培养基对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7诱导分化破骨细胞的影响

目的 探讨培养基对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7向破骨细胞分化的影响。方法 实验分为3组：高糖DMEM培养基组（DMEM组）;高糖DMEM/α-MEM培养基组（DMEM/α-MEM组）;α-MEM培养基组（α-MEM组）。按常规方法采用上述3种培养基进行破骨细胞培养,培养5 d后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase, TRAP）染色观察各组破骨细胞的形成情况,并采用实时荧光定量PCR方法观察破骨细胞分化相关标志物NFATc-1、c-Fos和TRAF-6 mRNA的表达;培养11 d后采用甲苯胺蓝染色进行骨陷窝面积分析,观察破骨细胞骨吸收功能情况。结果 3组均可以观察到典型的TRAP+破骨细胞。与DMEM组相比,DMEM/α-MEM组、α-MEM组TRAP+破骨细胞数量明显增加（P<0.01）,但各组形态略有不同。在骨吸收功能上,与DMEM组和DMEM/α-MEM组相比,α-MEM组骨陷窝面积明显增加（P<0.01）。在破骨细胞分化相关调控因子表达上,与DMEM组相比,α-MEM组NFATc-1、c-Fos 和TRAF-6 mRNA表达显著增加（P<0.01,P<0.05）;DMEM/α-MEM组NFATc-1 mRNA表达显著增加（P<0.01）,c-Fos 和TRAF-6 mRNA表达有增加的趋势,但差异无统计学意义;α-MEM组与DMEM/α-MEM组比较差异无统计学意义。结论 高糖DMEM培养基、高糖DMEM/α-MEM培养基、α-MEM培养基均可用于小鼠单核巨噬细胞RAW264.7诱导分化破骨细胞的实验;从破骨细胞数量、状态及功能来看,α-MEM培养基更适合做为破骨细胞分化培养基。     

薯蓣皂苷通过ERα/miR503/RANK信号通路抑制破骨细胞生成

目的 探究薯蓣皂苷对小鼠破骨细胞前体细胞(RAW264.7)破骨分化的抑制作用以及潜在机制。方法 利用核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的RAW264.7破骨分化模型,设置模型对照组、雌激素组、薯蓣皂苷低剂量组、薯蓣皂苷高剂量组,通过CCK8法检测不同浓度薯蓣皂苷对细胞的毒性作用,通过TRAP染色进行破骨细胞计数,qPCR检测细胞中ERα/miR503/RANK信号通路及破骨标志性基因TRAP、MMP9、CTSK基因表达水平,Western blot检测细胞中ERα、RANK蛋白表达水平。结果 薯蓣皂苷对RAW264.7细胞无明显毒性作用。与模型对照组比较,高剂量薯蓣皂苷组及雌激素组的TRAP阳性细胞数目下降(P<0.05),薯蓣皂苷及雌激素上调了ERα、miR-503-5p的表达水平,抑制了RANK的表达水平,下调了破骨标志性基因的表达(P<0.05)。结论 薯蓣皂苷可能通过ERα/miR-503/RANK信号通路下调破骨标志性基因,从而抑制RAW264.7细胞破骨分化。     

复合振动抑制RAW264.7细胞分化成熟

目的研究复合振动对核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的RAW264.7细胞分化的影响,探讨复合振动对破骨细胞分化的影响及机制。方法 RAW264.7细胞RANKL诱导培养3或4d并施加复合振动干预,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察TRAP阳性多核细胞形成的变化,real-time RT-PCR分析破骨细胞特异性基因组织蛋白酶K(cathepsin K),金属蛋白酶-9(MMP-9)和TRAP表达的变化。结果复合振动能抑制RANKL诱导破骨细胞形成,下调破骨细胞特异基因cathepsin K,MMP-9和TRAP的表达。结论 RANKL促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化,并增加特异基因的表达,但RANKL的促进作用受复合振动抑制。这进一步的阐释复合振动抗骨质疏松的作用机制。     

