小鼠巨噬细胞的体外培养

目的巨噬细胞在体外培养需要有巨噬细胞克隆刺激因子的刺激方可增殖，故被认之谓“惰性细胞”。本文通过添加L929细胞培养上清液刺激巨噬细胞增殖拟建立体外巨噬细胞培养法。方法在原代巨噬细胞培养液中添加不同浓度的L929细胞培养上清液，用细胞生长动态线图来反映巨噬细胞的增殖改变。结果当添加L929细胞培养上清液浓度≥12．5％时，较对照管呈明显地刺激巨噬细胞生长并伴随添加浓度的增加呈正相关作用。结论用L929细胞培养上清液可刺激原代巨噬细胞增殖，将为有关巨噬细胞功能等研究提供一项有效工具。     

人表皮干细胞在两种培养体系中生长增殖的比较研究

目的比较表皮干细胞(KSC)在两种体外培养体系中的生长增殖状况.方法用差速粘附法分离出的KSC,分别置于无饲养层、无血清培养基以及有饲养层、有血清培养基的培养条件下培养.比较KSC在两种培养体系中的生长增殖、克隆形成率、生长曲线和KSC相关标记物的表达等指标.结果在第二种培养条件下,KSC在生长过程中不存在明显的接触抑制,在较长的体外培养时间内始终保持较高的增殖潜能.两种培养体系间KSC的克隆形成率有显著差异(P＜0.01).流式细胞仪检测两种培养体系间整合素β1阳性率无显著差异,而强阳性率则有显著性差异(P＜0.05).结论体外培养和扩增KSC时,使用人成纤维制备的饲养层和含胎牛血清的培养基,较无饲养层、无血清的培养基,更有利于KSc的扩增及其表型的维持.     

人表皮干细胞在两种培养体系中生长增殖的比较研究

目的 比较表皮干细胞(KSC)在两种体外培养体系中的生长增殖状况。方法 用差速粘附法分离出的KSC,分别置于无饲养层、无血清培养基以及有饲养层、有血清培养基的培养条件下培养。比较KSC在两种培养体系中的生长增殖、克隆形成率、生长曲线和KSC相关标记物的表达等指标。结果 在第二种培养条件下,KSC在生长过程中不存在明显的接触抑制,在较长的体外培养时间内始终保持较高的增殖潜能。两种培养体系间KSC的克隆形成率有显著差异(P<0.01)。流式细胞仪检测两种培养体系间整合素β1阳性率无显著差异,而强阳性率则有显著性差异(P<0.05)。结论 体外培养和扩增KSC时,使用人成纤维制备的饲养层和含胎牛血清的培养基,较无饲养层、无血清的培养基,更有利于KSC的扩增及其表型的维持。     

耐受T细胞抑制NK细胞和巨噬细胞对大鼠皮肤移植物的排斥

目的 了解NK细胞和巨噬细胞在T细胞缺乏或T细胞成功重建的情况下对异种移植物排斥的作用。方法在无胸腺裸小鼠、通过混合胸腺移植重建T细胞后裸小鼠和正常免疫健全小鼠分别进行F344大鼠皮肤移植,观察异种皮肤移植物的存活情况,并利用流式细胞仪检测各组受体动物外周血中CD4+和CD8+T细胞的百分率,利用ConA增殖实验和混合淋巴细胞培养检测其体外功能状态。结果 在没有清除受体体内NK细胞和巨噬细胞的情况下,正常无胸腺BALB/c裸小鼠上移植的F344大鼠皮肤移植物发生了排斥,平均存活时间为(20.50±2.38)d;而在裸小鼠左肾包膜下移植的F344胎大鼠胸腺组织,却能够正常发育,并有效重建了受体的T细胞免疫,而且诱导了F344大鼠皮肤移植物的长期存活。结论NK细胞和巨噬细胞在异种移植物的排斥中起十分重要的作用,不同组织对NK细胞和巨噬细胞细胞毒性的易感性可能存在一定的差异。对异种供体抗原已产生耐受的T细胞可抑制受体体内NK细胞和巨噬细胞对异种移植物的排斥。     

