三聚氰胺人工抗原及多克隆抗体的制备

采用戊二醛法将三聚氰胺(Melamine,MEL)偶联到牛血清白蛋白(BSA)上合成免疫原三聚氰胺-牛血清白蛋白(MEL-BSA).三聚氰胺甲醛树脂法对三聚氰胺衍生化,再偶联到鸡卵清蛋白(OVA)合成包被原三聚氰胺-鸡卵清蛋白(MEL-OVA).对纯化后的合成抗原进行紫外扫描、红外扫描和SDS-PAGE电泳鉴定.免疫新西兰大白兔,检测抗体的生成.结果表明,免疫兔血清的效价达到了1∶20 000,从而为进一步建立三聚氰胺的免疫检测方法奠定了基础.     

自动洗板机校准方法的研究

一、自动洗板机的应用及原理酶联免疫吸附测定(简称ELISA)主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性(称为包被),抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应,通过洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶     

鲤鱼(Cyprinus Carpio) 促性腺激素基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从鲤鱼脑垂体获得了两种GtH β亚基的cDNA, 克隆在pMD18-T载体.经测序确证后,将这两个基因克隆到原核表达载体pET -32(a)中,转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导融合蛋白的高效表达.利用初步纯化后的抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.应用制备的兔抗血清与抽提的鲤鱼脑垂体的总蛋白分别进行Western-blot及ELISA分析,结果显示获得的多抗能特异识别各自的天然蛋白.该结果为纯化天然GtH蛋白提供了有效的检测手段,为进一步制备GtH单克隆抗体奠定了基础.     

牙鲆红细胞对不同抗原的免疫黏附及Ⅰ型补体受体的检测

采用C3b受体花环实验探究了牙鲆红细胞对不同种类抗原的免疫黏附能力,确定了影响免疫黏附作用的理化因子。实验选取创伤弧菌、金黄色葡萄球菌和啤酒酵母3种不同类别的抗原分别与牙鲆红细胞在优化条件下反应。结果表明,牙鲆红细胞对3种抗原均有免疫黏附作用,在20℃、0.1mol/L PBS~(++)缓冲液的反应条件下,牙鲆红细胞黏附创伤弧菌、金黄色葡萄球菌和啤酒酵母的C3b受体花环率分别为(19.00±1.01)%、(6.09±1.36)%和(3.42±0.00)%,对3种抗原的免疫黏附活性差异显著(P0.05)。利用AKTA快速蛋白液相层析系统的Superdex 200 GL型高效柱分离纯化牙鲆红细胞膜蛋白Ⅰ型补体受体(CR1),通过dot-ELISA法检测发现红细胞膜蛋白组分中含有CR1成分,表明牙鲆红细胞膜上表达了与高等脊椎动物有较高同源性的CR1分子。此实验首次证明了牙鲆红细胞具有发挥免疫功能的重要物质基础。     

结核分枝杆菌DNA疫苗的免疫原性和保护效率的比较研究

对结核分枝杆菌两种DNA单价疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价和比较。将结核分枝杆菌抗原蛋白。MPT70(22kDa)和PstS-3(40kDa)克隆到原核表达载体pET22b中,酶切和测序鉴定正确后转化入E．coli BL21(DE3)PLysS宿主菌株内中,通过诱导表达纯化获得目的蛋白用于DNA疫苗效价鉴定。用真核表达载体pJW4303构建了MPT70,PstS-3(包括信号肽的全基因)两种重组真核质粒(DNA疫苗),进行了酶切鉴定和序列分析,确定含有正确的读码框。用上述DNA疫苗分别肌注免疫小鼠,三免小鼠后21天MPT70和PstS-3抗体均达到为1：12800,三免后21天小鼠的脾脏细胞诱导产生较高水平的MPT70和PstS-3特异性的细胞因子γ-干扰素,浓度分别为16872．82pg／ml和11460．98pg／ml.三次免疫后经静脉强毒攻击,两组DNA疫苗免疫鼠的肺脏和脾脏的载菌数均比阴性对照组少,表明这两种疫苗都能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答,而且以前者为主。综合各项指标发现,DNA疫苗MPT70要优于PstS-3。     

高效液相色谱法测定调味油中苏丹红Ⅰ号测量不确定度评定

本文依据分层建模法建立了采用外标峰面积定量的液相色谱法测定苏丹红Ⅰ不确定度评定的数学模型,对影响测量结果的不确定度分量进行了逐层分析和合成,较为全面地评定了测量结果的不确定度,评定结果发现,本次实验的不确定度主要由样品均匀性和处理操作过程所引入.     

