pCD—rbFGF重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

为了构建碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor ,bFGF）真核表达质粒,并探讨应用bFGF基因治疗骨科各种疾患的可能性,将鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建了重组质粒pCD-rbFGF,通过Lilfectin介导将pCD-rbFGF转染成骨细胞,经免疫组化检测症帝兔成骨细胞获得了bFGF的瞬时表达,提示该bFGF圩真核表达质粒有效,可用于进一步基因治疗研究。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体的构建

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子bFGF基因真核表达载体,探讨bFGF基因转移治疗视网膜病变的方法.方法:将bFGF和GFP基因克隆到真核表达载体pcDNA3中.结果:酶切及琼脂糖电泳分析 pcFG中含有bFGF和GFP基因.结论:成功的构建了含有绿色荧光蛋白的人碱性成纤维细胞生长因子基因的真核表达载体.     

pcDNA3-Bfgf真核表达载体的构建和鉴定

目的构建pcDNA3碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达质粒,为进一步开展bFGF基因治疗中枢神经疾病奠定基础.方法建立SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增脑细胞中bFGF基因;载体和RT-PCR产物经BamHI和EcoRI酶切,纯化,T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌,抗生素筛选重组质粒.结果 RT-PCR产物为649bp特异片段,pcDNA3咄FGF重组体菌落PCR产物为649 bp特异片段,测序分析为bFGF基因片段.结论经RT-PCR反应得到特异的bFGF基因片段,并成功构建了大鼠bFGF真核表达载体.     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

pcDNA3-bFGF真核表达载体的构建和鉴定

目的 构建pcDNA3碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达质粒，为进一步开展bFGF基因治疗中枢神经疾病奠定基础。方法 建立SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增脑细胞中bFGF基因；载体和RT-PCR产物经BamHl和EcoRI酶切，纯化，T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，抗生素筛选重组质粒。结果 RT-PCR产物为649bp特异片段，pcDNA3-bFGF重组体茵落PCR产物为649bp特异片段，测序分析为bFGF基因片段。结论 经RT-PCR．反应得到特异的bFGF基因片段，并成功构建了大鼠bFGF真核表达载体。     

碱性成纤维细胞生长因子真核荧光表达载体的构建

目的：构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的真核表达载体,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。方法：①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型,取缺血灶周围脑组织经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增bFGF基因;②将bFGFDNA克隆到pGEM-TEasy质粒,经菌落PCR和HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定;③然后将bFGF DNA亚克隆到pEGFP-N3质粒;通过抗性基因筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切和测序鉴定。结果：菌落PCR、酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank报道的bFGF基因序列一致。结论：经RT-PCR反应得到了特异的bFGF基因片段并成功构建了bF-GF荧光真核表达载体。     

碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体转染骨髓间充质干细胞的表达

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染骨髓间充质干细胞(MSCs)后的表达情况。方法：应用脂质体介导的基因转移技术将bFGF真核表达载体导入MSCs,用抗药性标志选择方法筛选出阳性克隆后,用免疫细胞化学检测bFGF表达分泌情况。结果与结论：经转染bFGF真核表达载体的MSCs细胞呈阳性,说明经转染的MSCs表达并分泌bFGF蛋白。MSCs有望成为bFGF基因治疗中枢神经系统疾病的理想载体。     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

bFGF对成骨细胞整合素β1亚单位表达和细胞黏附的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对成骨细胞整合素81亚单位表达的影响,探讨纤维黏连蛋白(FN)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单独或联合应用时对成骨细胞在生物衍生骨支架上黏附的影响.方法:培养成骨细胞,以bFGF(100 ng/ml)刺激,接种于FN(10μg/ml)修饰的生物衍生骨支架上,Western blot检测bFGF对FN受体整合素β1亚单位表达的影响,MTT检测组间细胞黏附效率差异,电镜观察细胞密度与形态.结果:Western blot检测发现应用bFGF刺激后,成骨细胞整合素β1亚单位表达增强;MTT检测发现单独应用FN与bFGF均可增加细胞在生物衍生骨上的黏附效率(P＜0.01),但二者联合应用时,产生的效应进一步增强,二者存在统计学上的交互作用(P＜0.01);电镜观察也证明,二者联合应用时细胞密度、铺展效果均优于单独应用.结论:bFGF可以显著增强成骨细胞FN受体整合素β1亚单位的表达,明显提高成骨细胞在FN修饰生物衍生骨支架上的黏附效率,bFGF与FN对于促进成骨细胞的黏附具有交互作用.     

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的荧光真核表达载体，以便进一步转染成骨细胞，研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况，观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光；免疫组化检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF，并在3T3细胞中表达了bFGF。     

Construction and Expression of Recombinant Plasmid pCD-rbFGF in Osteoblasts

Basicfibroblastgrowth factor(b FGF) exertsbi-ological effects on a wide range of mesoderm- andneuroectoderm- derived cells,acting as morphogensand mitogens.In addition,b FGF plays a crucial rolein wound- healing process.It stimulatesthe prolifera-tion ofalltypes ofcellsinvolved in the wound- healingprocess both in vitro and in vivo.In tissues such ascartilage and bone,b FGF has been reported to pro-mote chondrossification and play a role in the growthof osseous tissue[1] .To explore the po…     

Human vascular endothelial growth factor cDNA cloning and expression in osteoblasts