人胚胎干细胞培养体系的研究进展

人胚胎干细胞(hESC)具有显著的增殖能力和分化潜能,已经成为研究再生医学、药物学、药理毒理学、人胚胎发育学和功能基因组学的种子细胞库.hESC在长期维持培养中保持增殖潜能和未分化状态需要饲养层细胞或基质蛋白、血清或基因敲除血清(KSR)以及碱性成纤维生长因子、骨形态蛋白、转化生长因子、激活素A等生长因子.本文就hESC培养体系的传统小鼠胚胎成纤维细胞饲养层、人源性饲养层、Matergel胶、KSR取代血清、在基质中加入明确的不同的细胞因子等培养方案和hESC的组织工程学应用的研究现状及进展作一综述.     

不同活化表型的巨噬细胞对淋巴管内皮细胞增殖、迁移和管样结构形成的影响

目的:探讨不同活化表型的巨噬细胞对淋巴管内皮细胞(LEC)增殖、迁移和管样结构形成的影响。方法:分别以mrIFN-γ、mrIL-4处理小鼠RAW264.7细胞,建立经典活化的巨噬细胞(caMphi)和替代性活化的巨噬细胞(aaMphi)模型。采用transwell系统,将活化的巨噬细胞和LEC共培养。通过绘制细胞生长曲线、细胞迁移实验和基质胶实验,分别观察它们对LEC增殖、迁移和管样结构形成的影响。结果:与aaMphi共培养的LEC增殖速度较快,迁移能力和管样结构形成能力均明显强于其它对照组。结论:aaMphi能够促进LEC增殖、迁移和管样结构形成。     

小鼠胚胎干细胞饲养层制备条件的研究

目的:建立稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于分离克隆胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞).方法:取妊娠13.5～14.5d的胎鼠,采用组织消化法结合组织块培养法分离、培养小鼠成纤维细胞;MTT法测定细胞生长曲线,结合倒置显微镜观察筛选小鼠成纤维细胞饲养层的最佳种植密度;MTT法筛选丝裂霉素c作用的最佳浓度和时间.取妊娠3.5d的小鼠囊胚在经丝裂霉素C处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞生长情况.结果:组织消化法结合组织块培养法是分离培养小鼠成纤维细胞的较好的方法;1 × 105～2×105个/ml种植密度适于饲养层铺板;丝裂霉素c 10μg/ml作用3.5h或20μg/ml作用2.5h能抑制成纤维细胞增殖,细胞至少在7d内维持稳定的水平;妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成Es集落.结论:制备的胎鼠成纤维细胞饲养层能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长.     

不同的培养条件对脑胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨不同的培养条件包括母代细胞的生长状态及细胞密度对U251细胞增殖及凋亡的影响及相关机制.方法 细胞增殖实验检测U251细胞在不同的培养条件下(母代细胞的生长状态及细胞密度)的生长情况,Western blot检测p-ERK1/2、cleaved-caspase3、cleaved-caspase8、p27、cyclin D1、p-PLK、p-FPAK的表达.Caspase3活性实验检测细胞凋亡.流式细胞实验检测细胞周期及增殖.结果 将平台期U251细胞重新种植高密度即PH组,细胞快速增殖;将指数期U251细胞重新种植高密度即EH组,细胞增殖缓慢并伴随细胞脱壁.EH组细胞表达cleaved-caspase3、cleaved-caspase8,且caspase3活性升高,提示细胞发生凋亡.流式细胞实验显示EH组细胞发生G2阻滞,Western blot显示cyclin D1、p-PLK1表达下调,而p27表达上调.促进FAK的表达并不能抑制细胞凋亡.功能性p27的高表达抑制EH组细胞发生凋亡,并促进细胞增殖.结论 母代细胞的生长状态及细胞密度影响U251细胞的增殖及凋亡,功能性p27的表达在维持脑胶质瘤细胞的增殖及存活中起到重要作用.     

