针刺通过调节自噬反应对脑卒中大鼠的神经元损伤的影响

目的 探讨针刺通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、UNC-51样自噬激活激酶(ULK)1/2介导的自噬对脑卒中大鼠神经元的影响。方法 50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、针刺+5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)组，每组10只，除假手术组其他4组采用中动脉栓塞法构建模型，并给予相应治疗。治疗后24 h,对各组大鼠神经功能缺损程度进行评分。结果 与假手术组比较，模型组治疗后神经功能缺损评分、海马组织AMPK、磷酸化ULK1(p-ULK1)/ULK1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)B/A、Beclin-1表达升高，mTOR表达降低(P<0.05);与模型组比较，针刺组和3-MA组大鼠神经元损伤、自噬减轻，神经功能缺损评分、海马组织AMPK、p-ULK1/ULK1、LC3B/A、Beclin-1表达降低，mTOR表达升高(P<0.05);针刺+AICAR组治疗后神经功能缺损评分、海马组织AMPK、p-ULK1/ULK1、LC3B/A、Beclin-1表达明显高于针刺组(P<0.05),...     

自噬铁环镜变化对成骨细胞(hFOB1.19)及其骨代谢异常的影响

目的探讨成骨细胞自噬在铁环境变化情况下致骨代谢异常的作用。方法实验分为对照组、枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)组、枸橼酸铁铵+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组、去铁胺(deferoxamine,DFO)+FAC+3-MA组、DFO+FAC组。用Western blot法检测成骨细胞自噬(LC3、P62、Beclin1)和成骨(collagen typeⅠ,COLⅠ)和骨钙素(bone gla-protein,BGP)标志蛋白的表达;共聚焦显微镜观察成骨细胞COLⅠ、BGP的荧光蛋白;流式细胞仪检测成骨细胞凋亡; Von kossa染色法行钙结节染色;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性。结果与对照组比较,FAC组LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达增加、LC3Ⅱ/Ⅰ比值增大,可溶性P62、COLⅠ、BGP蛋白表达减少,细胞凋亡增加,细胞矿化能力(0.68±1.63)及碱性磷酸酶活性(0.68±1.84)下降(P0.05),不可溶性P62蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)。加入3-MA抑制剂后,与对照组、FAC组比较,LC3Ⅱ、可溶性P62、Beclin1蛋白表达减少、LC3Ⅱ/Ⅰ比值减小,COLⅠ、BGP蛋白表达进一步减少,细胞矿化能力(0.44±1.63)及碱性磷酸酶活性(0.53±0.97)下降,细胞凋亡、不可溶性P62蛋白表达增加(P0.05);但FAC+3-MA组与DFO+FAC+3-MA组结果比较,差异无统计学意义(P0.05)。与对照组比较,DFO+FAC组LC3Ⅱ/Ⅰ比值变小,LC3Ⅱ、Beclin1、可溶性P62、COLⅠ、BGP蛋白表达减少,细胞凋亡增加,细胞矿化能力(0.86±0.39)及碱性磷酸酶活性(0.76±0.52)下降(P0.05),不可溶性P62蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)。与FAC组比较,DFO+FAC组LC3Ⅱ/Ⅰ比值变小,LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达减少(P0.05),可溶性P62、COLⅠ、BGP蛋白表达增加,细胞凋亡减少,细胞矿化能力及碱性磷酸酶活性升高(P0.05),不可溶性P62蛋白表达无差异(P0.05)。结论成骨细胞自噬在骨代谢过程中起着重要作用,过度激活或抑制自噬均会对细胞产生损害,适宜的自噬水平对成骨细胞的功能活性有促进作用。降铁后能降低高铁引起的过度自噬,促进成骨细胞的成骨功能。     

