三种补肾中药有效成分对AD小鼠胚胎神经干细胞自我更新及神经元样分化作用研究

目的观察三种补肾中药补骨脂、女贞子、何首乌各自有效成分补骨脂素、齐墩果酸、二苯乙烯苷对Aβ25-35介导的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）自我更新及向神经元方向分化的调控作用。方法取孕14天昆明小鼠体外分离、培养其胚胎神经干细胞,并随机分为对照组、Aβ25-35组、Aβ25-35+补骨脂素组、Aβ25-35+齐墩果酸组、Aβ25-35+二苯乙烯苷组,其中Aβ25-35干预浓度为25 μmol/L,中药有效成分的干预浓度均为10-7mol/L,通过NSCs计数法观察NSCs增殖能力;采用Western blot及免疫荧光法观察神经元标志物Tubulin蛋白表达。计算Tubulin+/DAPI比值。结果与对照组比较,Aβ25-35组NSCs球的形态破坏,NSCs计数、Tubulin蛋白表达及Tubulin+/DAPI均降低（P<0.01,P<0.05）。与Aβ25-35组比较,3个给药组NSCs计数、Tubulin蛋白表达及Tubulin+/DAPI均升高（P<0.01,P<0.05）。结论25 μmol/L Aβ25-35可抑制NSCs自我更新及神经元样分化,而补骨脂素、二苯乙烯苷及齐墩果酸能促进NSCs的自我更新,并能促进其向神经元方向分化。     

姜黄素通过激活cAMP-PKA-CREB信号通路促进诱导多功能干细胞神经分化

目的探讨姜黄素促诱导多功能干细胞（iPSCs）定向神经分化的作用及机制。方法将分化的神经干细胞（NSCs）及神经元细胞分为空白组、姜黄素组及姜黄素+H89组，其中空白组采用维甲酸（RA）诱导培养，姜黄素组在上述基础上加入1μmol/L姜黄素，姜黄素+H89组加入1μmol/L姜黄素和20μmol/LH89（PKA抑制剂）。采用免疫荧光染色观察各组NSCs及神经元细胞的分化情况，ELISA法测定各组cAMP含量，WesternBlot法测定各组PKAc、pCREB、CREB、Nestin及MAP2蛋白表达。结果免疫荧光染色显示iPSCs经RA诱导可分化为NSCs并进一步分化为神经元细胞。在分化的NSCs及神经元细胞中，姜黄素组及姜黄素+H89组cAMP含量较空白组增加（P<0.05）；NSCs中姜黄素组Nestin、PKAc、pCREB表达较空白组均增加（P<0.05）；姜黄素+H89组Nestin、PKAc、pCREB表达较空白组及姜黄素组均减少（P<0.05）。神经元细胞中，姜黄素组MAP2、PKAc、pCREB表达较空白组均增加（P<0.05）；姜黄素+H89组MAP2、PKAc、pCREB表达较姜黄素组均减少（P<0.05）。结论姜黄素可以促进iPSCs分化为NSCs，并进一步分化为神经元细胞，而这一促进效应可能是通过激活cAMP-PKA-CREB信号通路实现。     

二苯乙烯苷对Aβ25-35致神经干细胞损伤的保护作用

目的:观察不同浓度二苯乙烯苷(TSG)对β-淀粉样肽(Aβ25-35,25μmol· L-1)致损伤的神经干细胞(NSCs)生长、增殖及自我更新能力的影响,探讨TSG对Aβ25-35致NSCs损伤的保护作用.方法:从孕14 d昆明小鼠体外提取神经干细胞,以25 μmol·L-1浓度Aβ25-35诱导NSCs建立稳定的AD细胞模型,与不同浓度二苯乙烯苷共同孵育,分为对照组、模型组(Aβ25-3525 μmol· L-1)、TSG 1×10-8mol· L-1+ Aβ25-35组、TSG 1×10-7 mol·L-1+ Aβ25-35组、TSG 1×10-6mol·L-1+ Aβ25-35组,共5组,分别采用EDU化学荧光染色法检测NSCs增殖情况;采用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测法检测不同时段NSCs的细胞活性;体外培养7d后通过神经干细胞球计数法观察NSCs的自我更新能力.结果:与模型组相比,二苯乙烯苷各剂量组均能在一定程度上抑制Aβ25-35对NSCs的损伤,细胞生长状态良好,细胞增殖率、细胞活性及神经干细胞球计数与模型组相比均有显著性差异(P＜0.01).结论:二苯乙烯苷对Aβ25-35诱导的神经干细胞损伤具有一定保护作用.     