无饲养细胞无外源因子条件下高克隆密度 维持人类胚胎干细胞自身未分化状态

目的：建立人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）无饲养细胞无外源性细胞因子体外培养体系。方法：比较hESCs克隆种植密度对其无饲养细胞无外源性细胞因子体外培养的影响,以及克隆种植密度对hESCs培养体系骨形蛋白(bone morphology protein, BMP)样诱导活性的影响。结果：在没有外源性细胞因子条件下,高克隆密度（34克隆/cm2）可以维持hESCs处于未分化状态,而低克隆密度不能维持hESCs处于未分化状态。同时, NB体系BMP样诱导活性可以被hESCs克隆种植密度所改变,高hESCs克隆密度时,培养基具有高的BMP样诱导活性。结论：高hESCs克隆种植密度可以改变自身生长的微环境,可以维持自身未分化状态,这?鱤ESCs自身未分化状态机制和简化hESCs无饲养培养体系提供了新的思路。     

腹腔巨噬细胞的获取、提纯及体外培养的研究

用昆明种小鼠按Wasley's法快速获取腹腔巨噬细胞。以贴壁法提纯(9～12℃),体外培养的细胞呈单层生长,可存活2～3周。对提纯的细胞用形态学、细胞化学、吞噬及抗胰蛋白酶消化试验等法鉴定。结果:体外培养的细胞具有巨噬细胞的典型特征,属高纯度的巨噬细胞,纯度达97%以上。使用高纯度的细胞必将提高实验研究的质量。     

大鼠肝细胞、Kupffer细胞体外共同培养的初步研究

目的研究SD大鼠Kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时肝实质细胞生长、形态及功能状况.方法原位二步IV型胶原灌注法联合Percoll液密度梯度离心法分离肝实质细胞与Kupffer细胞;体外进行两种细胞单独培养、肝细胞与Kupffer细胞按6∶1比例共同培养,观察不同情况下肝细胞生存时间和形态,检测培养上清中白蛋白和糖的水平.结果单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变,肝细胞可培养存活至21 d;共同培养组肝细胞于48 h即开始出现少量的死亡细胞,细胞生长增值缓慢,细胞可培养存活至10 d.单独培养组上清白蛋白水平在48、96、120、144、168 h比混合培养组高(P<0.05);单独培养组上清糖水平在96、144、168 h高于混合培养组(P<0.05).结论肝实质细胞和Kupffer细胞在适宜的培养条件下可进行共培养;但共培养时肝细胞的生长、白蛋白合成功能和糖代谢会受到影响,肝细胞存活时间缩短,提示在共培养体系要实现肝实质细胞和Kupffer细胞两者良好生长和功能的协调,体外共培养条件需进一步优化.     

巨噬细胞对乳腺癌细胞MCF-7体外杀伤作用的研究

目的:观察巨噬细胞体外扩增特性及其对乳腺癌细胞MCF-7的抗肿瘤作用。方法:将巨噬细胞与乳腺癌细胞MCF-7共培养,获取初期细胞,光镜观察。以MTT法检测巨噬细胞对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率。结果:共培养初期细胞膜完整、细胞折光性强;37℃、5%CO2、不换液、不传代培养后,细胞内颗粒增多、折光性变弱,同时死亡、破碎细胞数量增加;继续培养,细胞几乎全部死亡、破碎,培养至18天左右,体积变大、折光性变强等具有活化特征的细胞出现;采用适当方式换液后,这些折光性较强的细胞的体积迅速增大,进入分裂增殖状态;培养50天左右,细胞的分裂、增殖减缓,细胞吞噬加强,巨大细胞的数量逐渐增多。以MTT法检测巨噬细胞对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率,在效靶比为5:1、10:1、20:1、40:1时,抑制率随着效靶比的增加而增加,成正相关。而当效靶比为100:1时,反而促进肿瘤细胞的增殖。结论:采用死亡肿瘤细胞悬液可诱导PBMC获得巨噬细胞,巨噬细胞在一定浓度的范围内可抑制肿瘤细胞的生长,而当浓度过高时反而促进肿瘤细胞的生长。     