按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦平滑肌RhoA/ROCK信号表达的影响

目的:通过固定循经取穴配伍以不同部位选穴进行对比研究,以糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis,DGP)大鼠为观察对象,研究不同按部选穴针刺治疗对DGP大鼠Rho A/ROCK信号的表达差异,探讨按部选穴是影响腧穴配伍效应的主要影响因素.方法:将60只♂SPF级SD大鼠,适应性喂养1 w k后,随机分为空白对照组、模型组、足三里+中脘组、足三里+内关组、足三里+非经非穴组,每组12只.除空白对照组12只外,其余48只大鼠运用链脲佐菌素腹腔注射造糖尿病模型,普通喂养8 wk后建立DGP大鼠模型,针刺治疗4 wk,于13 w k末墨汁灌胃后处死,取胃窦组织.运用Western blot检测胃窦平滑肌组织Ras同源物基因组成员A(Ras homolog gene family,member A,Rho A)、Rho蛋白相关卷曲螺旋激酶(Rho-associatedc,oiled-coil containing protein kinase,ROCK)、肌球蛋白磷酸酶靶亚单位1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)、p-MYPT1蛋白的表达量;应用免疫组织化学检测胃窦平滑肌组织Rho A蛋白平均灰度值改变.结果:与空白对照组相比,模型组的小肠推进率、胃窦平滑肌组织Rho A、ROCK、MYPT1、p-MYPT1蛋白的表达量明显降低(P0.01),胃窦平滑肌组织R h o A灰度值表达升高(P0.05).与模型组相比,足三里+中脘组、足三里+内关组、足三里+非经非穴组的小肠推进率和胃窦平滑肌组织Rho A、ROCK、MYPT1、p-MYPT1蛋白的表达量明显升高(P0.05),胃窦平滑肌组织Rho A灰度值表达均具有降低的趋势(P0.05).与足三里+中脘组相比,足三里+内关、足三里+非经非穴组胃窦平滑肌组织R h o A、ROCK、MYPT1、p-MYPT1蛋白的表达量降低(P0.05),胃窦平滑肌组织Rho A灰度值表达升高(P0.05).在治疗期间,与模型组相比,足三里+中脘组的饮食量明显降低(P0.05).结论:针刺能通过上调Rho A/ROCK信号的表达来促进胃平滑肌收缩,改善DGP的症状;证实按部选穴是影响腧穴配伍效应的重要因素,且配伍局部穴明显优于配伍远端穴及非经非穴.     

蓝莓对肝纤维化大鼠肝组织自噬相关蛋白LC3和Beclin1表达的影响

目的:观察蓝莓对免疫性肝纤维化大鼠肝组织微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)及Beclin1表达的影响.方法:60只健康♂SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、蓝莓原浆高剂量组、蓝莓原浆中剂量组、蓝莓原浆低剂量组及复方鳖甲软肝片组.除正常对照组外,其余各组均采用腹腔注射无菌猪血清复制大鼠肝纤维化模型.造模同时各蓝莓组给予不同浓度蓝莓原浆(0.25 m L/100 g、0.5 m L/100 g、1.0 m L/100 g)灌胃,复方鳖甲软肝片组用复方鳖甲软肝片灌胃(0.054 g/100 g),1次/d.12wk处死大鼠,测定血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)含量,行肝组织病理学检查;Western blot检测LC3-Ⅱ、Beclin1、Ⅰ型胶原(ColⅠ)的蛋白水平;实时定量PCR(realtime quantitative PCR,q RT-PCR)检测LC3-Ⅱ、Beclin1的m RNA水平.结果:各组大鼠血清ALT、AST水平差异无统计学意义(均P0.05).与正常对照组比较,模型组肝纤维化程度明显(P0.05),LC3-Ⅱ、Beclin1的m RNA及蛋白表达、ColⅠ的蛋白表达明显增高(均P0.01).与模型组比较,蓝莓原浆高、中剂量组肝纤维化程度明显减轻(P0.05),胶原表达减少;LC3-Ⅱ、Beclin1的m RNA、蛋白表达及ColⅠ的蛋白表达明显降低(均P0.01).结论:猪血清所致的大鼠免疫性肝纤维化中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1升高,蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化的干预作用可能与下调LC3和Beclin1的基因及蛋白表达,进而抑制自噬有关.     

