慢病毒载体靶向介导p66shc基因沉默

目的：构建p66shc基因重组慢病毒表达载体,并将之转染至293T细胞,通过RNA干扰致使p66shc基因沉默,为进一步研究p66shc基因功能奠定基础。方法筛选3个RNA靶点,命名为p66shc‐shc1、p66shc‐shc2、p66shc‐shc3,与双酶切后的pLenR‐绿色荧光蛋白（GPH）（含有GFP表达）连接,转化入感受态的DH5α细胞,挑取阳性克隆测序正确后,与pRsv‐REV、pM‐Dlg‐pRRE、pMD2G一起转染293T细胞,于倒置荧光显微镜下检测GFP的表达,证实病毒包装成功。使用荧光定量PCR及Westernblot技术检测p66shc在基因及蛋白水平的表达,选取有效沉默p66shc基因的p66shc‐shc1靶点,为后续试验做准备。结果成功构建表达p66shc的shRNA慢病毒载体并转染至真核生物细胞内,通过荧光定量PCR及Westernblot技术检测其通过RNA干扰导致细胞内p66shc基因沉默。结论靶向表达p66shc的shRNA慢病毒载体,转染入真核生物细胞内可通过RNA干扰在分子及蛋白水平导致p66shc基因沉默。     

衔接蛋白p66shc在雌激素抑制AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡中的作用

目的 探讨衔接蛋白p66shc在血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)诱导的心肌细胞凋亡中的作用及雌激素的干预影响。方法 原代培养SD乳鼠心肌细胞,将心肌细胞分为5组:正常对照组、10-11 mol/L AngⅡ组、10－9 mol/L AngⅡ组、10－7 mol/L AngⅡ组、10－7 mol/L AngⅡ+雌二醇组;经药物干预后应用MTT法测定细胞存活率、流式细胞仪测定活性氧含量和细胞凋亡率、荧光酶标仪检测线粒体膜电位水平、Western blot检测p66shc和磷酸化(p-p66shc)蛋白的表达水平。结果 随着AngⅡ浓度的升高,心肌细胞存活率和线粒体膜电位水平逐渐下降,而细胞内活性氧含量和凋亡率逐渐升高 （P<0.05）;且雌激素预处理可减轻AngⅡ对心肌细胞的损伤 （P<0.05）。AngⅡ可使心肌细胞内p-p66shc和线粒体内的p66shc的表达呈剂量依赖性升高 （P<0.05）,雌激素预处理可减弱AngⅡ对细胞内p-p66shc和线粒体内p66shc表达水平的影响 （P<0.05）。结论 p66shc参与了AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡反应,且雌激素可通过下调线粒体内p66shc的表达而减轻AngⅡ对心肌细胞的损伤。     

外源性内皮素-1对兔骨髓间质干细胞诱导的心肌样细胞中GATA-4转录因子磷酸化的影响

目的 研究外源性内皮素-1(ET-1)对经5-氮胞苷体外诱导免骨髓间质于细胞分化的心肌样细胞转录因子GATA-4磷酸化的影响。方法 取幼年兔股骨干骨髓基质细胞经5-氮胞苷诱导分化为心肌样细胞，分别加入不同浓度(10、30、50nmol／L)的外源性ET-1，Western—blot分析心肌细胞GATA-4转录因子的蛋白表达及其磷酸化的改变。结果 分化的心肌样细胞可表达心肌细胞特异性GNTA-4转录因子；外源性ET-1不影响GATA-4蛋白表达，但可快速诱导GATA-4转录因子的磷酸化；其中，30nmol／L ET-1时GATA-4转录因子磷酸化的程度最高。结论 ET-1可介导5-氮胞苷诱导兔骨髓间质干细胞分化的心肌样细胞GNTA-4转录因子的磷酸化而影响其活性。     

胰岛β细胞转录因子FoxO1的研究进展

转录因子FoxO1是叉头家族O的亚族成员之一,是胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路中的关键分子。FoxO1蛋白主要有磷酸化、乙酰化和泛素化3种不同形式的共价修饰,这3种修饰方式在调节FoxO1蛋白分子转录活性和信号转导过程中发挥着重要的作用。FoxO1在胰岛β细胞中表达丰富,与其生长增殖、凋亡、分化、应对氧化应激等密切相关。FoxO1作为胰岛β细胞中特异的转录因子,研究其在β细胞中的表达及作用,将为糖尿病的预防和诊治带来新的契机。     