高糖及TNF-α对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响

【摘要】 目的 观察高糖及TNF-α的培养条件对RAW264.7细胞向破骨细胞诱导分化的影响。方法 在正常、高糖(30 mmol/L)及TNF-α(10 μmol/L)条件下培养RAW264.7细胞后,加入浓度为100 ng/mL的细胞核转录因子κB受体激活物的配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)为诱导剂,诱导RAW264.7向破骨细胞分化;诱导9天后,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,比较各组TRAP+细胞数,RT-PCR及Western Blot检测各组破骨细胞标志基因CTR和MMP-9的表达。结果 不同的培养条件下RANKL均能诱导RAW264.7分化为成熟的破骨细胞,其中TNF-α环境中RAW264.7形成的TRAP+阳性细胞数、CTR和MMP-9的表达最高,而在高糖环境下最低。结论 TNF-α可以促进RAW264.7向破骨细胞分化,而高糖对这个过程可能是抑制作用,这一现象符合Ⅰ型和Ⅱ糖尿病患者骨质破坏的表现;高糖及TNF-α的培养条件下RANKL对RAW264.7的作用可模拟糖尿病足病变微环境中OC的诱导分化的过程。     

CTGF对破骨前体细胞RAW264.7增殖及碳酸酐酶Ⅱ分化的影响

目的研究结缔组织生长因子(CTGF)对体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7增殖及对核因子Kappa B配体受体(RANKL)诱导体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7分化为成熟多核破骨细胞的影响。方法使用200 ng/mLCTGF干预培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7,采用3H-TdR掺入法检测RAW264.7细胞增殖率;使用200 ng/mL CTGF与RANKL单独或共同处理RAW264.7细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察TRAP阳性多核细胞,Western blot检测碳酐酶Ⅱ蛋白的表达。结果 CTGF可显著促进RAW264.7细胞增殖;200 ng/mLCTGF与RANKL共同处理RAW264.7细胞可促进RAW264.7细胞分化为成熟多核破骨细胞;200 ng/mL CTGF与RANKL共同处理RAW264.7细胞可促进RAW264.7细胞碳酐酶Ⅱ蛋白的表达。结论 CTGF促进体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7增殖,促进RANKL诱导的破骨细胞前体细胞RAW264.7分化为成熟多核破骨细胞。     

柚皮苷对共培养体系中成骨细胞活性及破骨细胞分化的影响

目的研究在成骨细胞-破骨细胞共培养体系中,柚皮苷对成骨细胞活性和破骨细胞分化的影响。方法将成骨细胞(MC3T3-E1细胞株)和破骨细胞(RAW264.7细胞株)以2∶1的比例分别培养至Transwell小室的上室和下室。根据培养基是否含有柚皮苷分为对照组和柚皮苷(2ng/ml组、20 ng/ml组、200 ng/ml组),培养7 d后对下室破骨细胞进行TRAP染色和骨吸收陷窝鉴定;荧光定量PCR分析成骨细胞骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)基因和破骨细胞分化基因活化T细胞核因子-1(NFATc-1)、活化T细胞核因子-2(NFATc-2)和核因子κB受体激活蛋白(receptor activator of NF-κB,RANK)的相对表达量。结果与对照组相比,柚皮苷可以促进成骨细胞OPG、RANKL的表达量且可提高OPG/RANKL的比值,差异有统计学意义(P0.05);20 ng/ml柚皮苷TRAP(+)细胞数(5.82±3.37)明显少于对照组(20.56±7.69),差异有统计学意义(P0.05);柚皮苷可抑制破骨细胞NFATc-1、NFATc-2的表达,促进RANK的表达,差异有统计学意义(P0.05)。结论柚皮苷可促进共培养条件体系中成骨细胞OPG和RANKL的表达以及抑制破骨细胞的分化,与上调OPG/RANKL的比值有关。     