绞股蓝总甙调控mTOR/ULK1通路对ApoE－/－小鼠动脉粥样硬化的影响

目的基于mTOR/ULK1自噬信号通路探讨绞股蓝总甙改善动脉粥样硬化模型小鼠主动脉脂质沉积的作用机制。方法 30只健康ApoE~(-/-)小鼠随机分为模型对照组、绞股蓝总甙组和辛伐他汀组,每组10只。10只C57BL/6J小鼠作为正常组。模型对照组、绞股蓝总甙组和辛伐他汀组采用高脂饲料喂养4周,绞股蓝总甙组和辛伐他汀组分别采用绞股蓝总甙2.973 g/(kg·d)、辛伐他汀2.275 mg/(kg·d)灌胃8周,模型对照组、正常组予等量生理盐水灌胃。HE染色观察小鼠动脉粥样硬化斑块形成情况,全自动生化分析仪检测血脂水平,Western blot检测主动脉ULK1、Beclin1、LC3、p-mTOR的蛋白表达。结果与正常组相比,模型对照组TG、TC和LDLC水平升高(P0.05),HDLC水平降低(P0.05),主动脉管腔见较大粥样斑块,ULK1、Beclin1、LC3蛋白表达水平下调(P0.01),pmTOR蛋白表达水平上调(P0.01);与模型对照组相比,绞股蓝总甙组和辛伐他汀组TG、TC和LDLC水平降低(P0.05),HDLC水平升高(P0.05),主动脉管腔粥样斑块明显减少,ULK1、Beclin1、LC3蛋白表达水平上调(P0.01),p-mTOR蛋白表达水平呈下调趋势(P0.01或P0.05)。结论绞股蓝总甙可能通过调控自噬缓解动脉粥样硬化斑块形成,进而防治动脉粥样硬化。     

勿动蛋白及其信号通路分子Rho A与Rho相关蛋白激酶在高血压心肌肥厚与纤维化中的作用

目的探讨勿动蛋白(Nogo)/Rho相关蛋白激酶(ROCK)-去甲肾上腺素转运蛋白(NET)信号通路对自发性高血压大鼠心肌肥厚与纤维化的调节作用。方法选择7周龄SPF级同源同系雄性自发性高血压大鼠20只,随机分为4组:对照组、Nogo受体拮抗剂(NEP1-40)组、ROCK抑制剂(法舒地尔)组和NET抑制剂(氟西汀)组,每组5只,饲养7周。分离称量左心室质量,计算左心室质量指数。实时定量PCR检测心肌肥厚标志物心钠肽、脑钠肽、β肌球蛋白重链(β-MHC)基因表达,以及心肌纤维化标志物结缔组织生长因子(CTGF)、心肌胶原组织Ⅰ型(CollagenⅠ)、心肌胶原组织Ⅲ型(CollagenⅢ)和NET基因表达水平。结果与对照组比较,NEP1-40组左心室质量指数、心钠肽、脑钠肽、β-MHC表达明显增高,法舒地尔组左心室质量指数、心钠肽、脑钠肽、β-MHC表达明显降低(P0.05)。与对照组比较,NEP1-40组CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ表达明显增高,法舒地尔组NET表达明显升高,CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ和NET表达明显降低(P0.05)。与对照组比较,氟西汀组心钠肽、脑钠肽、β-MHC、CTGF和CollagenⅠ表达明显增高[(1.37±0.05)%vs (1.26±0.03)%,(1.27±0.04)%vs (1.18±0.07)%,(1.26±0.04)%vs (1.22±0.03)%,2.05±0.01 vs 1.44±0.11,1.86±0.06 vs 1.29±0.05,P0.05]。结论Nogo/ROCK-NET信号通路参与自发性高血压大鼠心肌肥厚与纤维化的调节。     

