苯妥英钠代谢酶CYP2C9、CYP2C19基因多态性的分析

目的研究药物代谢酶基因多态性对苯妥英钠代谢的影响,并建立分析苯妥英钠代谢酶中CYP2C9、CYP2C19基因多态性的方法。方法从人全血中抽取DNA,设计引物扩增CYP2C9及CYP2C19,并运用限制性片段长度多态性（RFLP）技术的方法进行CYP2C9及CYP2C19的基因分型。结果成功设计了引物用来扩增CYP2C9及CYP2C19的基因片段,并测序验证。结论建立了简单可靠的CYP2C9及CYP2C19的RFLP基因分型方法。     

等位特异PCR方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性

目的：应用等位特异PCR法检测IL-6启动子区-634位C／G变异，以探讨ASPCR应用的可行性．方法：应用ASPCR法和PCR-RFLP法同时检测101例研究对象IL-6启动子区-634位C／G变异的多态性．并对二者的结果进行比较研究．结果：（1）除一个CC基因型结果不一致外，其余的CG、GG和CC基因型两种方法的结果都一样；（2）ASPCR在单点突变多态性的检测中，具有省时、快速和成本低等优点．结论：APCR方法检测基因的已知突变，具有快速、准确、省时、价格低等优点，在满足引物模板间碱基错配能阻止引物延伸的条件下，可优先选用此法．     

CYP2C19基因多态性PCR熔解曲线法检测在冠心病患者中的临床应用

目的:探讨PCR熔解曲线法检测CYP2C19基因型及其初步临床应用。方法:选取240例2015年01月-2015年12月来我院心内科住院或门诊的长期服用氯吡格雷治疗的冠心病患者,通过CYP2C19基因检测系统对CYP2C19﹡1、CYP2C19﹡2和CYP2C19﹡3突变位点进行检测,并根据CYP2C19基因型进行药物代谢分组,探讨其临床应用价值。结果:240例患者中,CYP2C19﹡1、CYP2C19﹡2和CYP2C19﹡3等位基因频率,分别为60%,35%和5%,其中弱代谢患者(基因型为CYP2C19﹡2/﹡3)的检出率为4.2%;随机10例样本抽样测序验证符合率为100%。结论:PCR熔解曲线法检测CYP2C19基因具有快速、特异性强、准确率高等特点,适合于临床辅助诊断,是实现临床安全、合理用药的有效手段。     

序列特异性引物多聚酶链反应方法进行大样本多基因的多态性鉴定(英文)

目的建立多个基因同时进行多态性分析的序列特异性引物多聚酶链反应(PCR-SSP)方法,以满足其在临床检验中进行基因多态性鉴定时的应用。方法应用优化后的PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性:TNF-α-308A/G和-238G/A变异、IL-6-174G/C变异、CYP2D6*10B外显子第188位的C/T变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的基因多态性同时进行分析,基因型清晰,而且基因分型快速、准确。结论优化后的PCR-SSP适合对大样本、多个基因的单核苷酸位点变异进行多态性分析,值得在临床检验的应用中推广。     

精神分裂症患者CYP2C19、CYP2C9的基因多态性与氯氮平血药浓度的关联分析

目的:探讨CYP2C9和CYP2C19基因多态性与氯氮平代谢个体差异之间的相关性.方法:应用PCR与DNA测序相结合的方法检测精神分裂症患者CYP2C19、CYP2C9基因多态性.应用高效液相色谱测定氯氮平的血药浓度,以阳性和阴性症状量表(positive and negatve symptom scale,PANSS)评分减分率评价药物临床疗效.基因型和等位基因频率分布的两组间比较采用x2检验.组间血药浓度和疗效比较采用ANOVA检验.结果:91例氯氮平治疗的精神分裂症患者,氯氮平血药浓度与CYP2C9 *3、CYP2C19 *2、CYP2C19 *3基因多态性之间没有相关性(P0.05).结论:CYP2C9 *3、CYP2C19 *2和CYP2C19 *3基因多态性与氯氮平血药浓度之间不存在基因剂量关系.     