Vascularendothelialgrowth factor(VEGF) ,al-so known as vascular permeability factor,is one ofthe mostimportant angiogenic factor in vivo.Recentresearch have indicated that gene transfer of nakedDNA encoding for VEGF in vivo was a potentialtreatment for myocardial and hindlimb ischemia[1,2 ] .Formation of new capillaries,a critical component oftissue growth and repair,is a recognized process inthe development,formation and remodeling of bone.To make use of VEGF gene therapy on bone diseas…     

Construction of Eukaryotic Expression Plasmid of bFGF Gene in Rats and Its Expression in Tenocytes

The bFGF plays an important role in embryonic development of tendons and ligaments and in the healing of injuried tendons and ligaments. The eukaryotic expression plasmid of rat basic fibroblast growth factor (bFGF) gene was constructed in order to further investigate the bFGF func-tion in molecular regulatory mechanism in the repair of tendons and ligaments and to provide the foundation for the clinical application. The cDNA fragments of bFGF were cloned from the skin of rats by RT-PCR, and recombinated to the pMD18-T vector. The cDNA encoding bFGF was cloned from the pMD18-T vector by RT-PCR, digested with restriction enzyme EcoRⅠ, PstⅠ and bound to eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP to construct eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP-bFGF. The pIRES2-EGFP-bFGF was transfected into the tenocytes by lipid-mediated ransfection technique. MTT test was used to detect the biological activity of bFGF in supernatants after the transfection. The expression of type Ⅰ and Ⅲ collagen genes was detected by using RT-PCR. It was verified that the pIRES2-EGFP-bFGF was successfully constructed, and its transfec-tion into tenocytes could significantly enhance the biological activity of bFGF, and increase the ex-pression of type Ⅰ and Ⅲ collagen mRNA, suggesting that pIRES2-EGFP-mediated bFGF gene therapy was beneficial to the repair of tendons and ligaments.     

Experimental study on the antitumor effect of mouse B7-1 gene

ＴｗｏｓｉｇｎａｌｔｈｅｏｒｙｆｏｒＴｃｅｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔｕｍｏｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ［１－２］．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅｇｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｆｅｃｔ...     

重组鼠骨形态发生蛋白7真核表达载体的构建及在心肌细胞中的表达

目的:构建重组鼠骨形态发生蛋白7(BMP-7)的真核表达载体,并观察其在原代培养乳鼠心肌细胞中的表达情况。方法:将RT-PCR法获得的重组鼠BMP-7cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,在FuGENE6.0介导下转染差速贴壁法体外培养的乳鼠心肌细胞,72h后分别应用RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting检测mRNA和蛋白水平的表达情况。结果:经过PCR及酶切鉴定证明获得了真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-7;通过RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting证明pcDNA3.1-BMP-7能有效转染心肌细胞并表达BMP-7蛋白。结论:应用pcDNA3.1载体系统可有效转染重组鼠BMP-7,为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。     

Cloning and Expression of Rat Transforming Growth Factor β1 cDNA in Osteoblasts

In order to study transforming growth factor81 (TGF51) in molecular level and investigate thefeasibility of TGF51 gene therapy for bone defects,an eukaryotic expression vector containing ratTGF51 cDNA was constructed. The expression ofTGF51 in the transfected osteoblasts was observed.1 MATERIALS AND METHODS1. 1 Animals and Cell CultureSprague--Dawley rats, I adult and 5 newborn,were purchased from Animal Center of Tong nMedical University. Lymphocytes, isolated fromperipheral…     

广谱细胞生长因子的表达纯化与活性测定

目的 对人工合成的人广谱细胞生长因子基因进行体外表达与纯化，并测定其活性。方法 将人广谱细胞生长因子基因克隆于pGEX 4T-1表达载体，转化于大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达，利用亲和层析纯化表达产物，通过体外培养的大鼠成纤维细胞存活实验检验其活性。结果 携带重组质粒的菌株经诱导产生高水平的表达产物，纯化的表达产物具备较高的纯度，并基本保有其天然活性。结论 广谱细胞生长因子表达体系的成功建立，为该产品功能的进一步研究与临床应用创造了条件。     

重组人bFGF蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

【目的】构建人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因的原核表达载体,并对其进行诱导表达和蛋白质纯化,以获得大量重组人bFGF蛋白。【方法】人工合成bFGF基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pET22b中,转化感受态细胞大肠杆菌RPX,经IPTG诱导表达重组bFGF蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测分析。【结果】成功构建了人重组bFGF表达质粒pET22b-rhbFGF,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,分子量约在18×103Da处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的28%,纯化后的蛋白质灰度扫描检测,纯度为95%。【结论】成功构建了重组人bFGF原核表达载体,并成功纯化了该基因的原核表达产物,为下一步人bFGF的产业化打下了基础。     

人碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast cell growth factor,bFGF)腺病毒载体,并观察其在体外血管内皮细胞中的表达.方法:采用同源重组的方法,构建重组腺病毒Ad5-bFGF.携有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的Ad5腺病毒转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),检测最佳转染复数.Ad5-bFGF体外转染HUVEC,免疫细胞化学法、Western印迹法检测bFGF蛋白的表达.结果:Ad5转染HUVEC的最佳转染复数为200,转染率为90%.免疫细胞化学法和Western印迹结果显示bFGF基因以Ad5为载体可以在HUVEC的胞质和胞核表达,并且表达量较未转染的HUVEC明显增加.结论:成功构建了携带bFGF基因的腺病毒载体,体外可以成功表达,为bFGF基因治疗及肿瘤发病机制的研究奠定了基础.