RhoA/ROCK信号通路在糖尿病结肠肌层中的表达

背景:糖尿病(DM)胃肠动力障碍的机制目前尚不明确,越来越多的研究认为胃肠平滑肌肌源性因素在该病的发生中起重要作用。近年RhoA/ROCK信号通路在DM并发症中的作用成为研究热点。目的:分析DM患者结肠肌层中RhoA/ROCK信号通路主要信号分子的表达变化,探讨该信号通路在DM结肠动力障碍中的可能作用。方法:收集2012年9月-2013年12月南京医科大学第一附属医院行结肠癌根治术患者的正常结肠组织,根据糖化血红蛋白水平,将患者分为DM组和对照组。采用免疫组化或蛋白质印迹法检测结肠肌层中RhoA/ROCK信号通路主要信号分子RhoA、ROCK1、MYPT1和p-MYPT1的表达情况。结果:免疫组化结果显示DM组结肠肌层中RhoA表达明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);蛋白质印迹法结果显示,与对照组相比,DM组RhoA、ROCK1和p-MYPT1蛋白表达均明显减少(0.62±0.42对1.15±0.69,0.54±0.09对0.75±0.05,0.70±0.28对1.04±0.47;P0.05),而MYPT1蛋白表达差异无统计学意义(0.94±0.50对1.21±0.80,P0.05)。结论:DM患者结肠肌层中RhoA/ROCK信号通路活性被抑制,可能与DM结肠动力障碍有一定相关性。     

法舒地尔通过Rho-ROCK通路抑制高糖诱导的单核细胞与内皮细胞黏附

目的观察Rho激酶抑制剂法舒地尔能否抑制高糖诱导的单核细胞(THP-1)与人脐静脉内皮细胞黏附,初步探讨其潜在机制。方法使用荧光显微镜观察荧光标记的THP-1与人脐静脉内皮细胞黏附。血管细胞黏附分子1和单核细胞趋化蛋白1的mRNA及蛋白表达水平分别通过RT-PCR、Western blot检测。使用Western blot检测RhoA、ROCK-1、p-MYPT及MYPT蛋白表达水平变化。结果法舒地尔显著抑制高糖诱导的THP-1与人脐静脉内皮细胞黏附,并呈剂量依赖性,其中,低浓度法舒地尔(10-6 mmol/L)干预24 h黏附减少约33.4%,高浓度法舒地尔(10-5 mmol/L)干预24 h黏附减少约42.8%(P值均0.05),干预12 h组趋势相同。法舒地尔显著减低高糖诱导的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1及单核细胞趋化蛋白1的mRNA及蛋白表达水平,并呈时间依赖性和剂量依赖性。高糖显著增加p-MYPT/MYPT比值,而法舒地尔减弱高糖对p-MYPT/MYPT比值的影响,抑制Rho/RCOK通路激活。结论法舒地尔抑制高糖诱导的THP-1与人脐静脉内皮细胞黏附,减低高糖诱导的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1和单核细胞趋化蛋白1的表达,减少高糖诱导的Rho/RCOK通路激活,提示法舒地尔可能成为新的糖尿病大血管病变治疗药物。     

自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在进展期胰腺癌中的表达及临床意义

目的:探讨自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在进展期胰腺癌组织中的表达及临床意义.方法:应用免疫组织化学法检测64例胰腺癌组织及相应癌旁正常组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62的表达情况;分析自噬蛋白表达水平与胰腺癌临床病理特征的关系.结果:免疫组织化学法检测提示Beclin1蛋白在胰腺癌组织及癌旁正常组织中阳性表达率分别为28.1%(18/64)、90.6%(58/64),LC3蛋白阳性表达率分别为34.4%(22/64)、75%(48/64)P 6 2蛋白表达阳性率分别为7 5%(4 8/6 4)、4 6.9%(3 0/6 4),均P0.0 5;胰腺癌组织中Beclin1与LC3的表达水平呈正相关(r=0.572P0.05),Beclin1、LC3的表达与肿瘤分化、TNM分期相关(P0.05),Beclin1、LC3和P62的表达均与性别、年龄、有无门脉浸润、淋巴结转移无明显相关(P0.05).结论:自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在胰腺癌组织中的异常表达及Beclin 1与LC3两者表达呈正相关提示自噬活动下降可能参与了进展期胰腺癌的发展.     