致密斑细胞COX-2的表达及AP-1、NFKB信号通路

目的评估低盐（LS）培养对小鼠致密斑（MMDD1）细胞环氧化酶-2（COX-2）表达及核因子-kB（NF-kB）和活化蛋白-1（AP-1）活性的影响。方法经脂质体转染含NF-kB或AP-1的报告质粒,采用瞬时表达方法检测正常盐（NS）与LS培养对NF-kB和AP-1转录活性的影响。采用RT-PCR检测MMDD1细胞COX-2表达的变化,Western blot方法检测细胞内P-p38MAPK、p-p44／42、c-Jun、c-Fos和COX-2蛋白的表达。结果LS培养促进了MMDD1细胞COX-2mRNA和蛋白表达（P〈0．01）。LS培养后,p38和p44／42的磷酸化程度显著上调（P〈0．01）,180min后达到高峰。p38抑制剂SB-203580、p44／42抑制剂PD-98059可降低LS诱导的COX-2表达（P〈0．01）。LS培养促进了c-Jun、c-Fos蛋白表达（P〈0．01）,激活了AP-1和NF-kB的转录活性（P〈0．01）。25umol／L NF-kB抑制剂PDTC和20umol／L AP-1抑制剂curcumin下调了LS诱导的NF-kB、AP-1活性（P〈0．01）。25umol／L PDTC、20umol／L curcumin降低了LS诱导的COX-2mRNA和蛋白表达（P〈0．01）。结论LS培养可促进MMDD1细胞COX-2的表达,其作用可能与促进p38MAPK、p44／42激酶的磷酸化,增加NF-kB和AP-1的活性有关。     

FoxO1在糖脂代谢机制中的研究进展

FoxO1是叉头转录家族O亚族的一类代谢性调节因子，通过磷酸化、乙酰化、泛素化修饰等方式调控多种基因的表达。FoxO1可以结合于PDX-1基因的启动子上，通过抑制其转录活性，抑制胰岛β细胞增殖、增加其去分化并促进其凋亡。同时，FoxO1还可以促进糖异生G6Pase和PEPCK基因的表达，增加胰岛素抵抗。此外，FoxO1还可以通过介导PPARγ转录而抑制脂肪发生，促进ApoC-Ⅲ的表达，升高血浆TG水平。FoxO1通路障碍可导致一些代谢性疾病的发生，包括糖尿病、肥胖和脂代谢紊乱等。本文就FoxO1对胰岛β细胞功能、胰岛素抵抗、肝脏葡萄糖生成及脂质代谢的影响进行综述。     

AP-1在转录水平调控氧化低密度脂蛋白诱导的转化生长因子-β1表达(摘要)

目的 了解转录激活蛋白-1(AP-1)是否参与调控氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的表达，探讨Ox-LDL激活AP-1可能的信号转导途径。方法 首先利用SD大鼠TGF-β1启动子缺失体-荧光素酶(1uciferase)报告基因瞬时转染系细胞并检测虫荧光素酶相对活性，找出可能的应答区域；然后对AP-1结合位点进行突变并加入c-Jun／AP-1抑制剂，比较启动子活性的变化情况。利用Western印迹检测Ox-LDL对系膜细胞p38有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)总蛋白和磷酸化水平的影响。最后，用凝胶阻滞法(EMSA)观察在特异性蛋白激酶抑制剂处理下的AP-1活性的变化。结果对Ox-LDL刺激应答，TGF-β1启动子-1550到-845之间是一个正调控区域，-629到-422之间则是一个负调控区。AP-1结合位点突变和c-Jun／AP-1抑制剂均导致TGF-β1启动子活性显著降低。在Ox-LDL刺激下p38 mPAK表现出的不是量的变化，而是其磷酸化水平的增加。PKC抑制剂明显地抑制了Ox-LDL诱导的AP-1活性；与之相反，p38 MPAK抑制剂则对AP-1活性无显著影响。结论 在大鼠肾系膜细胞，AP-1在转录水平参与调控Ox-LDL诱导TGF-β1表达的过程，且Ox-LDL可能部分是通过PKC信号转导途径激活AP-1中的c-Jun蛋白，再由c-Jun／AP-1从转录水平上调TGF-β1的表达。     

H2O2对平滑肌细胞凋亡及p38MAPK活性的影响

目的：了解H2O2对兔血管平滑肌细胞（VSMC）p38蛋白激酶（p38MAPK)磷酸化的影响及其与细胞凋亡的关系。方法：取兔主动脉血管平浮雕肌细胞培养，加或不加H2O2孵育，用四甲基偶氮唑盐微量酶反应（MTT）法检测平滑肌细胞活性。以Western杂交检测p38MAPK磷酸化。结果：（1）随着H2O2浓度增加，VSMC活性呈剂量依赖性降低；（2）磷酸化p38MAPK的表达随H2O2浓度的增高而增加，且磷酸化的p38MAPK在H2O2作用后15min时达到峰值。（3）加用特异性的p38MAPK抑制剂SB203580后可显著降低p38MAPK的活化，并能逆转H2O2诱导细胞凋亡的作用。结论：H2O2通过激活p38MAPK而使平滑肌细胞凋亡增加，这也许是糖尿病患者更易患心血管疾病的原因之一。     

