铁离子对人成骨细胞(hFOB1.19)生物活性影响

目的探讨铁离子对成骨细胞株(hFOB1.19)生物活性,包括碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity,APA)、细胞凋亡、钙结节、Ⅰ型胶原(type 1 collagen,COL 1)和骨钙素(osteocalcin,OC)的影响。方法成骨细胞(hFOB1.19)于5%CO234℃培养箱内培养,将不同浓度枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)50、100、200μmol/L和去铁胺(deferoxamine,DFO)5、10、20μmol/L分别加入细胞培养基中,MTT法检测成骨细胞增生活性;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;Von kossa染色法行钙结节染色;RT-PCR和Western blotting法分别检测COL1和骨钙素(bone gla protein,BGP)的基因及蛋白表达。结果 (1)48 h后增生活性:FAC组细胞增生活性随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P0.05),DFO组在5μmol/L浓度组时促进成骨细胞增生,在10、20μmol/L浓度组时抑制成骨细胞增生。(2)10 d时碱性磷酸酶活性:FAC组碱性磷酸酶活性随FAC干预浓度的增加而降低,DFO组碱性磷酸酶活性随DFO干预浓度的增加而升高(P0.05);(3)48 h时凋亡:FAC组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高(P0.05),DFO组在5、10μmol/L浓度时抑制细胞凋亡(P0.05),在20μmol/L则促进成骨细胞凋亡(P0.05);(4)21 d时钙结节染色:FAC组随铁离子干预浓度增加,成骨细胞矿化面积、钙结节形成数量均减少,DFO组在5、10μmol/L浓度时促进成骨细胞矿化功能,而20μmol/L浓度时对成骨细胞矿化有抑制效应;(5)3 d时基因及蛋白表达:FAC组COL1、BGP基因和蛋白的表达呈剂量依赖性下调(P0.05);DFO组COLⅠ、BGP基因的表达呈剂量依赖性上调(P0.05),DFO在5、10μmol/L浓度时促进COL1、BGP蛋白表达,在20μmol/L浓度时抑制COL1、BGP蛋白表达。结论不同浓度枸橼酸铁铵均抑制成骨细胞功能活性,提示高铁环境不利于成骨细胞的成骨功能。低铁环境对成骨细胞有双重效应,低剂量去铁胺对成骨细胞活性有促进作用,而高剂量去铁胺则对成骨细胞活性有抑制效应。     

丹参酮ⅡA通过调节自噬小体对ox-LDL诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用

目的基于自噬小体形成信号通路探讨丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。方法体外培养EA.hy926细胞,随机分为正常组、模型组、丹参酮ⅡA组、丹参酮ⅡA+模型组、3-MA组、模型+3-MA组、丹参酮ⅡA+模型+3-MA组。比色法检测各组细胞氧化应激损伤丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力,Western blot技术检测细胞自噬小体形成信号通路相关蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组MDA含量增高(P0.01),SOD活力降低(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量增多(P0.01);3-MA组LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量无明显变化(P0.05)。与模型组比较,丹参酮ⅡA+模型组细胞中MDA含量降低(P0.01),SOD活力增高(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量增多(P0.01);模型+3-MA组MDA含量增高(P0.01),SOD活力降低(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量减少(P0.01)。与丹参酮ⅡA+模型组比较,丹参酮ⅡA+模型+3-MA组MDA含量增高(P0.01),SOD活力降低(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量减少(P0.01)。与正常组比较,模型组Atg3、Atg4b、Atg7蛋白表达水平明显增高(P0.05,P0.01);与模型组比较,丹参酮ⅡA+模型组Atg3、Atg7、Atg5-Atg12蛋白表达水平明显增高(P0.05,P0.01);与丹参酮ⅡA+模型组比较,丹参酮ⅡA+模型+3-MA组Atg3、Atg7、Atg5-Atg12蛋白表达水平均明显降低(P0.05,P0.01)。结论丹参酮ⅡA可能通过调节EA.hy926细胞自噬小体形成信号通路即Atg12-Atg5通路和LC3-PE通路相关蛋白,发挥其保护EA.hy926细胞抗氧化应激损伤的生物学活性,进而防治动脉粥样硬化的发生发展。     

