球毛壳菌α-葡聚糖酶的异源表达、纯化及特性表征

利用毕赤酵母密码子偏好性优化合成球毛壳菌α-葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母GS115中实现异源表达。通过高拷贝筛选和摇瓶发酵条件的单因素优化,重组α-葡聚糖酶的酶活力由初始的2.692 U/mL提高至47.915 U/mL。选择 Hitrap Q HP 和Hitrap SP HP 的双步层析分离将发酵粗酶液纯化至电泳纯,纯化倍数40.83,比活达277.61 U/mg,回收率为24.15%。纯酶最适温度和pH分别为60 ℃和5.5。在20~50 ℃和pH为4.5~8.5范围内稳定性良好,浓度为10 mmol/L的Fe²⁺对酶有激活作用,Cu²⁺浓度（0.1~10 mmol/L）越高对酶的抑制作用越强。酶动力学实验发现该重组酶对高相对分子质量的底物亲和力更高,葡聚糖T2000为该酶的最适底物。     

灵杆菌胞外核酸酶在短短芽孢杆菌中的高效表达

利用短短芽孢杆菌（Brevibacillus choshinensis）原核表达系统对灵杆菌胞外核酸酶（Serratia marcescens non-specific nuclease,SMNE）进行重组表达,以期获得高产量重组SMNE。利用大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体构建SMNE重组质粒,实现其在B. choshinensis HD31-SP3菌株中的表达。通过粗酶活检测验证其活性后,首先对温度、甘油和发酵时长等发酵条件进行优化,随后将获得的重组SMNE经亲和层析、凝胶阻滞层析分离纯化后进行酶活性质表征检测。经B. choshinensis HD31-SP3菌株重组表达的SMNE,初测胞外酶活为4.07×10⁶ U/L。经发酵条件的优化测试,最终在培养基中加入终体积分数5%甘油,于30 ℃下摇瓶培养56 h,获得的发酵上清胞外酶活可达2.6×10⁷ U/L,是未优化条件的6倍;经蛋白质纯化条件筛选,最终经一步亲和纯化后SMNE回收产量即达30~40 mg/dL,比活力为1.3×107 U/mg,为商业化对照的2~3倍。通过对该酶的酶学性质鉴定后发现：该酶最适反应条件为37~45 ℃,pH 8~9;在不存在Mg²⁺/Mn²⁺的情况下仍保持47%的活性,且在300 mmol/L Na+/K+条件下可保持35%~45%的活性。     

耐盐芽孢杆菌R1高效壳聚糖酶异源表达及特性分析

采用同源克隆获得耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶基因,并异源表达制备重组耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶（CsnBh46）,通过表征分析获得重组CsnBh46酶学特性。重组CsnBh46全长278个氨基酸,三维结构显示其分为上下两个半球,包含9个α螺旋和2个β折叠。在7 L发酵罐中,重组工程菌bh-5的最高酶活力和总蛋白质质量浓度分别为6 375 U/mL和4.3 g/L。纯化后的重组CsnBh46最适反应pH和温度分别为6.0和60 ℃,金属离子Mn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺对重组CsnBh46具有激活作用。重组CsnBh46最适底物为脱乙酰度95%胶体壳聚糖。重组CsnBh46能够高效水解胶体壳聚糖并且根据反应时间可以定向制备不同聚合度壳寡糖。本研究为CsnBh46产业化应用奠定基础。     

金属离子协同氨基酸提高重组β-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的表达

随着环糊精的应用越来越广,其生产所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.19,简称CGT酶)已成为研究热点。为了克服天然菌种产环糊精葡萄糖基转移酶(CGT)能力低等缺陷,该文将来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶基因插入质粒p ST中,构建了分泌型表达载体cgt/p ST并在宿主B.subtilis WB600中成功表达;通过对摇瓶发酵产CGT酶的条件进行优化发现,当发酵培养基为TB,p H为7.0时,37℃培养48 h后胞外酶活力达到27.9 U/m L,与天然菌株B.circulans STB01在较优发酵条件下所分泌的胞外酶活力相比,提高了近19倍;对TB培养基碳源、氮源进一步优化,以6 g/L的玉米淀粉替代TB培养基中的甘油,以30 g/L的酵母提取物作为氮源,胞外酶活可达到31.2 U/m L;亮氨酸、天冬氨酸的添加能明显促进β-CGT酶的胞外表达,而0.5mmol/L Fe3+的添加能进一步将胞外酶活提高到36.9 U/m L。这是目前报道的β-CGT酶在B.subtilis中胞外表达的最高β-环化活力。     