波尔定对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响

目的研究波尔定对NF-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的小鼠单核细胞(RAW264.7)向破骨细胞(OC)分化及骨吸收功能的影响。方法采用RANKL(50 ng/ml)诱导RAW264.7细胞向OC分化,不同浓度波尔定(1、10、20、40、80μmol/L)联合分化培养。培养第4d采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,计算OC样细胞数量;比色法测定TRAP活性;Real-time PCR法检测各组OC标志性基因核因子κB受体活化因子(RANK)、活化T细胞核因子1(NFATc1)和c-fos基因的表达;CCK-8法检测波尔定对OC的毒性。培养至第9d,采用甲苯胺蓝染色并用Leica Qwin图像分析系统计算骨吸收陷窝面积。结果与对照组比较,TRAP阳性OC数量、TRAP活性、OC标志性基因RANK、NFATc1和c-fos的表达量及骨陷窝面积,随着波尔定浓度增加而减少,与对照组比较,20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L波尔定可明显减少OC数量和TRAP活性(P0.05,P0.01),下调OC标志性基因RANK、NFATc1和c-fos的表达量及骨陷窝面积(P0.05),但以上浓度波尔定对OC均未产生毒性。结论波尔定对RANKL诱导的RAW264.7细胞向OC的分化及骨吸收功能具有抑制作用。     

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）的培养及其在诱导破骨细胞中的应用

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)是通过Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后得到的细胞株。RAW264.7细胞在医学研究中应用十分普遍:它是许多白血病相关研究模型的常用细胞株;在微生物学、免疫学等研究中也十分常用;同时也是小鼠源性破骨前体细胞,可通过特定细胞因子的诱导在体外获得成熟破骨细胞,因此也成为许多骨骼疾病研究的体外模型。但RAW264.7细胞形态和分化状态多变,在实际培养中较难把握,给科研工作带来了一定困难。科研工作者在RAW264.7细胞的培养方法、细胞的形态及分化状态等方面始终观点不一,对于用RAW264.7细胞在体外诱导获得破骨细胞的方法也有许多差别。本文结合文献资料及实践,探索了RAW264.7细胞的培养条件,冻存、复苏、传代方法,以及用核因子κB受体活化因子配基(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导其成为成熟破骨细胞的技术关键;旨在总结RAW264.7细胞的培养及诱导其分化为破骨细胞的经验教训,探讨RAW264.7细胞的培养和在体外用RANKL诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的方法、技巧,供广大科研工作者借鉴。     

诱导小鼠破骨前体细胞成熟分化的实验条件探讨

目的探讨小鼠单核细胞RAW264.7能否在RANKL诱导下向破骨细胞成熟分化。方法 RANKL作用RAW264.7细胞7天～9天,光镜、透射电镜、扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)分别观察其细胞形态学变化,用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察TRAP阳性的多核细胞,RT-PCR检测破骨细胞表型和功能基因表达变化情况,扫描电镜观察破骨细胞在骨片上形成骨吸收陷窝。结果光镜、透射电镜下可见细胞胞体增大,为椭圆形或不规则形,胞核5～10个,扫描电镜下可见细胞表面大量的伪足样突起;此外,RANKL能诱导RAW264.7细胞分化为TRAP染色阳性的多核破骨细胞,细胞多为超过5个核的多核巨细胞;RAW264.7细胞成熟分化后具有骨吸收功能,并且能上调Cathepsin-K、TRAP、RANK等典型破骨细胞表型和功能基因mRNA的表达。结论 RAW264.7细胞是一种较好的破骨前体细胞模型,单用50ng/ml的RANKL体外连续诱导7天以上,能明显促进它向成熟的破骨细胞分化。     