CYP1B1基因多态性与妊娠期肝内胆汁淤积症易感性的关系

目的研究CYP1B1基因外显子2密码子119(G-T)和外显子3密码子432(C-G)多态性与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)发病的关系。方法分别应用等位基因特异性PCR(AS-PCR)技术和人工修饰双等位基因特异性引物扩增(diASA-AMP)法,对100例ICP患者和100例正常对照孕妇CYP1B1基因外显子2密码子119(G-T)和外显子3密码子432(C-G)多态性进行分析。结果1CYP1B1基因密码子119多态分析表明ICP组T等位基因频率高于对照组(P<0.05),ICP组基因型GG、GT、TT频率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。与野生型(GG)相比,ICP组GT基因型和TT基因型增加ICP的发病风险(OR值分别为2.435和3.600);2CYP1B1基因密码子432多态分析表明两组均未检测到GG突变型,基因型CC、CG频率和等位基因C、G频率的比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论CYP1B1基因外显子2密码子119多态性可能与成都地区ICP易感性有关。     

用Cy5-ddNTP结合修饰引物延伸测定人类3种SNP

目的：建立一种简便快速的分析方法检测人类基因中的单核苷酸多态性（SNP）。方法：在适当的dNTPs和CyS荧光染色标记的ddNTPs存在的情况下，利用修饰引物从SNP位点进行特异性碱基延伸，延伸产物通过芯片电泳来检测。修饰引物的3’端第三个碱基处人为导入一个错配碱基来改善引物延伸反应的开关特性。结果：测定了人类p53、CK20、CK30基因上3种SNP的可能形态（野生型、突变型和杂合型），所有样本在芯片电泳中100s左右被准确检测。结论：该方法简便易行，可用于快速检测已知的SNP。     

3’末端碱基游移混合引物提高多变区基因片段PCR检测的阳性率(英文)

目的:通过使用3’末端碱基游移混合引物,减少引物末端错配,提高多变区基因片段的PCR检测阳性率。方法:在HBV DNA P基因区设计一对检测阳性率相对较高的引物(原型引物),在原型引物序列基础上将两根引物的3’末端分别截去1个或2个碱基,设计出两对参数与原型引物近似的突变引物。分别单独用原型引物和原型引物与突变引物组成的混合引物,在相同条件下对27份HBV DNA阳性标本行PCR,比较二者阳性率。用混合引物扩增4例拉米呋丁治疗无效患者血清HBV DNA,将扩增产物测序并评价3’末端错配对PCR的影响。结果:原型引物和混合引物检测阳性率分别为70.4％(19/27)和85.2％(23/27),两者差异非常显著(P<0.05)。引物3’末端错配能导致PCR假阴性。结论:扩增保守性相对较差的基因片段,采用3’末端单个或多个碱基截短的引物,构成3’末端碱基游移混合引物,可以避免因3’末端错配产生的PCR假阴性,提高检测阳性率。     

CYP2A6基因多态性的一步PCR-RFLP分析法

目的：建立CYP2A6基因多态性的一步PCR－RFLP分析法。方法：取外周静脉血100μl，用Rose法提取基因组DNA，用特异性引物CYP2A6F03：5′-CTG ATC GAC TAG GCG TGG TA-3′,cyp2a6r06:5′-CGT CCT GGG TGT TTT CCT TC-3′进行一步PCR扩增，用限制性内切酶Dde I,XcmI对PCR产物进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的PCR产物大小为214bp，部分血样标本未获得PCR扩增产物，判为CYP2A6缺失基因型（CYP2A6 del/CYP2A6del)。DdeI酶切后，凝胶电泳可得到部分酶切（CYP2A6wt/CYP2A6v2基因型），未被酶切（CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型）两种类型DNA片段；XcmI酶切后，凝胶电泳可得到部分酶切（CYP2A6wt/CYP2A6vl/CYP2A6wt基因型），未被酶切（CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型）两种类型DNA片段。其中，部分血样标本同时被DdeI和XcmI部分酶切（CYP2A6v2/CYP2A6vl基因型）。应用此方法检测，发现中国人群胃癌患者存在CYP2A6等位基因多态性。经双盲重复检测，上述结果一致。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、特异的CYP2A6基因多态性分析法。     

台州地区汉族人群CYP2C19基因多态性研究

目的研究台州地区汉族人群细胞色素P4502C19(CYP2C19)基因型的分布情况,以指导临床氯吡格雷的个体化用药。方法运用荧光定量PCR技术对台州地区501例无血缘关系的汉族患者进行基因多态性检测,分析其基因型及代谢表型的分布,并比较不同性别和地区汉族人群CYP2C19基因多态性。结果台州地区汉族人群中CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*33种等位基因的频率分别为61.28%、33.93%、4.79%,最主要的基因型为CYP2C19*1/CYP2C19*1（39.32%）、CYP2C19*1/CYP2C19*2（37.33%）。CYP2C193种代谢表型快代谢型占39.32%,中间代谢型占43.51%,慢代谢型占17.17%。不同性别者之间CYP2C19基因多态性差异无统计学意义（P＞0.05）。不同地区汉族人群之间CYP2C19的基因多态性差异有统计学意义（P＜0.05）。结论CYP2C19基因多态性分布不受性别的影响,但具有明显的地域性特点。台州地区汉族人群CYP2C19代谢表型以中间代谢型为主,为临床氯吡格雷的个体化用药提供参考依据。     