无血清无饲养层条件下培养小鼠胚胎干细胞

目的 研究在无血清无饲养层条件下小鼠胚胎干细胞的培养方法,为最终建立无血清无饲养层培养系统打下基础.方法 比较小鼠胚胎于细胞ES-S8株在无血清培养体系和有血清培养体系中的生长情况,分析ES-S8细胞克隆形成效率,测定其生长速度;然后在撤去血清和饲养层的条件下培养ES-S8细胞,进行AKP染色和表面标记物SSEA-1免疫荧光检测.结果 ES-S8细胞在无血清培养条件下细胞生长速度减缓,克隆形成率降低,但AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性;在无血清无饲养层条件下ES-S8细胞培养仍能形成克隆,且AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性.结论 研究表明ES-S8细胞能够在无血清无饲养层的培养条件下生长,保持其良好的未分化特性.     

表皮细胞培养与移植研究Ⅰ、人角化细胞在三种培养法中生长的观察

应用三种培养方法观察人角化细胞生长、增殖与形成膜片的过程,共111次。人表皮细胞单层细胞生长率3T3饲养层培养法最高达80.0％;皮块培养法为52.5％;细胞悬液培养法仅为11.8％。3T3饲养层培养法效果最佳,优点较多,值得选用。皮块培养法简便易行,效果也可,如能设法排除成纤维细胞混合生长,仍为可选用的培养方法。     

活化Mφ培养上清液对VSMCs增殖和Ⅰ、Ⅲ胶原合成的影响

目的观察活化巨噬细胞培养上清液对原代培养VSMCs增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响。方法体外原代培养大鼠血管平滑肌细胞并制备活化巨噬细胞培养上清液,以细胞计数和MTT染色评价不同浓度和作用时间的巨噬细胞培养上清液对VSMCs增殖的影响,L-^3H脯氨酸掺入法和反转录PCR（RT-PCR）检测Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的变化。结果活化巨噬细胞培养上清液促进VSMCs增殖,细胞计数和MTT染色结果随作用浓度和作用时间渐增;L-3H脯氯酸掺入和RT-PCR示胶原合成和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达随浓度和时间的增加而上升。结论活化巨噬细胞分泌促进VSMCs增殖和胶原代谢,此作用呈时间和剂量依赖性。     

聚醚砜膜对星形胶质细胞生物学行为的影响

目的研究聚醚砜膜对星形胶质细胞(AST)生长、存活增殖及分泌神经营养因子的影响。方法取小鼠皮层组织进行AST原代培养,传代纯化培养后分为3组:A普通培养板组;B聚醚砜膜组;C层粘连蛋白包被膜组,观察和比较细胞形态学、细胞存活增殖能力的变化,同时测定培养基中神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子(BDNF)含量。结果在原代和传代培养期,聚醚砜膜上培养第3天后的AST细胞数较其他组明显减少(P<0.05)。在传代培养期,3组的细胞存活增殖能力均在第7天后逐渐衰退,分泌NGF和BDNF的能力也呈相同的下降趋势,聚醚砜膜组AST的变化较另外2组的变化更为明显(P<0.05)。结论聚醚砜膜对星形胶质细胞的存活增殖有一定抑制作用,并降低AST分泌NGF和BDNF的能力,层粘连蛋白可在一定程度上减轻聚醚砜膜对AST功能的抑制作用。     

枸杞子等八种中药提取液对体外培养细胞和小鼠腹腔巨噬细胞影响的实验研究

本文应用细胞培养和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能观察测定的方法,研完了龟板、补骨脂、田七、枸杞子、莪术、五味子、木瓜和云芝对体外培养二倍体细胞形态、生长速度及小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率与吞噬指数的变化。实验结果提示龟板、补骨脂、枸杞子均明显地促进二倍体细胞的生长增殖速度,提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,而木瓜能减缓细胞的生长降低巨噬细胞吞噬作用。本研究为临床应用和探讨其作用机理提供一定的实验依据。     