舒芬太尼对心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-2、LC3Ⅱ、Beclin-1表达的影响

目的探讨舒芬太尼对心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、Beclin-1表达的影响。方法选取SPF级健康雄性SD大鼠52只,随机分为对照组、模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组及舒芬太尼组,各13只。模型组、3-MA组及舒芬太尼组采用左冠状动脉结扎法建立心肌缺血再灌注模型,对照组大鼠接受假手术。冠状动脉结扎前30 min,3-MA组予以3-MA溶液20 mg/kg,尾静脉注射;舒芬太尼组予以枸橼酸舒芬太尼注射液3μg/kg,尾静脉注射;模型组、对照组分别予以等体积0.9%氯化钠溶液,尾静脉注射。比较各组血清心肌酶水平、心肌细胞凋亡指数(AI)、心肌组织Bcl-2蛋白、Bcl-2关联X蛋白(Bax)、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平。结果与模型组比较,3-MA组、舒芬太尼组大鼠血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,心肌组织AI,心肌组织Bax蛋白、LC3Ⅱ蛋白、Beclin-1蛋白表达水平降低,且舒芬太尼组低于3-MA组,差异均有统计学意义(P0.05)。与模型组比较,3-MA组和舒芬太尼组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2/Bax比值较高,且舒芬太尼组高于3-MA组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论舒芬太尼能明显减轻心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤,减少心肌细胞凋亡,其作用可能与下调LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达,抑制心肌细胞自噬有关。     

白藜芦醇通过沉默调节蛋白1-Beclin1信号通路对衰老心肌自噬功能的影响

目的观察白藜芦醇对衰老心肌自噬功能的影响并对其分子机制进行探讨。方法 C57BL/6小鼠分为4月龄组、22月龄组,白藜芦醇组(22月龄加白藜芦醇处理),每组6只。分别用Western blot检测各组小鼠心肌LC3B蛋白表达;免疫共沉淀检测各组心肌Beclin1蛋白乙酰化程度;荧光定量检测各组心肌内沉默调节蛋白1(SIRT1)活性。培养H9C2心肌细胞小片段干扰RNA(siRNA)干涉Beclin1基因后,转染绿色荧光蛋白标记的LC3(GFPLC3)腺病毒,观察心肌细胞中GFP-LC3的数量。结果 4月龄组、22月龄组、白藜芦醇组心肌细胞SIRT1相对活性分别为(100.00±6.21)%、(74.60±7.85)%、(112.30±8.43)%;LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达分别为1.000±0.046、0.524±0.038、0.837±0.044。与4月龄组比较,22月龄组上述指标降低;与22月龄组比较,白藜芦醇组上述指标升高,有统计学差异(P0.05)。与4月龄组比较,22月龄组心肌Beclin1乙酰化程度增加,但白藜芦醇能够逆转这种改变。siRNA干涉Beclin1表达后,H9C2心肌细胞内GFP-LC3颗粒增加(P0.05),加白藜芦醇后GFP-LC3颗粒无明显变化(P0.05)。结论白藜芦醇可能通过SIRT1-Beclin1信号通路提高衰老心肌自噬。     