脲酶基因挖掘及其在枯草芽孢杆菌中的重组表达

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，简称EC）是一种存在于黄酒中的潜在致癌物，酶法降解EC及其前体物质尿素因此备受关注。该研究通过基因挖掘获得了解淀粉芽孢杆菌IT-45的脲酶（Ba-urease）基因并在食品级系统枯草芽孢杆菌中实现了表达与应用。通过密码子优化、核糖体结合位点优化重构脲酶基因簇后，酶活力从6.85 U/mL提升至9.01 U/mL；通过调整基因ureC的位置，脲酶活力进一步提升至10.15 U/mL。研究发现，重组脲酶的最适反应温度为37 ℃；最适反应pH范围为6.5~7.0，为中性脲酶。摇瓶发酵的最佳培养条件为：TB培养基、接种体积分数5%、诱导温度28 ℃、Ni²⁺添加量4 mmol/L。在最佳发酵条件下，酶活力达到12.5 U/mL，在酶法降解黄酒中的尿素具有应用前景。     

枯草芽孢杆菌产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵优化

D--阿洛酮糖是D--果糖在C-3位的差向异构体,由于较低的热量和与蔗糖相似的甜度,D-阿洛酮糖成为一个具有发展前景的功能性甜味剂。D--阿洛酮糖 3-差向异构酶（D--psicose 3-epimerase,EC 5.1.3.30,DPEase）能够催化D--果糖生产D--阿洛酮糖,这种生物酶法制备的功能性甜味剂D--阿洛酮糖由于简单的纯化步骤和高产物浓度等优点受到关注。该研究对1株前期构建的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal产DPEase进行了3 L发酵罐水平培养,通过优化溶解氧（DO）、pH、温度、初始碳源质量浓度确定最适发酵条件为：DO为30%、pH 6.0、温度37 ℃、初始葡萄糖质量浓度15 g/L,最高发酵酶活达78.3 U/mL。在此基础上进行补料发酵优化,得到最适补料条件为：在发酵5 h进行补料,碳源补料速率8.0 g/（L·h）,在此条件下,发酵9 h全细胞酶活高达123.0 U/mL。此发酵策略为扩大工业化生产提供了参考。     

重组毕赤酵母产a-葡聚糖酶甲醇流加控制的研究

本文在摇瓶发酵的基础上,利用5L发酵罐进行重组毕赤酵母甲醇诱导产Ⅸ．葡聚糖酶发酵条件的优化。结果表明,菌体湿重250g／L时开始诱导,诱导表达阶段溶氧控制在10％～20％,甲醇诱导90h时仪．葡聚糖酶酶活达330U／mL。     

黑曲霉β-葡聚糖酶基因eglA6在乳酸克鲁维酵母中的表达及重组酶性质

以黑曲霉（Aspergillus niger）高耐热葡聚糖酶编码基因eglA6在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）中的表达及重组酶性质为研究目的。利用乳酸克鲁维酵母表达系统,构建表达eglA6基因的重组菌K. Lactis GG799/pKLAC1-eglA6 SL105,重组菌摇瓶发酵酶活达到23.0 U/mL。重组酶AnEglA6K表观相对分子质量为5.6×10⁴,明显高于同一基因在巴斯德毕赤酵母中的表达产物。重组酶最适pH为5.0,最适温度为75 ℃,在80 ℃时酶活半衰期为65.0 min。以微晶纤维素为底物时重组酶比酶活约为0.5 U/mg。基因eglA6在乳酸克鲁维酵母中的表达产物与其在巴斯德毕赤酵母中的表达产物有明显差异,前者相对分子质量明显高于后者,热稳定性和结晶纤维素降解活性也高于后者。以乳酸克鲁维酵母为宿主表达eglA6基因获得的重组葡聚糖酶具有很高的耐热性,适合在饲料工业中应用。     