抑制自噬对缺氧复氧后H9c2心肌细胞损伤及线粒体Cx43变化的影响

目的研究缺氧复氧(HR)后,抑制自噬对H9c2心肌细胞损伤的影响,同时观察线粒体Cx43含量及磷酸化水平的变化,探讨抑制自噬对HR心肌损伤的影响及可能机制。方法通过缺氧12h、复氧12h建立H9c2心肌细胞HR模型。随机将H9c2心肌细胞分为5组:对照组、HR组、格尔德霉素(GA)组、3甲基腺嘌呤(3-MA)组、GA+3-MA组。分别测定各组细胞活力、线粒体膜电位以及人卷曲螺旋-肌球蛋白样BCL2结合蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白轻链3B(LC3B)、线粒体Cx43、线粒体磷酸化Cx43蛋白水平和自噬体含量。结果与对照组比较,HR组漂浮的死亡细胞增多、存活心肌细胞密度减少,细胞存活率和活力、线粒体膜电位下降,乳酸脱氢酶水平升高(P0.05)。与HR组比较,GA组、3-MA组和GA+3-MA组线粒体膜电位、细胞活力均下降(P0.05);GA+3-MA组线粒体膜电位、细胞活力均分别低于GA组和3-MA组(P0.05)。与对照组相比,HR组自噬体增多、自噬相关蛋白Beclin-1水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ均升高(P0.05);与HR组比较,GA组、3-MA组和GA+3-MA组自噬体减少、Beclin-1水平GA、LC3BⅡ/LC3BⅠ均下降(P0.05);GA+3-MA组Beclin-1水平、LC3BⅡ/LC3BⅠ均分别低于GA组和3-MA组(P0.05)。与对照组比较,HR组线粒体Cx43及磷酸化Cx43蛋白均下降(P0.05);GA组和GA+3-MA组线粒体Cx43蛋白低于HR组(P0.05);GA组、3-MA组和GA+3-MA组线粒体磷酸化Cx43蛋白低于HR组(P0.05);GA+3-MA组线粒体磷酸化Cx43蛋白分别低于GA组和3-MA组(0.18±0.04 vs 0.27±0.06,0.33±0.05,P0.05)。结论 HR导致线粒体Cx43含量及磷酸化水平下降,心肌细胞出现缺血再灌注损伤,同时自噬激活。而抑制自噬,使HR后线粒体Cx43脱磷酸化加剧,进一步加重HR心肌细胞损伤。     

RhoA激酶信号通路介导的自噬障碍在2型糖尿病大鼠心肌纤维化中的作用

目的探索RhoA激酶信号通路介导的自噬障碍在2型糖尿病大鼠(T2DM)心肌纤维化中的作用。方法将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、法舒地尔组(10 mg/kg/d)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(15 mg/kg/d)和法舒地尔+3-MA组各12只。除对照组的所有大鼠均采用高脂饮食法联合小剂量链脲佐菌素诱导T2DM大鼠模型,均给予相应药物干预4周。RT-PCR检测心肌组织ROCK1、ROCK2、PCⅠ、PCⅢmRNA的表达;Western Blot检测心肌组织肌球蛋白磷酸酶靶向蛋白1(MYPT1)、p-MYPT1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62、UNC-51样激酶1(ULK1)、p-ULK1的表达;MTT法检测心肌成纤维细胞的增殖;ELISA和RT-PCR检测成纤维细胞培养液和细胞内PCⅠ和PCⅢ水平。结果与模型组相比,法舒地尔组大鼠成纤维细胞的增殖活性明显降低(P0.05),ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢmRNA的表达均明显上调(P0.05),p-MYPT1/MYPT1和p62的表达明显下调(P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1和p-ULK1/ULK1的表达明显上调(P0.05),成纤维细胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明显下降(P0.05);与法舒地尔组相比,法舒地尔+3-MA组大鼠成纤维细胞的增殖活性明显增加(P0.05),ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢmRNA的表达均明显下调(P0.05),p-MYPT1/MYPT1和p62的表达均明显上调(P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1和p-ULK1/ULK1的表达均明显下调(P0.05),成纤维细胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明显升高(P0.05)。结论 RhoA激酶信号通路介导的自噬障碍可以诱导T2DM大鼠的心肌组织纤维化。     