GLP-1对大鼠胰岛氧化应激损伤的保护作用及机制研究

目的观察GLP-1对H2O2所致的胰岛β细胞氧化损伤的保护作用,探讨其抵抗氧化应激诱导的细胞凋亡作用机制。方法 Ficoll法分离纯化SD大鼠胰岛β细胞,实验分为正常对照组、H2O2诱导胰岛损伤组、GLP-1预处理+H2O2损伤组。采用FDA/PI染色法检测细胞存活,Annexin-V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,荧光定量PCR检测氧化应激和细胞凋亡相关基因i NOX、SOD2、Caspase-3、Bcl-2表达,Western blot检测胰岛细胞Akt、P-Akt、Caspase-3蛋白表达。观察GLP-1预处理能否减少ROS诱导的胰岛β细胞凋亡,以及在此过程中PI3K/Akt信号通路的改变。结果经H2O2损伤后胰岛β细胞的增殖活性、存活率和胰岛素分泌能力显著降低,细胞凋亡率显著升高;i NOS、Caspase-3基因表达显著升高,SOD、Bcl-2基因表达显著降低;Akt蛋白磷酸化水平明显降低,Caspase-3活性明显升高。GLP-1预处理可显著提高β细胞的增殖活性、存活率和胰岛素分泌能力,减少细胞凋亡;显著降低i NOS、Caspase-3基因表达,上调SOD基因表达;增强Akt磷酸化,减少活化Caspase-3水平。结论 GLP-1对H2O2所致的大鼠胰岛氧化应激损伤具有一定的保护作用,其作用机制与增强Akt磷酸化及抑制凋亡信号分子活化相关。     

致密斑细胞COX-2的表达及AP-1、NFκB信号通路

目的评估低盐(LS)培养对小鼠致密斑(MMDD1)细胞环氧化酶-2(COX-2)表达及核因子-κB(NF-κB)和活化蛋白-1(AP-1)活性的影响。方法经脂质体转染含NF-κB或AP-1的报告质粒,采用瞬时表达方法检测正常盐(NS)与LS培养对NF-κB和AP-1转录活性的影响。采用RT-PCR检测MMDD1细胞COX-2表达的变化,Westernblot方法检测细胞内p-p38MAPK、p-p44/42、c-Jun、c-Fos和COX-2蛋白的表达。结果LS培养促进了MMDD1细胞COX-2mRNA和蛋白表达(P<0.01)。LS培养后,p38和p44/42的磷酸化程度显著上调(P<0.01),180min后达到高峰。p38抑制剂SB-203580、p44/42抑制剂PD-98059可降低LS诱导的COX-2表达(P<0.01)。LS培养促进了c-Jun、c-Fos蛋白表达(P<0.01),激活了AP-1和NF-κB的转录活性(P<0.01)。25μmol/LNF-κB抑制剂PDTC和20μmol/LAP-1抑制剂curcumin下调了LS诱导的NF-κB、AP-1活性(P<0.01)。25μmol/LPDTC、20μmol/Lcurcumin降低了LS诱导的COX-2mRNA和蛋白表达(P<0.01)。结论LS培养可促进MMDD1细胞COX-2的表达,其作用可能与促进p38MAPK、p44/42激酶的磷酸化,增加NF-κB和AP-1的活性有关。     

乳腺癌耐药性中MAPK信号转导通路与EGR-1关系的研究

目的探讨乳腺癌细胞阿霉素耐药中p38MAPK通路与EGR-1活性的关系。方法用流式细胞术、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、RT—PCR及Western Blot等方法分别检测SB203580（15μmol／L）干预后细胞的凋亡、细胞内阿霉素浓度及细胞对阿霉素敏感性的改变;EGR-1 mRNA表达及P—gP、磷酸化p53蛋白及p38蛋白表达情况。结果经SB203580（15μmol／L）干预,流式细胞仪检测见MCF-7／Adr细胞发生显著凋亡,并呈一定时间依赖性;细胞内阿霉素浓度显著增加;MCF-7／Adr细胞对阿霉素药物的耐受性显著降低;伴随p38MAPK通路活性抑制和EGR—1mRNA表达增加,磷酸化p53蛋白表达显著上调,而P—gP蛋白显著下调。结论提示p38MAPK通路与乳腺癌细胞阿霉素耐药密切相关,p38MAPK通路调控的EGR—1激活参与乳腺癌细胞阿霉素耐药的形成。     