柠檬明串珠菌KM20中D-乳酸脱氢酶的特性

目的：分析柠檬明串珠菌中D-乳酸脱氢酶（D-LDH）的酶学特性。方法：对柠檬明串珠菌KM20中D-乳酸脱氢酶基因进行克隆表达并构建表达质粒,转化至Escherichia coli BL21（DE3）中实现过表达。结果：经Ni-NTA柱亲和层析纯化后,D-LDH-1与D-LDH-2编码的蛋白分子质量分别为40.0,38.5 kDa;比活力分别为2.18,153.10 U/mg;在丙酮酸还原中两种酶的最适pH值与最适温度均为8.0与40 ℃;而乳酸氧化时D-LDH-2的最适pH值与最适温度分别为12.0与30 ℃。D-LDH-1与D-LDH-2对草酰乙酸、苯丙酮酸和2-酮戊二酸具有较强的催化能力,且Ca²⁺、Cu²⁺和Na⁺对其酶活性均具有促进作用,Zn²⁺与SDS对酶活性有极高的抑制作用。此外,两种酶对丙酮酸的K_m值分别为2.98,6.11 mmol/L,对丙酮酸的K_cat/K_m分别为6.04×10²,2.28×10⁴ L/（mol·s）,LDH-2对D-乳酸的K_cat/K_m为65.0 L/（mol·s）。结论：D-LDH-1与D-LDH-2为柠檬酸明串珠菌中催化D-乳酸合成的关键酶。     

鲢鱼和青鱼内源性转谷氨酰胺酶纯化及酶学性质比较

目的：探究鲢鱼、青鱼内源性转谷氨酰胺酶（transglutaminase, TGase）的酶学性质差异。方法：采用80% （NH₄）₂SO₄盐析、Q-Sepharose FF和Sephacryl S-200 HR层析法从鲢鱼、青鱼肌肉中分离纯化出鲢鱼TGase（STG）、青鱼TGase（BTG）,并对酶的相对分子质量、肽段序列、二级结构、适宜反应条件、热失活动力学等指标进行测定。结果：纯化后的STG和BTG的比酶活分别为14.34,12.67 U/mg,二者具有相近的相对分子质量。二者的肽段序列存在一定差异,其二级结构均以β-折叠为主,但STG的β-折叠含量略高于BTG的。STG和BTG的适宜反应温度均为50 ℃,适宜反应pH分别为8.0,7.5,完全激活两种TGase活性所需的Ca²⁺浓度均为1 mmol/L,DTT可使两种TGase的酶活性增强,而PMSF、NH₄Cl、NEM、EDTA、Cu²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺则会抑制其酶活。当温度为37~50 ℃时,热处理对STG和BTG的钝化均符合一级指数衰减动力学,二者的动力学参数E_a值相近。结论：STG和BTG的一级结构及二级结构差异明显,但仍具有相似的适宜反应条件和热失活动力学特征。     

重组蔗糖异构酶在短短芽孢杆菌中的表达及发酵优化

对重组菌株Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI摇瓶发酵产蔗糖异构酶进行研究,进一步探讨了3 L发酵罐不同发酵条件对菌体生长及产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵后胞外酶活为50 U/mL,最优3 L发酵罐培养条件为:初始碳源为葡萄糖质量浓度10 g/L,初始氮源为多聚蛋白胨、牛肉浸膏质量浓度各15 g/L,发酵温度30℃,溶氧30%,在此条件下得到的最高酶活为275 U/mL。为了探索启动子对蔗糖异构酶表达的影响,分别选取来源于枯草芽孢杆菌的启动子Papr-E,Pnpr-E,Pamy以及来源于巨大芽孢杆菌的启动子Pxyl进行研究。结果表明,使用启动子Papr-E的表达量最高。进一步优化摇瓶发酵条件,重组菌株BCpNapr-SI摇瓶发酵的胞外上清酶活为137 U/mL,在此条件下进行3 L发酵罐发酵,最终发酵上清胞外酶活为485.5 U/mL,是未优化启动子的1.76倍。     

理性代谢工程改造促进谷氨酸棒杆菌高效合成L-谷氨酰胺

L-谷氨酰胺（L-glutamine,L-Gln）是人体液中含量最丰富的一种半必需氨基酸,具有多种营养和药理功能,被广泛应用于医药、食品添加剂、营养保健品、饲料等领域。目前,微生物发酵法是生产L-Gln的主要方法,发酵产酸效率低、副产物多、菌种性能欠缺等问题严重限制了其工业化应用。为解决这一问题,作者以实验室前期构建的L-Gln生产菌株CGQ03为出发菌株,通过强化谷氨酸脱氢酶表达及辅因子NADPH供应促进前体L-谷氨酸合成、增强辅因子ATP胞内含量、过表达溶氧相关蛋白VHb提高细胞携氧能力、增强关键酶谷氨酰胺合成酶催化活性及发酵工艺优化等策略提高了L-Gln产量。最终的基因工程菌CGQ08/pDXW10-glnA<>supSc-gdh^Cg在5 L发酵罐上补料分批发酵66 h,L-Gln的产量最高达（94.5±1.8） g/L,糖酸转化率为34.8%,生产强度为1.43 g/（L·h）。本研究为L-Gln及其相关化合物的工业化生产提供了借鉴。     