大鼠脊髓损伤后自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达的变化

目的探讨大鼠脊髓损伤(SCI)后自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达变化对自噬发生的影响。方法构建大鼠脊髓横断损伤模型,分别于损伤后0、4、12 h及1、3、5、7 d通过BBB评分评定SCI大鼠的行为学变化,同时经Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达;并通过腹腔注射自噬抑制剂3-MA和自噬促进剂Rapamycin于SCI小鼠模型,分别于上述时间点通过Western印迹进行Beclin1、LC3的检测,初步探讨自噬抑制剂和自噬促进剂在SCI后对自噬相关蛋白表达变化的作用。结果随着大鼠SCI时间的延长,运动逐渐消失,SCI后3 d大鼠出现无运动现象,之后随着大鼠SCI时间的延长行为逐渐恢复;自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达量随着SCI时间的延长逐渐升高,于3 d左右表达量显著升高(P<0.01)达到峰值;随后其表达量随SCI时间的延长呈现下降的趋势;Rapamycin作用大鼠后Beclin1和LC3的表达量与对照组相比显著增高,于3 d达到极显著水平(P<0.001);3-MA作用大鼠后Beclin1和LC3的表达量与对照组相比显著降低(P<0.001)。结论 Rapamycin能够促进SCI后自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达,最终引发自噬的发生,而3-MA能够抑制Beclin1和LC3的表达,阻止SCI后自噬现象的发生。     

丹参酮ⅡA通过调节自噬小体对ox-LDL诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用

目的基于自噬小体形成信号通路探讨丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。方法体外培养EA.hy926细胞,随机分为正常组、模型组、丹参酮ⅡA组、丹参酮ⅡA+模型组、3-MA组、模型+3-MA组、丹参酮ⅡA+模型+3-MA组。比色法检测各组细胞氧化应激损伤丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力,Western blot技术检测细胞自噬小体形成信号通路相关蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组MDA含量增高(P0.01),SOD活力降低(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量增多(P0.01);3-MA组LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量无明显变化(P0.05)。与模型组比较,丹参酮ⅡA+模型组细胞中MDA含量降低(P0.01),SOD活力增高(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量增多(P0.01);模型+3-MA组MDA含量增高(P0.01),SOD活力降低(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量减少(P0.01)。与丹参酮ⅡA+模型组比较,丹参酮ⅡA+模型+3-MA组MDA含量增高(P0.01),SOD活力降低(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量减少(P0.01)。与正常组比较,模型组Atg3、Atg4b、Atg7蛋白表达水平明显增高(P0.05,P0.01);与模型组比较,丹参酮ⅡA+模型组Atg3、Atg7、Atg5-Atg12蛋白表达水平明显增高(P0.05,P0.01);与丹参酮ⅡA+模型组比较,丹参酮ⅡA+模型+3-MA组Atg3、Atg7、Atg5-Atg12蛋白表达水平均明显降低(P0.05,P0.01)。结论丹参酮ⅡA可能通过调节EA.hy926细胞自噬小体形成信号通路即Atg12-Atg5通路和LC3-PE通路相关蛋白,发挥其保护EA.hy926细胞抗氧化应激损伤的生物学活性,进而防治动脉粥样硬化的发生发展。     

法舒地尔对压力超负荷大鼠心肌肝细胞生长因子表达的影响

目的:观察法舒地尔对压力超负荷大鼠心肌肝细胞生长因子(HGF)表达的影响,探讨法舒地尔防治心肌纤维化的作用机制。方法:采用腹主动脉缩窄法建立压力超负荷心肌纤维化大鼠模型。假手术组(n=8)仅分离但不予结扎腹主动脉。术后4周末,将手术组存活的28只大鼠随机分为模型组(n=10)、法舒地尔高剂量组(FH组,n=9)和法舒地尔低剂量组(FL组,n=9)。药物干预4周后,计算大鼠心脏质量指数(HMI)和左心室质量指数(LVMI)。观察心肌病理学改变,测量胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原容积分数(PCVF)。免疫组织化学法分析心肌α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶蛋白亚基1(p-MYPT1)、HGF和转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达。结果:FH和FL组较模型组HMI、LVMI、CVF、PCVF及α-SMA、p-MYPT1、TGF-β1的平均光密度值明显降低,HGF的平均光密度值明显升高(P均0.05),且FH组与FL组相比作用更明显。结论:法舒地尔改善压力超负荷大鼠心肌纤维化的作用可能与促进HGF的表达有关。     