猴骨髓间充质干细胞的分离及多向诱导分化

目的　探讨猴骨髓间充质干细胞 (MSCs)体外生长特性及多向分化潜力 .方法　以Percoll(质量密度 10 73g·L-1)非连续密度梯度离心分离出骨髓悬液中的MSCs,在非诱导条件下进行培养 ,观察细胞的形态、生长状况 .取原代体外培养3wk的MSCs分别向成软骨细胞、成骨细胞、成脂肪细胞及成肌细胞方向诱导 ,观察其诱导分化结果 .结果　原代培养的MSCs增殖缓慢 ,细胞增殖率和形态分化不均一 ,在培养过程中有多种形态的细胞出现 ,如伸展及增殖均不明显的圆形细胞 ,伸展充分但增值不明显的片状细胞、神经元样细胞 ,还可见增殖明显的克隆团状或条带状细胞群出现 .传代培养的MSCs细胞仍可见增殖情况及形态分化的多样性 ,但有“拉网”现象出现 .所培养的MSCs经诱导可向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞发展分化 .结论　体外培养的猴MSCs细胞具有形态分化、增殖情况多样性的特点 ,并具有多向分化潜能 .     

巨噬细胞通过分泌抗菌肽LL-37/hCAP-18调控卵巢癌细胞的增殖

目的 研究巨噬细胞是否通过分泌抗菌肽LL-37/hCAP-18对卵巢癌细胞的生长增殖进行调控。方法 采用Millicell插入式细胞培养皿共培养人巨噬细胞和卵巢癌细胞株SKOV3;通过细胞计数法检测巨噬细胞对卵巢癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测共培养上清中的相关细胞因子及LL-37的水平;实时定量反转录聚合酶链反应在mRNA水平检测巨噬细胞和SKOV3细胞中LL-37 mRNA的表达水平;应用LL-37中和抗体抑制LL-37的功能及活性,进而通过MMT细胞增殖实验探讨LL-37对巨噬细胞对卵巢癌细胞增殖的调控。结果 细胞计数法检测结果显示,巨噬细胞与卵巢癌细胞SKOV3共培养后,可促进其增殖;共培养的上清中,LL-37及IL-6水平明显升高;实时定量RT-PCR在mRNA水平共培养中的巨噬细胞其LL-37基因表达升高,且其表达水平随时间的延长而增加;应用LL-37的中和抗体,可明显抑制巨噬细胞对SKOV3细胞的增殖促进作用。结论 在与卵巢癌细胞共培养的环境中,巨噬细胞通过增强抗菌肽LL-37的表达和分泌水平促进卵巢癌细胞的增殖,LL-37在巨噬细胞促进卵巢癌的发展中扮演重要角色。     

DC-CIK细胞对人肝癌HepG2细胞增殖、迁移的影响

目的探讨经细胞因子从肝癌患者外周血贴壁单个核细胞(PBMCs)诱导的树突状细胞(DC)与杀伤细胞(CIK)对人肝癌HepG2细胞增殖、迁移的影响。方法用肝癌患者肝癌组织裂解物(肿瘤抗原)致敏经粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-4(IL-4)等诱导该患者PBMCs产生的DC。用干扰素-γ(IFN-γ)、IL-2和人CD3单克隆抗体(human CD3monoclonal antibody,hCD3mAb)等诱导该PBMCs的悬浮细胞产生CIK细胞。用Tanswell培养小室将DC-CIK细胞与HepG2细胞在同一培养体系内经该小室膜分隔培养24、48h。CCK-8法检测HepG2细胞生长变化,并绘制其生长曲线;划痕实验检测其增殖、迁移能力。RT-PCR、Western blot分别检测其增殖细胞核抗原(PCNA)基因及其编码蛋白的表达。结果 CCK-8法检测显示,DC-CIK细胞对人HepG2细胞生长具显著杀伤作用,与对照组细胞比较,差异有统计学意义(P<0.01)。划痕实验、基因与蛋白水平检测表明,DC-CIK细胞可明显抑制该瘤细胞的增殖与迁移,能在基因与蛋白水平下调该瘤细胞PCNA的表达。结论 DC-CIK细胞可显著下调肝癌细胞的PCNA基因表达,明显抑制其增殖与迁移,以发挥其杀瘤作用。