HPLC法测定辣椒粉中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号的不确定度分析

本文采用HPLC方法对辣椒粉中苏丹红Ⅰ号的含量进行测定，然后根据JJF1059—1999《测量不确定度评定与表示》找出影响苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号测定结果不确定度的因素，并对不确定度进行分析，为评定检测报告提供科学依据。     

坛紫菜别藻蓝蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

通过液氮研磨、超声波破碎、硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sephadex-A-50柱层析等手段,建立了从坛紫菜叶状体体细胞中快速高效纯化别藻蓝蛋白的技术,并以该蛋白为抗原,通过动物免疫,制备了抗别藻蓝蛋白的多克隆抗体.电泳及Western印迹杂交分析的结果表明,纯化的别藻蓝蛋白已达到电泳纯,A650/A280达到3.5,计算蛋白回收率为70.5%.制备的多克隆抗体特异性强,效价高达1∶100 000.本研究的结果为进一步研究别藻蓝蛋白的功能和进行开发提供了基础材料和有用的工具.     

免疫亲和分离膜研究进展

免疫亲和膜是基于抗原和抗体间高特异性可逆相互作用对抗体或抗原进行分离的一项新型分离技术,兼有膜分离和亲和色谱的优点.介绍了免疫亲和色谱的作用机理、膜材料和配体的选择,以及免疫亲和膜在抗体分离纯化和快速诊断测试方面的应用,同时还对免疫亲和膜的未来发展进行了展望.     

小鼠对HIV-2嵌合结构基因重组鸡痘病毒的免疫反应

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4 、CD8 T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,成功筛选出一株可稳定表达HIV-2嵌合蛋白Gag-gp105的重组鸡痘病毒rFPV-gg;该重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.本研究提示,HIV-2 gag-gp105重组病毒能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.     

铜绿微囊藻生物钟蛋白的表达纯化与抗体制备

为了获得融合表达的铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa)生物钟蛋白KaiA、KaiB、KaiC并制备其相应的多克隆抗体,将kaiA、kaiB、kaiC基因分别克隆到原核表达质粒pET-His中.重组质粒pET-His-KaiA,pET-His-KaiB和pET-His-KaiC经酶切和测序鉴定后,分别转化E.coli BL21(DE3)进行融合表达.经SDS-PAGE分析可知,融合表达的KaiA、KaiB和KaiC蛋白表达量可分别达到菌体总蛋白的25%、40%和20%.经亲和层析后融合蛋白KaiA和KaiB的纯度分别达95%和92%,而KaiC经胶回收纯化后纯度也可达93%.将纯化后的三种Kai蛋白作为抗原分别免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测抗体滴度表明,制备的抗KaiA、抗KaiB和抗KaiC的多克隆抗体效价高,分别可达到1:50000、1:60000和1:100000.Western blotting结果表明:获得的多克隆抗体具有较高的效价,抗体能识别相应的Kai蛋白,具有较高的特异性,能用于铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiA、KaiB和KaiC的表达节律检测.     

口蹄疫病毒二价DNA疫苗的构建及实验免疫研究

通过PCR方法从本室已构建的克隆载体pGEMT-P1-2A获得O型口蹄疫病毒主要保护性抗原VP1基因,以基因突变获得A型VP1基因。将这两种血清型的VP1基因串联后连接到真核表达载体PVAX1 PCMV启动子下游,构建成口蹄疫二价核酸疫苗pVAX1-OA。经Western blot和IFA检测,目的蛋白在HeLa细胞中获得正确表达。动物实验表明,免疫小鼠T淋巴细胞明显增殖,特异性CTL杀伤活性较对照组显著提高;血清抗体能分别与O型和A型抗原反应,抗体效价均高于空白对照组,但较灭活苗低。     

重金属汞单克隆抗体的制备及鉴定

通过双功能螯合剂(异硫氰基.苯甲基-乙二胺四乙酸,ITCBE)使汞离子与载体蛋白(匙孔血蓝蛋白,KLH)偶联,获得了免疫抗原KLH-ITCBE-Hg(Ⅱ).以该抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞用EIJSA方法筛选及有限稀释法亚克隆化,获得了5株可稳定分泌抗汞单克隆抗体的杂交瘤细胞株(E/H9、E/B2、1/F11、1/H7和B/B11).杂交瘤细胞染色体数目在97-104之间,所分泌的抗体均为IgM、k型,其中杂交瘤细胞株E/H9、1/F11和B/B11细胞培养上清液效价分别达1:640、1:320、1:160,腹水效价分别达1:6400、1:3200、1:6400.B/B11的亲和常数为2.981×108L/mol,特异性试验表明:B/B11与其它金属离子的交叉反应率均小于2%,具有较高的特异性.高亲合力和高特异性的抗汞单克隆抗体在该研究中的成功制备,为建立农产品和环境中重金属汞的快速免疫检测方法奠定了基础.     