YB-1抑制三氧化二砷诱导的胃癌细胞自噬机制

目的研究YB-1抑制三氧化二砷(As2O3)诱导人胃癌BGC-823细胞自噬的机制。方法采用脂质体转染siRNA干扰YB-1和腺病毒转染pAd1Easy/YB-1过表达YB-1;实时荧光定量PCR检测Bcl-2和Beclin1基因转录;Western blot检测YB-1、Bcl-2、Beclin1、P62和LC3Ⅱ蛋白的表达;MDC染色、荧光显微镜观察自噬泡。结果与空病毒(AdGFP)组相比,pAd1Easy/YB-1(AdYB-1)组Bcl-2基因表达增高,而干扰质粒(siYB-1)组Bcl-2基因表达水平较空质粒(HK)组降低(P均<0.05),各组Beclin1基因表达比较无统计学差异。与AdGFP和HK组相比,AdYB-1组Beclin1和LC3Ⅱ蛋白减少,Bcl-2和P62蛋白增加(P均<0.01),siYB-1组Beclin1和LC3Ⅱ蛋白增加,Bcl-2和P62蛋白减少(P均<0.01)。与AdGFP组相比,AdYB-1组自噬泡聚集减少,加入Bcl-2抑制剂HA14-1后自噬泡重新聚集,Beclin1蛋白恢复表达,P62降解增加,LC3Ⅱ升高。结论 YB-1可能通过上调Bcl-2、抑制Bec-lin1,实现对As2O3诱导的BGC-823细胞自噬的抑制。     

鹿红方对氧糖剥夺模型心脏干细胞自噬和抗凋亡能力的影响

目的探讨鹿红方(LHF)对氧糖剥夺模型心脏干细胞(CSCs)自噬和抗凋亡能力的影响。方法将CSCs随机分为对照组(正常培养)与氧糖剥夺造模组(缺血缺氧)。将造模组分为模型组(不予有效干预措施)、自噬阻断到(3-MA)组(给予自噬阻断剂)、鹿红方200μg/mL组(给予LHF200μg/mL)和LHF200+3-MA组(给予LHF200μg/mL+自噬阻断剂)。各组给予相应干预措施后光镜下观察细胞形态,并采用CCK-8法测定细胞凋亡情况;WesternBlot检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达;RT-PCR检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-ⅡmRNA的表达。结果光镜下观察可见:LHF200组较模型组和3-MA组凋亡细胞显著减少,LHF200+3-MA组与LHF200组比较,细胞凋亡增加;CCK-8结果显示:LHF200组与模型组比较,CSCs活细胞OD值显著增高(P=0.006);LHF+3-MA组与LHF200组比较,CSCs活细胞OD值下降(P=0.03);WesternBlot结果显示:LHF200组Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达较模型组显著降低(P<0.001),但显著高于3-MA组和LHF200+3-MA组(P<0.001);RT-PCR结果显示:LHF200组Beclin-1和LC3-ⅡmRNA表达较模型组显著降低(P<0.001),但显著高于3-MA组和LHF200+3-MA组(P<0.001)。结论LHF可提高氧糖剥夺模型CSCs的抗凋亡能力,其机制与调节自噬有关。     

细胞自噬在激素性股骨头缺血坏死大鼠发病中的作用

目的 探索细胞自噬在激素性股骨头缺血坏死(SANFH)大鼠发病机制中的作用。方法 24只无特定病原体(SPF级)SD大鼠(雄鼠各半),随机抽样分为：正常(C)组、模型(T1)组、自噬阻断(T2)组、自噬激动(T3)组,每组雌、雄各3只。C组给予生理盐水,T1、T2、T3组分别给予甲泼尼龙、甲泼尼龙+3-甲基腺嘌呤(MA)、甲泼尼龙+雷帕霉素。8 w后处死,取后肢股骨头并测量坏死面积,采用免疫组化、Western印迹检测坏死股骨头组织中微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ、自噬效应蛋白(Beclin)1及p62蛋白的表达情况。结果 T1、T2、T3组经甲泼尼龙干预8 w后,至少一侧股骨头坏死率分别为83.33%、16.67%、100.00%,T1、T2、T3组与C组比较均具有统计学差异(均P<0.05),且T1组、T3组股骨头坏死面积均显著大于C组和T2组(均P<0.05)。免疫组化染色和Western印迹检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1、p62蛋白结果显示,T1、T3组股骨头组织中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的表达量显著高于C组、T2组(均P<0.05),但p62...     