槲皮苷抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及骨吸收

[目的]探讨槲皮苷对核因子κB受体激动剂配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)诱导的破骨细胞形成及骨吸收功能的影响。[方法]通过CCK-8法观察不同浓度槲皮苷(0~800μmol/L)干预不同时间(48 h、96 h)对RAW 264.7细胞的生存影响,确定合适的体外用药浓度;利用体外RANKL诱导RAW 264.7细胞形成破骨细胞体系,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色计数评价槲皮苷(200、400μmol/L)对破骨细胞形成和生存的影响;通过骨片吸收实验对骨凹陷和骨吸收面积统计分析评价槲皮苷(200、400μmol/L)3 d内对成熟破骨细胞骨吸收功能的影响;釆用实时定量(Real-Time)PCR技术,检测槲皮苷(200、400μmol/L)对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因NFATc1、TRAP和c-fos表达水平的影响。[结果]细胞生存实验发现槲皮苷干预96 h后,槲皮苷(0~800μmol/L)对RAW 264.7细胞4 d内生存未发现显著影响;通过TRAP染色发现200、400μmol/L槲皮苷能显著抑制体外RANKL诱导的破骨细胞形成;通过骨片吸收实验发现200、400μmol/L槲皮苷3d内能显著降低骨吸收面积,提示其抑制成熟破骨细胞骨吸收功能;同时,槲皮苷能呈剂量依赖性抑制RANKL诱导活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)c1、TRAP和c-fos基因表达。[结论]槲皮苷通过抑制NFATc1,TRAP和c-fos的表达,来抑制体外RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收功能,是一种潜在治疗骨质疏松药物。     

破骨细胞参与时IGF-1对成骨细胞的促同化作用

目的探讨IGF-1对成骨细胞(osteoblast,OB)的促同化作用是否需要破骨细胞(Osteoclast,OC)的协同。方法体外培养MC3T3小鼠成骨细胞及RAW264.7小鼠单核巨噬细胞,RAW264.7细胞经核因子κB受体活化因子配基(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)诱导分化为破骨细胞。以50 ng/ml重组人胰岛素样生长因子-1(rhIGF-1)分别干预成骨细胞及分化成熟的破骨细胞,Wstern blotting验证IGF-1受体的活化。以0、10、50、100 ng/ml的rhIGF-1分别干预成骨细胞、破骨细胞及共培养的成、破骨细胞。12 h后终止培养,收集破骨细胞经IGF-1干预后的条件培养基(OC conditioned medium after IGF-1 treatment,OCCM)对另一组新接种的成骨细胞干预12 h。ELISA检测3组成骨细胞培基中骨钙素(bone Gla protein,BGP)、RANKL的含量,Real-time PCR检测成骨细胞中Bgp基因的表达。结果 RANKL诱导培养8 d后RAW264.7细胞形成TRAP阳性,成熟的多核破骨细胞;Wstern blotting检测表明rhIGF-1可有效得使成、破骨细胞中的IGF-1受体发生磷酸化;ELISA与Real-time PCR测定结果显示,IGF-1直接干预OB时,Bgp基因表达水平和培养基中BGP及RANKL蛋白的含量均与无干预的对照组无明显区别;而OCCM干预及共培养的OB组,当IGF-1初始干预浓度为10 ng/ml时BGP、RANKL含量及Bgp基因的表达水平显著提高,共培养组与OCCM培养组间无明显区别。结论 IGF-1对OB的促同化作用依赖于OC的参与,两种细胞间的联系可能是通过可溶性的细胞因子来完成。     