Zn2+对轮枝链霉菌SK4.001生长及转谷氨酰胺酶合成的影响

研究了Zn2+在SK4.001发酵生产转谷氨酰胺酶中的作用. 在发酵培养基中加入不同质量浓度的Zn2+,检测菌体量、pH、残余甘油及转谷氨酰胺酶(TGase) 酶活的变化, 发现Zn2+在SK4.001发酵生产转谷氨酰胺酶中除满足菌体生长需要外,还具有提高转谷氨酰胺酶酶活的作用. 发酵培养基中含有3.15 μg/mL Zn2+时,菌体生长正常,菌体量较高;当Zn2+质量浓度增加到8.15 μg/mL时,菌体量改变不明显, 但转谷氨酰胺酶酶活迅速上升,达到4.723 U/mL,是Zn2+质量浓度为3.15 μg/mL时的2.06倍.     

Bacillussp.HA-1产环糊精葡萄糖基转移酶发酵工艺研究

在10 L 发酵罐中,研究了环糊精葡萄糖基转移酶产生菌 Bacillus sp．HA-1的发酵规律,结果表明,在菌体对数增长期,发酵液溶氧处于较低状态,发酵液 pH 在对数增长前期持续下降,中期后回升,菌体产酶呈增长趋势；当菌体增长进入稳定期,发酵液溶氧迅速回升至初始状态,pH 也回升至起始值,菌体产酶接近峰值。根据发酵规律优化发酵工艺,通过有效增加菌体对数增长期发酵液溶氧,使菌株产酶到达高峰的时间缩短了 50%以上。应用该菌株在5 m~3生产罐中发酵,24 h 产酶水平达到6 800 IU/mL。     

高密度发酵产酪氨酸酚裂解酶及催化合成L-DOPA

为了提高酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,TPL)的表达量和酶活,使之更高效地催化合成左旋多巴(3,4-2-dihydroxylphenylalanine,L-DOPA),在摇瓶优化的基础上,研究了溶氧控制策略、补料策略、诱导温度和诱导策略对菌体生长、TPL酶活和L-DOPA产量的影响。结果表明,在5 L发酵罐中25℃诱导条件下,采用DOstat补料策略控制罐内溶氧的体积分数为20%,菌体浓度、TPL酶活和催化合成L-DOPA产量较分批培养分别提高了17. 9%、57. 7%和27. 8%。诱导后控制溶氧体积分数在40%相比于20%更利于TPL的表达,酶活相比于20%的DO的提高了33. 8%。通过优化起始诱导时间,在菌体生长的对数前期(OD_(600)=7)诱导,细胞浓度提高到51. 2 g/L,酶活提高到2. 43 U/mL,L-DOPA产量为56. 58 g/L,较分批培养分别提高了64. 1%、170%和209. 2%。初步实现了重组大肠杆菌高密度培养生产TPL,为L-DOPA产业化研究奠定了基础。     

不同米蛋白组分与铅的结合规律

为了探究不同米蛋白组分与重金属铅（Pb²⁺）的结合规律，从动力学、热力学角度对3种水不溶性米蛋白（球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白）与Pb²⁺的结合特征进行了分析。结果表明：3种蛋白质与Pb²⁺的结合均很迅速，30 min即可达到反应平衡；醇溶蛋白对Pb²⁺的结合能力最强，平衡结合量达20.54 mg/g；米蛋白与Pb²⁺的结合过程符合准二级动力学模型，Langmuir等温吸附模型的拟合效果（R²=0.980~0.995）要优于Freundlich模型（R²=0.847~0.987），说明两者结合以化学吸附为主；热力学参数ΔS°> 0、ΔH°> 0、ΔG°< 0，说明3种米蛋白与Pb²⁺的结合均为自发、熵驱动的吸热反应。X射线光电子能谱（XPS）表明醇溶蛋白与Pb²⁺结合后，N1s和S2p的特征峰强度显著降低（P<0.05），说明Pb²⁺主要与醇溶蛋白中的含氮、含硫基团相结合。扫描电镜（SEM）显示醇溶蛋白与Pb²⁺结合后，颗粒发生聚集，呈致密团块状结构，进一步验证了Pb²⁺和醇溶蛋白的结合。     