HBV rtA181T突变对Huh7细胞自噬的影响

目的探讨HBV逆转录酶区A181T(rtA181T)位点突变对Huh7细胞自噬的影响。方法 Huh7细胞分别转染1.3mer HBV野生型质粒(WT组)、1.3mer HBV rtA181T突变型质粒(181T组)及1∶1共转WT和rtA181T突变型质粒(WT+181T组)。Western Blot、免疫荧光检测细胞内HBV表面蛋白(HBs)表达水平,ELISA检测细胞外HBs Ag表达水平;Western Blot分析内源性自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)及P62表达水平,Real-time PCR检测自噬相关基因Atg5 mRNA、Beclin1 mRNA的转录水平;同时转染绿色荧光蛋白LC3后,免疫荧光检测自噬颗粒。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果免疫荧光观察181T组、WT组及WT+181T组细胞内均有HBs表达,Western Blot结果显示181T组细胞内的HBs表达高于WT组和WT+181T组。ELISA检测3组细胞培养上清的HBs Ag水平差异有统计学意义(F=66.739,P0.001),其中181T组细胞外的HBs Ag水平(0.111±0.056)远远低于WT组(3.157±0.490)和WT+181T组(2.240±0.797)(P值均0.001);WT组、181T组和WT+181T组均可见LC3-Ⅱ自噬颗粒聚集,181T组LC3-Ⅱ表达水平高于WT组和WT+181T组,而P62水平低于WT组和WT+181T组,差异均有统计学意义(P值均0.05);181T组自噬相关基因Atg5 mRNA、Beclin1 mRNA转录水平均明显高于WT组和WT+181T组(P值均0.05)。结论 HBV rtA181T突变可导致HBs Ag分泌障碍,并增加Huh7细胞的自噬水平。     

免疫相关GTP酶1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控巨噬细胞自噬

目的 探讨免疫相关GTP酶1(IRGM1)调控PI3K/AKT/mTOR通路对巨噬细胞自噬活动的影响。方法 小鼠RAW264.7细胞常规传代培养,siRNA-IRGM1序列通过Lipofectamine 2000转染RAW264.7细胞制备siRNA-RAW246.7细胞;利用脂多糖(LPS, 20 ug/mL)诱导RAW246.7构建细胞自噬模型,分为四组：RAW246.7组,siRNA-RAW246.7组,RAW246.7+LPS组,siRNA-RAW246.7+LPS组;Western blot检测各组IRGM1及自噬相关分析分子(LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62)、AKT及mTOR磷酸化水平;qRT-PCR检测各组IRGM1及P62表达水平;利用流式细胞学比较各组细胞调亡率和ELISA检测各组IL-6炎症因子表达情况。结果 Western blot结果显示：与RAW246.7组、siRNA-RAW246.7组比较,LPS诱导巨噬细胞(RAW246.7+LPS组、siRNA-RAW246.7+LPS组)自噬相关基因LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例蛋白表达升高(P<0.05),P62表达明显...     