糖原合酶激酶-3β及DVL-1在大鼠心肌重塑中的表达

目的观察大鼠心肌重塑过程中心肌成纤维细胞DVL-1蛋白及糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)蛋白表达变化.方法采用颈静脉输注去甲肾上腺素(NE)方法复制大鼠心肌重塑病理模型,用超声检测心脏结构和收缩功能.应用Western blot技术检测大鼠心肌成纤维细胞GSK-3β及DVL-1蛋白质的表达水平.结果与对照组比较,实验组大鼠左心室心肌Ⅰ/Ⅲ胶原蛋白比值(6.2±1.5 vs 2.3±0.7)明显升高(P＜0.01);实验组左心室成纤维细胞GSK-3β蛋白表达水平(0.48±0.03,1.4±0.2)显著降低(P＜0.01);实验组DVL-1蛋白质的表达水平(4.3±0.3 vs 1.2±0.2),显著升高(P＜0.01).结论 NE致大鼠心肌重塑过程中GSK-3β蛋白表达显著降低,DVL-1蛋白表达显著升高,可能与心肌纤维化有关.     

肉桂醛对高糖心肌成纤维细胞增殖及胶原蛋白的影响和机制

目的研究肉桂醛对高糖诱导心肌成纤维细胞增殖,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白分泌的影响及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路的作用。方法体外培养新生大鼠心肌成纤维细胞,MTT检测肉桂醛对高糖环境下细胞增殖的影响;ELISA检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达;RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达;Western blot检测ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达。结果与对照组比较,高糖组成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白表达增加(P0.05)。与高糖组比较,肉桂醛组心肌成纤维细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达降低[(3.14±0.12)vs(2.01±0.08),P0.05)]。结论肉桂醛能抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的增加,其作用可能与下调ERK1/2活性有关。     

贝尼地平对糖尿病大鼠肾脏保护作用的机制探讨

目的 观察贝尼地平对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞间充质转分化的影响并探讨其机制.方法 54只180～200 g雄性Wistar大鼠采用随机数字表法分为正常对照组(8只)、糖尿病肾病造模组(46只),糖尿病肾病组空腹12 h后一次性腹腔内注射链脲佐菌素(60mg/kg),对照组注射等量生理盐水.将37只造模成功的大鼠用随机数字表法分为3组,其中糖尿病组(13只),法舒地尔组(12只,10 mg·kg-1·d-1腹腔注射),贝尼地平组(12只,3 mg·kg-1·d-1灌胃).治疗3个月后处死,HE染色观察肾脏病理变化,免疫组织化学观察肾脏皮质Rho激酶1(ROCK1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮型-钙黏附蛋白(E-cadherin)的变化;Western Blot法观察肾皮质肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1(p-MYPT1)、ROCK1、α-SMA、E-cadherin的变化;实时PCR观察ROCK1的mRNA变化.采用单因素方差分析及SNK或LSD检验进行统计学分析.结果 正常对照组、糖尿病组、贝尼地平组大鼠肾皮质内ROCK1蛋白表达分别为0.39(0.23～0.55)、0.93(0.64～1.28)、0.61(0.52～0.90),p-MYPT1、α-SMA蛋白表达糖尿病组增强、贝尼地平组减弱,差异有统计学意义(F值分别为7.37和125.26,均P＜0.01),E-cadherin蛋白的表达分别为0.95±0.27,0.25±0.09,0.44±0.10,差异有统计学意义(F=28.15,P＜0.05),ROCK1 mRNA的表达分别为4.4±2.2,23.3±7.0,15.9±3.4,差异有统计学意义(F=18.47,P＜0.01).结论 贝尼地平可能通过抑制ROCK活性减轻糖尿病鼠肾小管上皮细胞间充质转分化和肾间质纤维化.     

慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠皮层ROCK2、MBS表达的变化

目的 探讨Rho激酶(ROCK)2及下游底物肌球蛋白结合亚单位(MBS)在慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠皮层中的表达变化及法舒地尔对其的影响.方法 健康雄性Wistar大鼠54只,随机分为假手术组、缺血组和ROCK抑制剂(法舒地尔)组.各组再根据缺血时间分为3、6、9 w三组,每组6只.采用双侧颈总动脉永久性结扎(2VO)建立慢性脑缺血模型,Morris水迷宫检测学习记忆功能,RT-PCR和Western印迹检测ROCK2及其下游作用底物MBS的表达水平.结果 与假手术组相比,模型组和法舒地尔组大鼠逃避潜伏期和游泳路径均明显延长(P＜0.05)；缺血3 w起,大鼠皮层ROCK2、MBS表达明显增高；法舒地尔干预后,大鼠逃避潜伏期和游泳距离缩短(大鼠学习记忆成绩不同程度改善),ROCK2、MBS表达水平均有不同程度降低,与模型组相比差异显著(P＜0.05).结论 ROCK2及其下游作用底物MBS参与大鼠慢性脑缺血致认知功能障碍,脑组织存在ROCK2表达上调与功能活化,ROCK抑制剂法舒地尔能够减轻神经功能损伤,从而改善学习记忆功能.     

慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠皮层Rho激酶表达变化

目的 探讨慢性脑缺血致大鼠认知功能障碍与Rho激酶(ROCK)及作用产物α-平滑肌激动蛋白(SMA)表达变化.方法 健康雄性Wistar大鼠54只,随机分为假手术组、模型组和法舒地尔组.各组再根据缺血时间分为3、6、9 w三组,每组6只.采用2VO建立慢性脑缺血模型,Morris水迷宫检测学习记忆功能,免疫组化检测ROCK2、α-SMA表达.结果 与假手术组相比,模型组和法舒地尔组大鼠逃避潜伏期和游泳路径均明显延长(P＜0.05);缺血3 w起,缺血组大鼠皮层ROCK2、α-SMA表达明显增高,法舒地尔干预后,大鼠学习记忆成绩不同程度改善,ROCK2、α-SMA表达下降,与模型组相比差异显著(P＜0.05).结论 ROCK参与大鼠慢性脑缺血致认知功能障碍,脑组织存在ROCK表达上调与功能活化,ROCK抑制剂法舒地尔能够减轻神经功能损伤从而改善学习记忆功能.     

法舒地尔对压力超负荷大鼠心脏的肌成纤维细胞表型分化的影响

目的 Rho激酶介导的肌动蛋白细胞骨架重组在肌成纤维细胞(MFB)表型分化中具有重要作用。本实验拟观察Rho激酶抑制剂法舒地尔对压力超负荷大鼠心脏MFB表型分化的影响。方法采用腹主动脉缩窄法建立压力超负荷诱导的心肌纤维化大鼠模型。假手术组(Sham组)仅分离但不予结扎腹主动脉。术后4周末,将存活大鼠按随机数表法分为模型组(Model组)、法舒地尔高剂量组(FH组)和法舒地尔低剂量组(FL组)。药物干预4周末,观察大鼠心肌病理学改变,并检测心肌羟脯氨酸(HYP)含量,评估心肌纤维化程度;酶联免疫吸附法检测血浆和心肌血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)含量;免疫组织化学法分析心肌磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶蛋白亚基1(p-MYPT1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、骨桥蛋白(OPN)和转化生长因子β1(TGF-β1)的表达。结果 Model组大鼠心肌纤维化程度较Sham组明显加重,AngⅡ含量显著升高,p-MYPT1(0.063±0.009比0.029±0.014)、α-SMA(0.034±0.009比0.004±0.003)、OPN(0.043±0.007比0.012±0.006)和TGF-β1(0.058±0.019比0.019±0.009)的表达均明显升高(均为P<0.01);FH组和FL组大鼠心肌纤维化程度较Model组减轻,AngⅡ含量均显著下降,p-MYPT1(0.029±0.013和0.040±0.011)、α-SMA(0.016±0.006和0.027±0.007)、OPN(0.018±0.004和0.036±0.006)和TGF-β1(0.022±0.013和0.039±0.014)的表达也不同程度下降(P<0.01或P<0.05)。结论法舒地尔改善压力超负荷大鼠心肌纤维化的作用至少与部分抑制MFB表型分化有关。