何首乌有效成分二苯乙烯苷对Aβ_(25-31)诱导神经干细胞定向分化的影响

目的探讨何首乌有效成分二苯乙烯苷(TSG)对β-淀粉样肽(Aβ25-31)诱导神经干细胞(NSCs)定向分化的影响。方法从孕14d昆明小鼠体外提取并培养NSCs,分别建立起两组分化系统可溶性Aβ25-31体外诱导NSCs损伤的阿尔茨海默病(AD)细胞模型:神经元细胞分化模型M1(Aβ25-312 5μmol/L)、星形胶质细胞分化模型M2(Aβ25-315μmol/L)。TSG低、中、高剂量组(TSG浓度分别为10-8、10-7、10-6mol/L)分别干预模型M1和模型M2,采用WST-1细胞增殖及细胞毒性试剂盒检测各组NSCs细胞活性,采用免疫荧光法及蛋白印迹法观察各组GFAP、Tubulin阳性细胞率及其蛋白表达情况。结果模型M1组和模型M2组细胞活性A值较相应的对照组明显降低(P0.05);TSG中、高剂量组A值明显高于相应的模型组(P0.05)。与相应的对照组比较,模型M1组Tubulin阳性细胞率及其蛋白相对丰度值明显降低,模型M2组GFAP阳性细胞率及其蛋白相对丰度值明显升高(P0.05);与相应的模型组比较,TSG高剂量组Tubulin阳性细胞率及其蛋白相对丰度值均显著升高,GFAP阳性细胞率显著降低(P0.05)。结论高剂量的TSG具有促进Aβ25-31诱导的NSCs向神经元方向分化的趋势,抑制向星形胶质细胞的分化。     

开心散含药血清对Aβ_(1-42)损伤的神经干细胞增殖和分化能力的影响

目的:探讨开心散含药血清对人β淀粉样蛋白1-42(Aβ_(1-42))损伤的神经干细胞(NSCs)增殖和分化能力的影响。方法:取6月龄C57BL/6小鼠40只,分成4组,空白组给予0.9%氯化钠溶液,其他组分别给予开心散水煎液12、24、48 g·kg~(-1)制备含药血清。原代培养新生C57BL/6小鼠海马NSCs,采用Aβ_(1-42)孵育24 h诱导NSCs的阿尔茨海默病(AD)细胞模型。细胞分为5组,分别为对照组、模型组及开心散含药血清高、中、低剂量组。对照组和模型组给予10%空白血清,给药组分别给予10%的开心散48、24、12 g·kg~(-1)组含药血清;CCK-8法检测NSCs活力;免疫荧光法(IF)检测增殖条件下Ki67阳性细胞数量,分化条件下胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、中分子量神经丝蛋白(NF-M)和硫酸软骨素蛋白多糖2(NG2)阳性细胞数量及占比。结果:与模型组比较,各组开心散含药血清均能提高Aβ_(1-42)损伤的NSCs存活率,增加Ki67阳性细胞数量,并增加NF-M阳性细胞占比。结论:开心散含药血清能够提高Aβ_(1-42)损伤的NSCs的存活率,拮抗NSCs增殖和分化能力的异常。     