干扰素-γ消除肿瘤相关成纤维细胞介导非小细胞肺癌细胞辐射抵抗的实验研究

目的探讨干扰素-γ消除肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）介导的非小细胞肺癌细胞辐射抵抗的效果。方法从2020年12月至2021年6月温州市中心医院胸外科行根治性切除的15例肺癌患者临床标本中提取CAFs,通过流式细胞术、HE染色、免疫组化对分离出的CAFs进行鉴定。将肺腺癌细胞A549和肺鳞癌细胞H460置于直线加速器中辐射。采用Transwell和CAFs细胞上清液培养两种方法对CAFs与辐射后的A549和H460共培养,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡占比,CCK-8法检测肿瘤细胞活性;高效液相色谱法检测CAFs细胞上清液中谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸、胱氨酸水平;Westernblot检测CAFs细胞内胱氨酸转运蛋白xCT、肿瘤细胞内DNA损伤修复蛋白γH2AX、信号传导及转录激活蛋白1（STAT1）表达情况。结果CAFs与辐射后肿瘤细胞共培养后,辐射后肿瘤细胞凋亡占比下降,细胞活性增加;CAFs提高了肿瘤细胞内GSH水平,而干扰素-γ降低CAFs细胞上清液中GSH、半胱氨酸水平,提高胱氨酸水平,进而减少肿瘤细胞活性;干扰素-γ下调xCT在CAFs中表达,干扰素-γ作用后CAFs组的肿瘤细胞中γH2AX表达相应增加,CAFs细胞内STAT1获得激活并使其成为磷酸化STAT1。结论CAFs通过释放GSH来诱导非小细胞肺癌细胞对辐射抵抗,而干扰素-γ则下调xCT在CAFs中表达,进而消除其介导的辐射抵抗。     

AMPK／mTOR 通路参与脓毒症亮氨酸抵抗的研究进展

脓毒症可导致机体蛋白质合成显著抑制,产生亮氨酸抵抗。蛋白质合成由mTOR磷酸化核糖体蛋白p70S6激酶1（p70S6K1）和真核细胞翻译抑制因子4E结合蛋白1（eIF4E-BP1）进行调控,AMPK作为负向调节mTOR的重要信号分子,在脓毒症状态下存在活性异常。文中就AMPK／mTOR通路与脓毒症亮氨酸抵抗的相关研究进展进行综述。     

根皮素抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞氧化应激反应

目的 探讨根皮素(phloretin, PHL)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)导致的BV2小胶质细胞的氧化应激损伤的抑制作用及可能的分子机制。方法 利用LPS建立BV2小胶质细胞的氧化应激损伤模型,对该模型予以不同浓度的PHL 预处理。利用MTS方法检测细胞活力。ELISA法检测氧化应激相关产物一氧化氮(nitric oxide,NO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性。双荧光素酶活性检验方法检测抗氧化响应元件荧光素酶报告基因质粒(antioxidant reaction element luciferase reporter plasmid,ARE-LUC)报告基因转录活性。Western blotting法检测磷酸化核因子-E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)和血红蛋白加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达。结果 与对照组相比,LPS处理后的BV2小胶质细胞活力显著降低,氧化应激产物NO和MDA水平明显升高,GSH含量和SOD活性明显下降,但Nrf2磷酸化水平、ARE-LUC报告基因转录活性和HO-1蛋白表达略有增高。与模型组比较,高剂量PHL(20 μmol/L)预处理明显改善了LPS导致的BV2小胶质细胞活力下降,降低NO和MDA的含量,增高GSH的含量和SOD的活性,且进一步增加了Nrf2的磷酸化水平,上调ARE-LUC的转录活性和HO-1蛋白的表达。结论 PHL可以显著抑制LPS导致的BV2小胶质细胞的氧化应激损伤,Nrf2/ARE通路可能是根皮素发挥抑制BV2小胶质细胞氧化应激损伤作用的途径之一。     

H_2O_2通过上调P38的活性而诱导PC12细胞凋亡

目的:探讨H2O2是否通过调节P38MAPK的活性而诱导PC12细胞凋亡。方法:碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡;Western-Blot测定磷酸化ERK1/2蛋白和磷酸化p38蛋白的表达。结果:作用PC12细胞24h后,20～80μmol/L的H2O2可呈浓度依赖性地诱导PC12细胞凋亡并增加PC12细胞P38磷酸化的水平;P38特异性抑制剂SB203580(10或20μmol/L)预处理30min可显著减轻40μmol/LH2O2对PC12细胞凋亡的诱导作用。结论:H2O2通过上调P38的活性而诱导PC12细胞凋亡。     