微咸水灌溉条件下施用不同改良剂对盐渍化土壤盐分离子分布的影响--测试文章

利用5种不同的土壤改良剂,对矿化度在2～3 g·L^-1的微咸水灌溉棉田土壤进行改良效果研究。结果表明：五种改良剂均降低土壤pH值和总盐含量,并能有效控制土体Na⁺、Ca²⁺、SO₄^2-、HCO₃^-积累;其中,磷石膏能显著降低土体Na⁺、Ca²⁺、SO₄^2-总含量（P＜0.05）,DS1997能显著降低土体Na⁺、HCO₃^-总含量（P＜0.05）,酸碱平衡剂显著降低土体Ca²⁺、SO₄^2-总含量（P＜0.05）,禾康改良剂有效控制土体SO₄^2-、HCO₃^-含量;改良剂对土体中Cl^-改良效果不显著（P＞0.05）。研究得出：微咸水灌溉导致土壤pH值升高和含盐量增加,造成土壤盐分的积累;土壤改良剂可有效减少微咸水灌溉引起的盐分积累,改善土壤理化特性和盐分离子分布。     

常压室温等离子诱变选育β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株及发酵工艺研究

目的以嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)为出发菌株,利用常压室温等离子体快速诱变技术筛选β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株,并对其发酵工艺进行优化。方法采用平板菌落透明圈大小结合摇瓶发酵酶活测定进行菌株筛选和发酵工艺优化。结果筛选出一株遗传稳定性好的β-环糊精葡萄糖基转移酶高产突变株HX188,在5 m~3发酵罐装料系数为55%的条件下,经连续6代发酵生产试验,发酵周期平均为40 h,产酶水平可稳定在6302 U/m L左右,较出发菌株2803 U/m L提高了124.8%;其最佳发酵工艺条件为:玉米淀粉2%,豆粕粉5%,pH 8.7,温度37℃,溶氧水平为20%,适时流加玉米淀粉、氮源和乳糖可提高菌体浓度及β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活力。结论筛选出的突变株HX188遗传稳定性好,产酶能力强,能够满足工业化生产的需要。     

基于MTT比色和响应面法优化侧孢短芽孢杆菌最大活菌数培养条件

目的：探索获得侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）最大活菌数的最佳培养基成分及培养条件。方法：在建立MTT比色法与平板计数法的相关回归方程基础上,对获得最大活菌数的侧孢短芽孢杆菌最适培养基成分（碳源、氮源、无机盐）和培养条件（初始pH、温度、接种量、磷酸二氢钾）进行优化。结果：MTT比色法与平板计数法对活菌数测定结果表现出显著的线性关联（R²>0.999）;麦芽糖、氯化钙、初始pH、磷酸二氢钾为显著影响因子,最佳发酵条件为麦芽糖8.75 g/L,氯化钙0.17 g/L,初始pH 7.07、磷酸二氢钾3.73 g/L,此条件下活菌数为8.12×10⁸ CFU/mL,与理论活菌数（8.25×10⁸ CFU/mL）无显著差异。结论：基于MTT比色和响应面法优化侧孢短芽孢杆菌最大活菌数培养条件,优化后的活菌数较优化前提高了3.02倍。     

含羧甲基纤维素钠的发酵乳中脂肪检测技术

目的:提高含有CMC-Na发酵乳中脂肪检测方法的准确性。方法:采用国家标准方法——碱水解法,对含有CMC-Na发酵乳中的脂肪进行测定;通过优化碱水解法中各关键参数、盐酸水解代替氨水水解以及碱水解法中加入金属离子等方式,探索适用于含有CMC-Na发酵乳中脂肪的检测技术。结果:① 随着CMC-Na添加量的增加,碱水解法测得含CMC-Na发酵乳中脂肪结果越低;② 碱水解法中氨水体积、水解时间、水解温度、提取次数4个关键条件的改变,并不会对含CMC-Na发酵乳中脂肪的测定产生有效影响;③ 采用2 mL盐酸水解代替氨水水解时,不同CMC-Na添加量(0.50%,0.75%,1.00%)的发酵乳中脂肪测定结果,与碱水解法测定不含CMC-Na发酵乳的结果基本一致;④ 碱水解法中加入金属离子Na⁺、K⁺、Ca²⁺时,Na⁺、K⁺的浓度越高,含CMC-Na发酵乳的脂肪测定结果越高,并在金属离子浓度达到0.5 mol/L 后达到正常值,而随Ca²⁺浓度的增加,脂肪测定结果先小幅提高后显著下降。结论:CMC-Na的添加会使得发酵乳中脂肪测定结果偏低,可采用盐酸水解或在碱水解法中加入Na⁺、K⁺,提高含有CMC-Na发酵乳中脂肪测定的准确性。