小檗碱通过腺苷酸活化蛋白激酶、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α调节自噬减轻高糖环境下足细胞损伤的机制研究

目的探讨小檗碱(Ber)对高糖诱导的足细胞损伤保护作用及其机制研究。方法将小鼠永生系足细胞(MPC-5)分为正常浓度葡萄糖(Con)组、高糖(HG)组、Ber干预(Ber)组、雷帕霉素(Rap)干预组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预组、高糖+Ber(HG+Ber)干预组、高糖+雷帕霉素(HG+Rap)干预组。采用CCK-8法分析细胞存活率。Western blot检测MPC-5细胞自噬相关蛋白、自噬相关蛋白、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC1-α)蛋白的等表达。荧光显微镜观察自噬标记物(LC3-Ⅱ)在MPC-5细胞中的表达。结果与Con组比较,HG、3-MA组足细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低(P0.05),Ber、Rap组表达升高(P0.05),HG组足细胞特异性标记物(Nephrin、Podocin)表达降低(P0.05),足细胞损伤标记物(Desmin)表达升高(P0.05),Ber、Rap组足细胞AMPK、PGC1-α蛋白表达升高(P0.05)。与HG组比较,HG+Ber、HG+Rap组Nephrin、Podocin表达升高(P0.01),Desmin表达降低(P0.01)。在正常对照siRNA中,与Con组比较,Ber、Rap组足细胞TRITC-LC3Ⅱ标记的自噬通量明显增加(P0.05)。在AMPK抑制剂中,与Con组比较,Ber、Rap组足细胞TRITC-LC3Ⅱ标记的自噬体量降低(P0.05)。结论 Ber可通过调控自噬活性保护高糖诱导的MPC-5细胞损伤,其过程可能通过AMPK/PGC-1α途径实现。     

自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在进展期胰腺癌中的表达及临床意义

目的:探讨自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在进展期胰腺癌组织中的表达及临床意义.方法:应用免疫组织化学法检测64例胰腺癌组织及相应癌旁正常组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62的表达情况;分析自噬蛋白表达水平与胰腺癌临床病理特征的关系.结果:免疫组织化学法检测提示Beclin1蛋白在胰腺癌组织及癌旁正常组织中阳性表达率分别为28.1%(18/64)、90.6%(58/64),LC3蛋白阳性表达率分别为34.4%(22/64)、75%(48/64)P 6 2蛋白表达阳性率分别为7 5%(4 8/6 4)、4 6.9%(3 0/6 4),均P0.0 5;胰腺癌组织中Beclin1与LC3的表达水平呈正相关(r=0.572P0.05),Beclin1、LC3的表达与肿瘤分化、TNM分期相关(P0.05),Beclin1、LC3和P62的表达均与性别、年龄、有无门脉浸润、淋巴结转移无明显相关(P0.05).结论:自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在胰腺癌组织中的异常表达及Beclin 1与LC3两者表达呈正相关提示自噬活动下降可能参与了进展期胰腺癌的发展.     

环磷腺苷葡胺诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化后对自噬的影响及机制

目的:探讨环磷腺苷葡胺(MCA)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌细胞分化后对自噬的影响及作用机制。方法:通过全骨髓培养法建立体外培养体系,取P3代细胞通过流式细胞仪鉴定细胞表面抗原的表达。将细胞分为3组:正常组、MCA组、5氮胞苷(5-Aza)组,采用western blotting检测心肌特异蛋白表达情况。将诱导后的心肌细胞通过葡萄糖剥夺(GD)建立细胞损伤模型,收集3h、12h、24h细胞,Western blotting法检测自噬蛋白的表达情况。将细胞分为5组:正常组、GD组、MCA预处理组(M+G组)、LY294002+MCA预处理组(M+G+L组)、LY294002组(L组)。利用Western-blotting法检测各组自噬蛋白及相关信号通路蛋白的表达情况。结果:1P3代细胞表面抗原CD44、CD90、CD45的阳性率完全符合BMSCs的标准;2MCA组Ctnt、Cx43蛋白的相对表达量明显高于5-Aza组(P0.01);3GD处理3h后自噬蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显升高(P0.01);4经MCA预处理后自噬蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降(P0.01),提高了PI3K的活性,上调了AKT、mTOR磷酸化水平(P0.01),加入阻断剂后通路蛋白水平下降。结论:MCA可以诱导BMSCs向心肌细胞分化,并在一定程度上抑制了诱导后心肌细胞的自噬,其机制可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关。     