IGF-1对Aβ1-40诱导PC12细胞tau蛋白过度磷酸化的保护作用及其机制研究

目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对β样淀粉蛋白(Aβ1-40)引起的PC12细胞tau蛋白磷酸化的保护作用及其机制.方法 通过MTT法观察不同浓度的IGF-1对PC12细胞存活的影响.应用蛋白免疫印迹方法,检测Aβ1-40处理后PCI2细胞tau蛋白磷酸化、总tau蛋白、糖原合成激酶3 β(GSK-3β)和磷酸化GSK-3βSer9的表达情况;观察IGF-1或GSK-3β特异性抑制剂氯化锂(IACl)对Aβ1-40诱导PCI2细胞上述指标变化的影响.结果 不同浓度的IGF-1均能提高PC12细胞生存率,1μg/mL IGF-1作用最明显.tau蛋白Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平在Aβ1-40诱导后3 h开始增高,12 h达到高峰;总tau蛋白的变化趋势与tau蛋白磷酸化的改变大体一致.在tau蛋白磷酸化达高峰时,GSK-3β的表达增加而磷酸化GSK-3βSer9的表达减少.用IGF-1或LiCl处理后,可减轻Aβ1-40所诱导的tau蛋白过度磷酸化,同时GSK-3β的表达下降而磷酸化GSK-3βSer9的表达增加.结论 Aβ1-40可使PC12细胞tau蛋白Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平增高,该作用主要通过激活GSK-3β实现.IGF-1可抑制GSK-3β的活性,最终达到减轻Aβ1-40所诱导的PC12细胞tau蛋白过度磷酸化的作用.     

H2O2对平滑肌细胞凋亡及p38MAPK活性的影响

目的 :了解H2 O2 对兔血管平滑肌细胞 (VSMC)p38蛋白激酶 (p38MAPK)磷酸化的影响及其与细胞凋亡的关系。方法 :取兔主动脉血管平滑肌细胞培养 ,加或不加H2 O2 孵育 ,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应 (MTT)法检测平滑肌细胞活性 ,以Western杂交检测p38MAPK磷酸化。结果 :①随着H2 O2 浓度增加 ,VSMC活性呈剂量依赖性降低 ;②磷酸化p38MAPK的表达随H2 O2 浓度的增高而增加 ,且磷酸化的p38MAPK在H2 O2 作用后 15min时达到峰值。③加用特异性的p38MAPK抑制剂SB2 0 35 80后可显著降低p38MAPK的活化 ,并能逆转H2 O2 诱导细胞凋亡的作用。结论 :H2 O2 通过激活p38MAPK而使平滑肌细胞凋亡增加 ,这也许是糖尿病患者更易患心血管疾病的原因之一     

BMP2诱导C3H10T1／2细胞成软骨分化的分子机制研究

目的：探讨骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1／2向成软骨分化的可能分子机制。方法：20μg／mLBMP2诱导C3H10TI／2细胞0,4h,1,3,6,10,13,15d后,RT—PCR检测BMP信号通路中关键分子BMPRI,BMPRII,Smadl／5／8的表达,Westernblot检测smad蛋白及MAPK信号通路中p38磷酸化水平变化,QRT—PCR检测成软骨标志基因aggrecan,Col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平,同时用Alcine Blue染色,观测C3H10T1／2细胞成软骨分化情况。结果：经BMP2诱导后,C3H10T1／2细胞表现出成软骨分化,smad蛋白及p38磷酸化水平有所上升,同时成软骨标志基因col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平都有增加。与未诱导组相比,Col2a1,FGFR3,Sox9在3d的表达与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）,FGFR3,Sox9在6d的表达与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：在一定培养条件下,BMP2具有诱导C3H10T1／2细胞成软骨分化能力。     

在鼻咽癌细胞中EB病毒LMP1调控G1/S检测点重要相关蛋白的转录

目的在Tet-on-LMPlHNE2鼻咽癌细胞中探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白1（LMP1）调控p16和cyclinD1的转录．方法采用Westernblot方法、荧光素酶报道系统和RT-PCR方法检测在DOX诱导下不同时间点p16和cyclinD1的启动子活性和转录．结果LMP1可下调p16启动子活性和mRNA表达；同时上调cyclinD1启动子活性和mRNA表达．结论 在Tet-on-HNE2鼻咽癌细胞中EB病毒LMP1在转录水平调控G1／S检测点重要相关蛋白p16和cyclinD1的表达．