多重PCR点突变筛查技术在CYP2C19基因分型中的应用

目的 建立一种多重PCR点突变筛查技术,用以细胞色素氧化酶P450 2C19(CYP2C19)的基因分型.方法 设计含有拱桥式次黄嘌呤的多重PCR引物(DMP).在一个PCR管内,同时检测CYP2C19的*1、*2、*3等位基因.结果 多重PCR点突变筛查技术,最低检测下限可以达到2.8 ng,具有较高的检测灵敏度.其成功检出 248份健康人抗凝静脉血CYP2C19等位基因*1、*2、*3.并与部分标本测序法结果比较,结果与测序法结果完全一致.结论 成功建立了多重PCR点突变筛查技术,该技术特异性高、操作简单、价格低廉,为基础研究、个体化用药提供了合理可靠的检测手段.

Abstract：

Objective To establish a multiplex PCR point mutation screening technique for the genotyping of CYP2C19.Methods Deoxyinosine multiplex-polymerase chain reaction (PCR) primers (DMPs) were designed to detect simultaneously CYP2C19 * 1, * 2, * 3 alleles in one PCR tube.Results The above technique could detect the genotypes of CYP2C19 * 1, CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3 successfully.And the results were completely consistent with those of DNA sequencing.Conclusion A novel screening technique of multiplex PCR point mutation is successfully established.With the advantages of high specificity, convenient handling, fast completion and low cost, it provides a reasonable and reliable detection method for basic researches and personalized medicine.     

快速、高通量MTHFR基因C677T多态性检测方法的建立

目的:建立亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因C677T多态性的快速检测方法.方法:提取健康人外周血基因组DNA,采用PCR扩增含677位点的MTHFR基因片段.对PCR产物中残余的dNTPs和游离单链引物消化处理后进行TDI反应,测定荧光偏振值并分析C677T基因型.同时采用PCR-RFLP方法分析C677T基因型进行比较.结果:100例标本中,TDI-FP分析MTHFR C677T基因型:C/C 40例、T/T 14例、C/T 46例;PCR-RFLP分析MTHFR C677T基因型:C/C 40例、T/T 12例、C/T 48例;其中两种方法检测结果不一致的两例标本经焦磷酸微测序证实为T/T纯合子.结论:建立了一种新的基于TDI-FP的MTHFR C677T基因分型方法,该方法较RFLP方法更为准确,且快速、简便、通量高,适用于临床大批量标本的筛查.     

血栓性疾病个体化用药指导基因芯片试剂盒的制备和效果评价

目的：探讨血栓性疾病（TD）个体化用药指导基因芯片的制备过程,阐明一种快速、高通量检测氯吡格雷和华法林药物代谢基因的方法。方法：根据氯吡格雷药物代谢基因位点（CYP3A4、CYP2C19*17、CYP2C19*2和CYP2C19*3）和华法林药物代谢基因位点（CYP4F2*3、GGCX、VKORC1-2、VKORC1-1、CYP2C9*2和CYP2C9*3）设计相应的探针和引物,制备TD个体化用药指导的基因芯片检测试剂盒。经过DNA提取、PCR扩增、杂交、洗脱和扫描等步骤对基因芯片的灵敏性、重复性和稳定性进行评价。收集3个地区的150例TD受试者样本并进行药物代谢基因检测,以受试者在临床中接受的用药指导及6个月后患者的疾病恢复情况为依据,评价基因芯片试剂盒的有效率。结果：基因芯片检测2种药物的代谢基因均出现良好的杂交信号;芯片检测PCR扩增产物的最低检测浓度为10³ copies·mL^-1;对不同批次的3张芯片及同一批次的10张芯片进行平行测定,符合率为100%;芯片具有稳定性,有效期长达6个月;来源于3个地区的150例TD样本验证基因芯片检测试剂盒的有效率在90%以上。结论：成功制备了高通量检测氯吡格雷和华法林药物代谢基因的TD个体化用药指导基因芯片试剂盒,该方法灵敏度高,重复性好,稳定性强,制备效果优良。     