基于细胞自噬机制探讨祛风生脉颗粒保护血管内皮的研究

目的基于细胞自噬机制探讨祛风生脉颗粒保护血管内皮的干预效应。方法将缺血心肌微血管内皮细胞(CMECs)分为4组:缺血(QX)组、缺血+雷帕霉素(QX+RAPA)组、缺血+3-甲基腺嘌呤(QX+3-MA)组、缺血+祛风生脉颗粒含药血清(QX+QF)组;另设正常CMECs,作为正常(ZC)组。其中ZC组和QX组给予常规培养基培养,QX+RAPA组和QX+3-MA组在常规培养基基础上分别加入雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤,QX+QF组给予祛风生脉颗粒大鼠含药血清与缺血CMECs共孵育。电镜观察各组细胞自噬小体及超微结构变化,Western-blot分析微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3)-Ⅱ/Ⅰ比值;Annexin V-FITC和PI双标记法测定细胞凋亡,酶联免疫吸附法测定细胞培养液中一氧化氮(NO)与内皮素-1(ET-1)含量。结果 QX组在电镜下观察到有自噬小体形成,与ZC组相比,QX组LC3–Ⅱ/Ⅰ比值升高,细胞总凋亡率增加(P0.05),NO水平升高,ET-1水平升高(P0.01);与QX组相比,QX+RAPA组自噬小体数目有所增多,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值升高,细胞总凋亡率减少,NO水平下降(P0.05),ET-1水平有所降低,差异无统计学意义(P0.05);与QX组相比,QX+3-MA组自噬小体数目减少,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值降低,细胞总凋亡率增加,NO水平升高,ET-1水平升高(P0.05);与QX组相比,QX+QF组电镜下观察到自噬小体数目明显增多,同时观察到较多的自噬溶酶体,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,细胞总凋亡率明显减少,NO水平明显降低,ET-1水平降低(P0.01)。结论缺血能够诱导CMECs发生自噬,细胞凋亡增加,血管内皮功能受到损伤,祛风生脉颗粒干预后能够明显减少凋亡,改善CMECs功能,其机制可能与促进缺血CMECs自噬有关。     

miR-34a对膀胱尿路上皮癌细胞Beclin1介导的自噬及吉西他滨化疗敏感性的影响

目的 探讨miR-34a对膀胱尿路上皮癌细胞J82中Beclin1介导的自噬及吉西他滨化疗敏感性的影响。方法 研究前期通过吉西他滨诱导,建立J82耐吉西他滨细胞系(J82/Gem),实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测J82细胞和J82/Gem细胞中miR-34a的表达;将J82/Gem细胞随机分为J82/Gem组(未转染)和转染组(miR-34a NC组、miR-34a mimics组),另取J82细胞(J82组),各组均使用含0.5μg/ml的吉西他滨培养24 h。CCK-8法检测各组增殖能力和吉西他滨的半数抑制浓度(IC50);流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察各组细胞自噬小体,计算细胞自噬率;Western印迹检测各组细胞中自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白轻链(LC)3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62表达水平。结果 与J82组相比,J82/Gem组和miR-34a NC组细胞miR-34a表达水平、细胞凋亡率和p62蛋白表达水平显著降低,细胞增殖活性、吉西他滨IC50值、细胞自噬率、Beclin1、LC3-I、LC3-II蛋白表达水平显著...     

外源性睾酮通过诱导自噬致大鼠肾脏损伤

目的 探索外源性睾酮(TP)致大鼠肾脏损伤的作用及可能机制.方法 SD雄性大鼠48只,随机分为6组(每组8只):control组、TP组、TP+氯喹(CQ)组、TP+甘草甜素(Gly)组、CQ(自噬抑制剂)组、Gly〔高迁移率族蛋白(HMG)B1抑制剂〕组.各组大鼠处理21 d后,测量其体重、肾脏湿重、计算肾脏指数;苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肾脏组织病理形态学变化;免疫组化法和Western印迹印迹法分析大鼠肾脏组织自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin1、P62、HMGB1的定位和表达情况.结果 与control组比较,TP组大鼠肾脏湿重、肾脏指数无明显变化(P>0.05);肾小球毛细血管襻多呈分叶状改变,肾小囊间隙变窄,肾小管上皮细胞水肿,管腔变窄;肾脏组织LC3B-Ⅱ、Beclin1和HMGB1蛋白表达水平上调(P<0.05),联合给予TP与CQ后,仅见少数肾小体血管球呈分叶状改变,肾小管水肿明显减轻;Beclin1、LC3B-Ⅱ和HMGB1蛋白表达水平均下调(P<0.05);TP+Gly组大鼠肾脏组织病理学改变及自噬相关蛋白表达水平结果 与TP+CQ组类似.结论 外源性TP可能通过上调细胞自噬致大鼠肾脏组织损伤的发生,HMGB1可能参与此过程自噬水平的调节.     