补益脾胃元气方药对海马神经干细胞增殖分化的影响

目的:探讨人参、大补元煎、洗心汤三组补益脾胃元气方药对海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖分化的影响。方法:从新生24小时内的Wistar胎鼠脑中分离培养海马NSCs,制备不同药物含药脑脊液并与Aβ_(1-42)共同处理海马NSCs。通过CCK8实验检测各组海马NSCs增殖率,免疫荧光法与蛋白印迹法检测海马NSCs分化为神经元与星形胶质细胞的情况。结果:含中药各实验组的海马NSCs增殖率显著高于Aβ_(1-42)处理组(P0.05);含中药各实验组海马NSCs分化为神经元与星形胶质细胞数量明显多于Aβ_(1-42)处理组(P0.05),各中药组之间对比,差异不具有统计学意义(P0.05)。结论:人参、大补元煎、洗心汤能显著促进海马NSCs增殖、诱导海马NSCs分化为神经元与星形胶质细胞。     

益肾化浊方条件培养基对神经干细胞增殖分化影响的研究

目的从JAK/STAT信号转导通路,探讨益肾化浊通过微环境调控神经干细胞(NSCs)增殖与分化,为益肾化浊方治疗AD提供部分实验依据。方法分离提取孕14 d昆明小鼠胚胎NSCs,以5μmol·L-1β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)干预建立AD细胞模型,并以不同浓度益肾化浊方共培养48h后,分别收集各组细胞培养基,使用基础培养基稀释成10%浓度条件培养基,培养正常神经干细胞,分为空白对照组,正常条培组,Aβ条培组,复方0.1μg·ml-1条培组,复方1μg·ml-1条培组,复方10μg·ml-1条培组,共6组。采用CCK-8法检测益肾化浊方条件培养基对NSCs增殖与细胞活性的影响,免疫荧光法与Western Blot法检测其对NSCs分化的影响;Western Blot与PCR法检测JAK/STAT信号转导通路关键靶点蛋白与基因表达的变化。结果与Aβ条培组相比,益肾化浊方条件培养基可促进NSCs增殖,提高其细胞活性;同时可促进NSCs向神经元分化,抑制其向星形胶质细胞分化,差异具有统计学意义(P0.05)。复方0.1μg·ml-1条培组均可明显降低STAT3、P-STAT3、Smad1、GFAP蛋白表达,下调GFAP、STAT3、Smad1基因同时上调ngn1基因表达,促进NSCs向神经元分化,差异具有统计学意义(P0.05)。结论益肾化浊方条件培养基可通过调控JAK/STAT信号转导通路,提高NSCs活性,促进神经元分化,延缓AD进展。     

益肾化浊方对Aβ25-35介导神经干细胞增殖与分化的影响

目的:观察益肾化浊方对阿尔茨海默病(AD)脑中神经干细胞(NSCs)增殖分化的影响,为益肾化浊方治疗AD提供实验依据。方法:分离孕14 d小鼠胚胎NSCs,并以β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)处理,分为空白组(正常培养基),模型组(5μmol·L-1Aβ25-35),Aβ25-35+益肾化浊方低剂量(0.1 mg·L-1)组,Aβ25-35+益肾化浊方中剂量(1 mg·L-1)组,Aβ25-35+益肾化浊方高剂量(10 mg·L-1)组,共5组,药物在Aβ25-35作用2 h后加入,培养至48 h后,进行检测。采用WST法检测益肾化浊方对NSCs增殖的影响,免疫荧光法检测其对NSCs分化的影响。结果:与空白组比较,模型组细胞活力明显降低,(GFAP+/DAPI)%比例上升,(Tubulin+/DAPI)%比例降低,差异具有统计学意义(P0.05)。与模型组相比,益肾化浊方各剂量组均可以提高Aβ25-35损伤NSCs活力,降低(GFAP+/DAPI)%比例,升高(Tubulin+/DAPI)%比例,差异具有统计学意义(P0.05),且均以低剂量组效果更为明显。结论:益肾化浊方可促进Aβ25-35介导的NSCs增殖,诱导其向神经元方向分化,抑制其向星形胶质细胞方向分化。     

