术有机结合,建立了相应的基因芯片检测技术,并优化了该基因芯片的反应条件。结果表明,建立的基因芯片可同时检测上述5种病原,特异性好,60 min反应时间即可给出检测结果。其中AKV和PPRV的敏感性为10~3 copies/μL,BLV的敏感性为10~5 copies/μL,BTV和BVDV的敏感性为10~2 copies/μL,与LAMP检测的敏感性一致。成功建立了基于LAMP技术的5重RT-LAMP基因芯片,可同时快速准确检测上述5种病毒,为口岸检疫探索出一种能快速、高通量检测动物疫病的方法。     

LAMP技术在家禽病毒检测中的应用

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种简便快速的DNA扩增技术,具有特异性强、敏感性高、反应迅速、设备简单、判定简易等特点,非常适合在基层和临床上应用。自LAMP出现后,在多个领域得到了大量的研究和应用,尤其在家禽病毒的检测方面发展迅速,检测动物包括鸡、鸭、鹅、鸽等多种家禽,检测对象包含引起呼吸道感染、肿瘤、免疫抑制等方面的多种病毒,检测的敏感性和特异性比PCR还要高,在家禽病毒性感染的诊断和防控中发挥了重要的作用。当前影响其广泛应用的主要问题是扩增模板,如果能解决病原核酸在生产现场的简便提取,定能在将来得到更广泛的普及应用。     

2014世界肉鸡疫病控制研究和技术发展报告

2014年,危害全球肉鸡业的主要传染病有禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎、禽白血病等病毒性疫病,我国鸡群H5亚型禽流感、新城疫等烈性疾病偶有发生,传染性支气管炎、H9N2亚型禽流感较常见,白血病感染仍然很严重。2014年我国研制出针对7.2分支H5亚型禽流感病毒的Re-7株灭活疫苗并广泛应用;此外,家禽的细菌性疾病依然是一个世界难题,以大肠杆菌、出血性败血症巴氏杆菌、沙门菌、空肠弯曲杆菌等引起的细菌性疫病为主。家禽疫病诊断及检测技术的主要发展趋势是以高通量、快速、高特异性为主要方向,检测方法仍然以RT-PCR技术、单克隆抗体、ELISA、核酸探针技术为主。2014年度我国科研人员已研制多种病毒性及细菌性疫病快速和高通量监测试剂盒,包括检测禽白血病抗原和抗体的ELISA、LAMP、胶体金试纸条等监测试剂盒。目前我国已初步形成禽类疫病监测和诊断体系以及禽免疫抑制病如禽白血病等的净化体系和综合防控措施。     

液相芯片技术在动物疫病检测中的研究进展

液相芯片技术是整合了激光技术、流式细胞仪、数字信号处理和传统化学技术的一种新型生物分子检测技术,目前广泛应用于各种免疫分析和核酸检测中。液相芯片技术支持单重和多重分析,可在多种测定方法中对蛋白质和核酸靶标进行高通量检测,具有高通量、操作简单、适用范围广、重复性好、特异性高、所需样品量少、更灵敏稳定、成本低等优点,正逐渐代替传统检测和定量病原体的工具,如实时荧光定量PCR扩增检测系统（qPCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等检测方法。动物传染病严重危害着养殖业健康发展,一些诸如高致病性禽流感的人畜共患病对人类健康造成了严重威胁。高效灵敏的诊断系统将有助于在传染病暴发期间筛选大量样本,防止感染扩散。液相芯片技术的发展为高通量检测和疾病的预防提供了新的平台。作者简要概述了液相芯片技术的原理和优点,重点阐述了液相芯片技术在检测动物疫病,包括猪病、禽病、兔病、犬病、啮齿类动物和其他动物疫病方面的研究进展。相信今后液相芯片技术会成为临床诊断、基础研究、新药开发、司法鉴定、食品卫生监督、生物武器防范等领域的一项重要分析检测技术,该技术的发展将大大推动生命科学研究与进步。     

LAMP技术在家禽腹泻性疾病检测中的应用

正快速检测致病微生物是控制疾病暴发的有效方法之一。目前,测病原体的传统方法耗时且劳动强度大,并且通常很容易失去最佳控制疾病的机会。因此,迫切需要一种快速检测疾病的方法。环介导等温扩增(LAMP)是近年来新建立的核酸恒温快速扩增技术。它具有高灵敏度,特异性,视觉检测和对仪器的低需求。它具有节省时间和精力等诸多优点,在分子诊断领域具有很大的潜力。目前,LAMP已被广泛用于检测各种动物病原微生物。本文主要综述了LAMP技术在家禽腹泻病原微生物检     

病毒性动物疫病诊断技术研究进展

动物疫病的大暴发不仅严重影响畜牧业的生产与发展，造成巨大经济损失，而且会严重危害人类健康。病毒性疫病的增加使得动物疫病更加复杂，流行趋势更加严峻。灵敏、特异、快速地诊断动物疫病是实施疫病防控措施的关键环节。基于PCR技术及等温扩增技术的分子生物学诊断解决了传统病原学诊断费时费力、免疫血清学存在的窗口期等问题并摆脱了对高精度温控设备的依赖，成为目前常用的病原体筛查方法。但大多数检测方法一次只能检测到一个或几个病原体，且复杂的试验流程及对设施的高要求降低了立即干预突发疫情的能力，同时无法满足某些检测分析需求。近年来，学科间相互渗透融合的高通量诊断技术发展迅速，具有同时监测、检测和表征成百上千个靶点的能力，能满足在多种环境下的病原体快速检测的需求，是生命科学发展过程中一种重要的生物学检测手段。笔者从病原学、免疫血清学、分子生物学及高通量诊断等方面对主要的病毒性动物疫病检测技术进行了综述，展望未来动物疫病诊断检测技术的发展，以期为动物疫病快速诊断提供更多的方案思路，提升动物疫病的防控能力。     

转基因动物及其产品检测技术研究进展

为探索可靠、灵敏的转基因动物及其产品检测技术,从核酸检测和蛋白检测两个方面,综述了转基因动物及其产品不同检测技术的原理、特点及应用,提出了每种检测技术的不足及今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。目前,已经研发的核酸检测技术主要包括多种PCR方法、环介导等温扩增技术、Southern blot技术和染色体原位杂交技术等,蛋白检测方法主要包括酶联免疫吸附检测技术、免疫层析试纸条、Western blot技术、免疫组织化学和免疫荧光技术等。三代测序技术是近年来提出的一种新型基因检测技术,适用于对未知序列转基因动物的分析。随着转基因技术的发展,转基因动物及其产品越来越多,高通量、高灵敏度和低成本的检测技术将成为未来转基因动物及其产品检测的研究重点。     

在动物疫病诊断中多重PCR技术的应用

随着科学技术的发展,近年来越来越多的产业开始朝着分子化水平推进。在动物疫病的防控过程中,如果将动物的疫病能够及早地诊断出来,并及时消灭在萌芽阶段,那么对一些危害较大的疫病就可以得到有效的控制。引用多重PCR技术可以在分子层面上同时鉴别诊断多种动物疫病,对动物疫病中细菌类、病毒类疫病,可快速、准确地做出诊断。太原市动物疫病预防控制中心在动物疫病诊断中,对多重PCR技术的应用进行了探讨。