大鼠脊髓损伤后自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达的变化

目的探讨大鼠脊髓损伤(SCI)后自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达变化对自噬发生的影响。方法构建大鼠脊髓横断损伤模型,分别于损伤后0、4、12 h及1、3、5、7 d通过BBB评分评定SCI大鼠的行为学变化,同时经Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达;并通过腹腔注射自噬抑制剂3-MA和自噬促进剂Rapamycin于SCI小鼠模型,分别于上述时间点通过Western印迹进行Beclin1、LC3的检测,初步探讨自噬抑制剂和自噬促进剂在SCI后对自噬相关蛋白表达变化的作用。结果随着大鼠SCI时间的延长,运动逐渐消失,SCI后3 d大鼠出现无运动现象,之后随着大鼠SCI时间的延长行为逐渐恢复;自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达量随着SCI时间的延长逐渐升高,于3 d左右表达量显著升高(P<0.01)达到峰值;随后其表达量随SCI时间的延长呈现下降的趋势;Rapamycin作用大鼠后Beclin1和LC3的表达量与对照组相比显著增高,于3 d达到极显著水平(P<0.001);3-MA作用大鼠后Beclin1和LC3的表达量与对照组相比显著降低(P<0.001)。结论 Rapamycin能够促进SCI后自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达,最终引发自噬的发生,而3-MA能够抑制Beclin1和LC3的表达,阻止SCI后自噬现象的发生。     

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子通过Toll样受体－4信号通路调节巨噬细胞自噬水平

目的探讨细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)是否通过Toll样受体-4(TLR4)通路调节巨噬细胞自噬水平。方法用终浓度为5ng/ml的佛波酯(PMA)诱导人单核细胞白血病细胞系(THP-1)THP-1单核细胞48h,采用分化成功的巨噬细胞进行实验。实验分为空白对照组、EMMPRIN组和TAK-242组。蛋白印迹法检测各组TLR4、核因子-κB(NF-κB)、LC3-Ⅱ、Beclin1及P62蛋白表达水平;免疫荧光检测各组LC3-Ⅱ、Beclin1及P62蛋白荧光表达情况。采用SPSS 22.0软件对数据进行处理。结果Western blot检测发现,EMMPRIN组与对照组及TAK-242组相比,TLR4、NF-κB蛋白表达水平均升高(均P<0.05),LC3-Ⅱ蛋白表达水平均升高(P<0.05),Beclin1蛋白表达水平也升高[EMMPRIN组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),但仍较对照组升高;EMMPRIN组与TAK-242组比较,差异有统计学意义(P<0.05)],P62蛋白表达水平均降低(均P<0.05)。免疫荧光检测发现,EMMPRIN组与对照组及TAK-242组相比,LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白荧光表达水平明显升高(均P<0.05),P62蛋白表达水平无差异统计学意义(P>0.05)。结论EMMPRI可能通过TLR4信号通路调节人THP-1巨噬细胞过度自噬。     