一步法人类CYP2C19基因分型检测在临床中的应用及其意义

目的 探索一步实时荧光PCR检测CYP2C19基因分型的方法。方法采用人类CYP2C19基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对全血或人基因组进行一步法实时荧光PCR检测,同时采用焦磷酸测序和试剂盒进行对比。结果一步法检测结果准确性为100%。重复性检测显示,该法对各个基因型Ct值进行变异系数(CV值)的统计学分析,CV值均小于5%,对已知基因型的浓度的检测范围为0.2～125 ng,对杂合突变型基因组DNA(1 ng)和血液样本(十倍稀释)进行7次检测,变异系数(CV值)均小于5%,对特异性样品、EDTA抗凝样本、枸橼酸钠抗凝样本、乳糜血样本、血红素污染样本的基因型都有较好的检测效果。结论一步法检测方法准确性高,检测范围宽,重复性、特异性和灵敏度均能达到人基因组DNA样本的检测的水平,满足临床对人CYP2C19基因分型检测的目的。     

基于AllgloTM探针检测IL-1单核苷酸多态性检测方法的建立

目的：探讨AllgloTM探针检测IL-1单核苷酸多态性的实用性。方法：采用AllgloTM 探针实时荧光PCR对IL-1β基因SNP进行基因分型。设计其3954C＆gt;T位点AllgloTM探针序列和PCR扩增引物,按照PCR产物特异性和扩增效率,对退火温度、引物浓度等条件进行优化。结果：结果显示AllgloTM探针实时荧光PCR检测体系最适引物浓度为0.4μM,退化温度为58.9℃两步法PCR。在同一条件体系下,检测100例健康体检者IL-1β基因3954C＆gt;T位点,并进行基因分型,测序验证其分型结果。结论：AllgloTM探针实时荧光PCR检测IL-1β基因SNP是一种值得推广的高通量、低成本、常规化的基因分型方法。     

贵州水族人群细胞色素P450 2C19基因多态性分析

目的研究贵州水族人群细胞色素P450 2C19（CYP 2C19）的遗传多态性。方法应用PCR技术对贵州水族人群细胞色素P450 2C19基因进行扩增,并以SmaⅠ进行限制性酶切图谱分析。结果96份贵州水族人群血样中47份为CYP 2C19野生型纯合子（wt/wt）,36份为CYP 2C19杂合子（m1/wt）,13份为CYP 2C19突变型纯合子（ml/ml）;结论贵州水族人群中的CYP 2C19基因多态性与其他民族相比具有一定的差异性。     

应用焦磷酸微测序技术行HLA-DRB基因型分析

目的应用焦磷酸微测序技术进行HLA-DRB基因型分析.方法PCR扩增外显子2基因片段,经链亲和素包被磁珠纯化、制备单链DNA测序模板,应用焦磷酸微测序技术进行实时测序和HLA-DRB基因分型.结果焦磷酸微测序技术-次可判读40～80个碱基,采用3-4个微测序可以判读全部扩增区域的多态性位点,测序结果与HLA数据库基因序列比较,可准确进行HLA-DRB基因型分析.结论焦磷酸微测序技术应用于HLA-DRB基因型分析具有高分辨率、高通量和快速等优点,该方法可应用于器官及骨髓移植的供体/受体筛查.     

Application of multiplex PCR in genotyping of hepatitis B virus prevailing in Guangdong Province of China]

OBJECTIVE: To establish a convenient method for the genotyping of hepatitis B virus (HBV) using multiplex PCR. METHOD: Based on the alignment of 114 complete nucleotide sequences of HBV DNA belonging to different genotypes, acquired from the GenBank, genotype-specific sequences were identified according to which 6 pairs of primers were designed corresponding to each genotype. Subsequent genotyping of HBV was performed using these primers that were added, either alone or in conjunction with others, into a multiplex PCR reaction tube, and HBV genotype was determined according to the length of amplified DNA. RESULT: The genotyping result of multiplex PCR was consistent with that produced by PCR- restriction fragment length polymorphism as established by Lindh. We found in this study that among the HBV carriers in the vicinities Guangzhou of City, about 45% belonged to B genotype, 38.75% to C genotype and 16.75% to D genotype. CONCLUSION: This multiplex PCR method is simple, convenient and more differential.     

应用多重PCR法对广东地区HBV进行基因型(A-F)分型

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)基因型(A-F)多重PCR分型方法,并利用该方法对广东地区HBV PCR阳性血清进行分型。方法将GenBank中114例HBV 全序列进行比较分析,找出每种基因型相对于其他五种基因型的独特序列,并根据这些独特序列设计出六对分别针对A-F基因型的特异引物。利用这六对引物建立HBV的多重PCR分型法。结果多重PCR与以前用PCR-限制温度长度多态型分析法的分型结果一致。对广州周边地区HBV携带者的初步分型结果显示,主要为B型和C型,分别占45.00%和38.75%,另外还有16.25%的D型。结论用多重PCR分型法准确易行,灵敏性高,便于推广应用。