蛇床子素对低分化鼻咽癌CNE2干细胞增殖、放疗敏感性的影响

目的探讨蛇床子素对低分化鼻咽癌CNE2干细胞增殖、放疗敏感性的影响及其机制。方法采用无血清培养基分离培养低分化鼻咽癌CNE2细胞的干细胞;流式细胞仪检测干细胞表面标记物CD44+/CD24-low的表达和乙醛脱氢酶(ALDH)活性;MTT检测不同质量浓度(0、20、40、80μg/m L)蛇床子素处理后,CNE2干细胞增殖能力的差异;克隆形成实验检测蛇床子素(40μg/m L)联合放疗后(0、2、5 Gy),CNE2干细胞克隆形成能力的差异;Western blotting法检测不同质量浓度蛇床子素处理、蛇床子素联合不同放射剂量放疗后,鼻咽癌CNE2干细胞中p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白的表达水平。结果在无血清培养基中可分离培养稳定传代的低分化鼻咽癌CNE2干性细胞。细胞CD44+/CD24-low、ALDH+的表达高于亲本细胞(P0.05);MTT结果显示,与对照组相比,不同质量浓度的蛇床子素作用不同时间后,干细胞增殖抑制率明显增加(P0.05),且随着蛇床子素质量浓度的增加及作用时间的延长,其抑制作用增强(P0.05);克隆形成实验结果显示,与对照组相比,各给药组干细胞克隆形成率均明显降低,蛇床子素+放疗组显著低于蛇床子素组及放疗组(P0.05);Western blotting检测结果显示,随着蛇床子素质量浓度的增加,放射剂量的增加,与对照组相比,干细胞p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1的蛋白表达水平均明显降低,蛇床子素+放疗组显著低于蛇床子素组及放疗组(P0.05);结论蛇床子素能有效抑制低分化鼻咽癌CNE2干细胞的增殖并促进其放疗敏感性,其机制可能是蛇床子素抑制肿瘤干细胞p-GSK-3、β-catenin、Cyclin D1蛋白的表达,从而抑制了干细胞增殖,促进了放疗敏感性。     

蛇床子素对TM3小鼠睾丸间质细胞增殖及雄激素合成与分泌的影响

目的:研究蛇床子素对体外培养的睾丸间质细胞雄激素合成与分泌的影响。方法:以TM3小鼠睾丸间质细胞为实验对象,采用1~320μmol/L蛇床子素干预TM3细胞24h、48h和72h,以MTT检测细胞增殖;采用5~80μmol/L蛇床子素干预TM3细胞24h和48h,RT-q PCR技术检测雄激素合成酶相关基因mRNA表达;采用80μmol/L蛇床子素干预TM3细胞15min~12h,RTq PCR技术检测即刻早期基因mRNA表达,并运用Western blot方法检测CYP17A1蛋白表达,ELISA方法检测细胞分泌液睾酮含量。结果:与对照组(Con)比较,160~320μmol/L蛇床子素作用48h和72 h均显著抑制TM3细胞增殖。不同浓度蛇床子素干预TM3细胞24h和48h后,与对照组比较,40μmol/L和80μmol/L蛇床子素显著促进类固醇急性调节蛋白(Star)基因表达;80μmol/L蛇床子素显著促进胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)基因表达;大于20μmol/L蛇床子素显著增强细胞色素P45017α1羟化酶(Cyp17a1)基因表达、尤其是干预48h上调幅度更大,但是对CYP17A1蛋白表达无明显作用;也显著促进3β类固醇脱氢酶(Hsd3b2)基因表达;大于10μmol/L蛇床子素干预24h可显著促进黄体生成素受体(Lhr)基因表达。此外,80μmol/L蛇床子素干预12h可显著促进Star和Nr4a2基因表达,作用15min~1h即可显著增强Nr4a1基因表达。且蛇床子素可升高TM3细胞睾酮水平。结论:蛇床子素具有促进小鼠睾丸间质细胞雄激素合成与分泌的药理作用。