TLR4介导小鼠小胶质细胞自噬在脑出血后炎症反应的作用机制研究

目的研究TLR4介导小胶质细胞自噬在脑出血后炎症反应的作用机制。方法从C57BL/6J小鼠中提取分离原代小胶质细胞,分组1中,A组:小胶质细胞;B组:小胶质细胞+阴性siRNA转染;应用C组:小胶质细胞+TLR4-siRNA转染。应用Q-PCR和Western Blot检测分组1中TLR4的表达。分组2中,D组:小胶质细胞+等量的对照溶剂(0.9%NaCl);E组:小胶质细胞+自噬抑制剂(3-MA);F组:小胶质细胞+control-siRNA+3-MA;G组:小胶质细胞+TLR4-siRNA+等量的对照溶剂(0.9%NaCl);H组:小胶质细胞+TLR4-siRNA+3-MA。Western Blot检测LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、TLR4、MyD88和核转录因子(NF-κB)蛋白表达。ELISA检测细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平。结果 (1)A组和B组TLR4 mRNA和蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);与B组相比,C组TLR4 mRNA和蛋白表达水平下调(P <0.05)。(2)D组、E组和F组TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平无明显变化(P>0.05);与D组相比,G组TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平下调(P <0.05);与F组相比,H组TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平下调(P <0.05)。E组和F组LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、TNF-α、IL-1β、IL-6水平无明显变化(P>0.05);与F组相比,H组LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降(P <0.05);与G组相比,H组LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降(P <0.05)。结论 TLR4-siRNA可抑制TLR4介导的小胶质细胞自噬,从而减轻自噬引起的脑出血炎症损伤。     

祛风生脉颗粒对大鼠缺血心肌微血管内皮细胞自噬及血管新生的影响

目的观察祛风生脉颗粒对大鼠缺血心肌微血管内皮细胞(CMECs)自噬及血管新生的影响。方法制备祛风生脉颗粒高剂量(Q-G组)、中剂量(Q-Z组)、低剂量(Q-D组)大鼠含药血清,分别与大鼠缺血CMECs共孵育,同时制备空白血清,分别与大鼠缺血CMECs(MX组)和正常大鼠CMECs(ZC组)共孵育。电镜观察各组细胞自噬小体及超微结构变化,Western-blot分析微管蛋白轻链3(LC3)–Ⅱ/Ⅰ比值及P62蛋白表达;划痕法观察细胞迁移能力,倒置相差显微镜下计数管腔形成数。结果与ZC组相比,MX组电镜下观察到自噬小体,但未见到自噬溶酶体,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值及P62蛋白表达均升高(P 0.05),细胞迁移数和管腔形成数均较ZC组降低(P 0.05);与MX组相比,Q-D组和Q-Z组电镜下观察到自噬小体增多,同时观察到较多的自噬溶酶体,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值升高,P62蛋白表达降低(P 0.05),细胞迁移数和管腔形成数均较MX组增多(P 0.05);与Q-D组和Q-Z组相比,Q-G组电镜下观察到自噬溶酶体数目进一步增多;与MX组相比,Q-G组LC3–Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,P62蛋白表达明显降低(P 0.01),细胞迁移数和成管数较MX组均显著增多(P 0.01)。结论祛风生脉颗粒能改善缺血CMECs迁移和成管能力,从而促进缺血心肌血管新生,其作用与药物剂量呈正相关,机制可能与增强缺血CMECs自噬有关。     

百里醌对HUVECs细胞凋亡的影响及其机制

目的探究百里醌降低过氧化氢引起的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞凋亡及其潜在机制。方法使用百里醌预处理HUVECs细胞后加入过氧化氢共培养1 h,使用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法测定细胞增殖能力改变;应用流式细胞仪检测百里醌预处理后加入过氧化氢共培养的HUVECs细胞凋亡情况变化;使用GFP-LC3荧光体系检测百里醌对HUVECs细胞自噬的影响;应用Western印迹法测定不同处理后HUVECs细胞Caspase-3/Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Akt/p-Akt、mTOR/p-mTOR、Beclin1、Bcl-2、β-Actin蛋白表达情况改变。结果百里醌预处理HUVECs细胞,降低由过氧化氢引起的细胞凋亡并呈现剂量依赖性(P0.05);百里醌诱导HUVECs细胞发生自噬;3-MA阻断自噬途径后百里醌对过氧化氢处理的HUVECs细胞保护作用减弱(P0.05);百里醌抑制p-Akt、p-mTOR蛋白表达,促进Beclin1和Bcl-2蛋白表达(P0.05)。结论百里醌通过抑制Akt/mTOR信号通路和上调Beclin1蛋白激活自噬,促进Bcl-2蛋白表达抑制凋亡,降低过氧化氢引起的HUVECs细胞凋亡,为动脉粥样硬化的防治提供新思路。