免疫磁性微球的制备及其在丙肝病毒检测中的应用

采用悬浮-乳液聚合法合成了超顺磁性聚丙烯酸甲酯微球,通过氨解反应在微球表面修饰了氨基并偶联了丙肝抗体,通过硅烷化反应在载玻片上修饰了氨基并偶联了丙肝抗体。采用振动样品磁强计（VSM）、生物显微镜和原子吸收光谱仪（AAS）对合成的磁性微球进行了表征。结果表明微球尺寸均一,单分散性较好,平均粒径为4μm,比饱和磁化强度为7.181A.m2/kg,微球表面氨基浓度为0.433mmol/g,具有超顺磁性。通过微球表面的抗体和载玻片上的抗体与丙肝抗原的免疫反应检测丙肝病毒,阴、阳性得到了很好的区分,达到了较好的检测效果。     

高效液相色谱法测定调味油中苏丹红Ⅰ号测量不确定度评定

本文依据分层建模法建立了采用外标峰面积定量的液相色谱法测定苏丹红Ⅰ不确定度评定的数学模型,对影响测量结果的不确定度分量进行了逐层分析和合成,较为全面地评定了测量结果的不确定度,评定结果发现,本次实验的不确定度主要由样品均匀性和处理操作过程所引入。     

苏丹红事件凸显食品安全博弈

回顾苏丹红事件到目前为止的全部过程,许多细节耐 人寻味。 2004年7月,英国发布关于苏丹红食品污染的警示;今 年2月,联合利华(中国)和(亨氏)中国两家公司先后发 表声明,称自己公司在华销售的各种食品不含苏丹红一号, 请广大消费者放心选用;3月4日,北京有关方面检测出亨氏 中国某批号的辣椒酱中含有苏丹红一号。此后,国家质检 总局和工商总局紧急布置彻查工作,在全国范围内追缴亨 氏辣椒酱,并追查苏丹红一号的源头,查明亨氏问题辣椒 酱则已经通过销售网络销往全国九个省市;亨氏中国所使 用的问题原料来自广州田洋公司,而该公司负责人又供述, 所销售的辣椒精是从增城一厂家购买的。     

苏丹红事件回顾

2005年2月,英国食品标准局在官方网站上公布了一份通告：亨氏、联合利华等30家企业的产品中可能含有致癌性的工业染色剂苏丹红一号。随后,一场声势浩大的查禁苏丹红一号的行动席卷全球。就在英国食品标准局把这份通告发出的十多天之后,     

2019新型冠状病毒的抗原抗体检测

2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)入侵人体引起急性呼吸道传染病,命名为2019冠状病毒病(COVID-19)。新冠病毒在全球范围传播对全球公共卫生安全构成了巨大的威胁,新冠病毒的检测对疫病诊断尤为重要。免疫分析技术作为核酸检测的辅助手段,主要用于对疑似病例和与感染者密切接触人员的筛查。免疫诊断技术包括抗体和抗原检测,通过检测感染部位或者血液样本中是否含有病毒本身的蛋白或是由病毒引起免疫反应而产生的抗体来判断是否携带病毒。对目前用于新冠病毒抗原和抗体检测的免疫分析方法着重进行了分析。     

基于电化学共聚蛋白A固定抗体的安培型免疫微传感器

研究了共聚合吡咯和蛋白A（staphylococcal proteinA）修饰传感界面的新方法,用于安培型免疫微传感器检测人免疫球蛋白（immunoglobulin G,IgG）抗原．基于微机电系统（micro electro mechanical systems,MEMS）技术,在硅片上制备带有SU-8微反应池和微型两电极系统的传感芯片,利用电化学循环伏安法,将蛋白A与吡咯掺杂后共聚于工作电极表面,以此固定IgG抗体．优化蛋白A和抗体固定的实验条件,对聚合膜进行了扫描电镜（SEM）成像分析．实验结果表明,该方法操作简便、可控性强,在160S内能够有效固定蛋白A,改善抗体固定效果,与用聚吡咯修饰传感界面的方法相比,检测灵敏度提高约10％,以此实现的安培型免疫微传感器非特异性吸附小,具有较好的重复性和稳定性．     

丝素蛋白膜上vWf抗体的固定化及其体外抗凝血性能

用凝血因子的抗体对生物材料进行表面改性以提高其抗凝血性能。以丝素蛋白膜为基质，利用等离子体处理辅助的共价交联方法对vWf因子（von Wilebrand factor)抗体进行了固定化。用酶联免疫法和抗体过剩法对固定化效果进行了评价，固定化抗体的活性采用体外凝血时间（APPT，TT和PT）测定进行检测。结果显示，通过这种方法可以有效地将vWf抗体固定化，丝素蛋白膜固定化vWf抗体后，其抗凝血性能有了一定的改善。本研究结果拓宽了抗体固定化技术的应用范围，同时为抗凝血材料的设计提供了一种新的思路。