Transwell小室内建立小鼠成骨-破骨细胞共培养体系

目的 :Transwell小室内建立体外小鼠成骨-破骨细胞共培养体系,并检测体系对成骨及破骨细胞活性的影响。方法:体外培育小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分化为成熟破骨细胞后,于Transwell小室内建立成骨-破骨细胞共培养体系。通过CCK-8实验、茜素红染色、TRAP染色检测细胞的成骨、破骨活性。采用PCR、Western Blot方法检测成骨细胞MC3T3-E1中OPG、ALP、RANKL、TGF-b1的基因表达以及RANKL的蛋白表达,检测破骨细胞RANK、NF-κB的基因表达和蛋白表达。结果 :小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠破骨细胞可在Transwell小室内建立共培养体系;共培养体系影响小鼠成骨细胞与破骨细胞的分化活性,镜下可见成骨细胞分化增多,破骨细胞分化稍减少。共培养体系中成骨细胞基因OPG(0.65±0.08)、ALP(0.16±0.01)较单独培养OPG(1.00±0.08)、ALP(1.01±0.16)表达下降,而TGF-b1(4.42±0.21)、RANKL(4.12±1.04)较单独培养组TGF-b1(1.00±0.10)、RANKL(1.00±0.09)表达上升;破骨细胞相关RANK(0.63±0.06)、NF-κB(0.64±0.08)基因表达较单独培养组的RANK(1.00±0.08)、NF-κB(1.00±0.09)下降,差异均有统计学意义。同时共培养组的OPG(0.43±0.05)、NF-κB(0.59±0.05)的蛋白表达较单独培养组的OPG(0.84±0.06)、NF-κb(1.13±0.03)减少;共培养组RANKL(0.54±0.03)的蛋白表达则较单独培养组的RANKL(0.31±0.03)增加,差异有统计学意义,均与基因表达变化趋势一致。结论:小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠破骨细胞可在Transwell小室内建立共培养体系,共培养体系中成骨细胞活性高于破骨细胞活性。     

IL-6对RAW264. 7细胞成熟分化的体外实验研究

目的探讨研究白介素-6(Interleukin-6,IL-6)对核因子NF-κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear kappa B ligand,RANKL)及对破骨前体细胞的成熟分化和溶骨效应。方法破骨前体细胞RAW264.7细胞经50ng/mL RANKL诱导1 d后将其分为:1、空白对照组(RANKL+PBS)2、低浓度IL-6组(RANKL+50ng/mL IL-6)3、中浓度IL-6组(RANKL+100ng/mL IL-6)4、高浓度IL-6组(RANKL+150ng/mL IL-6)。连续培养9 d后,进行HE染色检测成熟破骨细胞生成量;通过抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色法观察TRAP阳性多核细胞的情况;运用扫描电镜检测破骨细胞在骨片上的骨吸收陷窝形成情况。结果 HE染色中,成熟破骨细胞生成量中、高浓度IL-6组明显少于低浓度IL-6组(P0.05),低浓度IL-6组和空白对照组间无明显差别(P0.05)。②通过TRAP染色后,经染色阳性区域面积与视野面积的百分比计算,中、高浓度IL-6组与明显少于低浓度和空白对照组(P0.05)。③扫描电镜观察发现骨吸收陷窝面积与视野面积的百分比随着IL-6浓度的增高,相比空白对照组有显著减少,且高浓度IL-6组中陷窝形成最少(P0.05)。结论 IL-6能直接作用于经RANKL诱导的RAW264.7细胞,能明显抑制破骨细胞激活分化,并降低破骨细胞所致的骨吸收效应。当IL-6浓度超过50ng/mL时,其抑制破骨细胞的骨吸收效应更加明显。     

RANK信号调控破骨细胞分化与成熟的研究进展

破骨细胞来源于微环境造血前体细胞,它的生存、增殖、分化和激活需要巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)参与。RANKL与相应的RANK受体结合,从而刺激破骨前体细胞分化成为破骨细胞。这一过程由不同的调节蛋白和激酶来调控,并且依赖于RANKL-RANK信号。本文中,笔者总结了目前已知的在破骨细胞发生过程中调节RANK信号的机制。在早期阶段,RANK信号的调节通过募集调节蛋白如肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6),引起丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)以及转录因子核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)和激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)的活化。活化的NF-κB进一步激活调节破骨细胞生成的重要因子-T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1, NFATc1)。在信号传递的中间阶段,共刺激信号通过激活磷脂酶Cγ2(phospholipase Cγ2, PLCγ2)连同c-Fos/AP-1引起钙离子(Ca~(2+))振荡,同时Ca~(2+)信号促进NFATc1的产生。在破骨细胞生成的晚期阶段,NFATc1入核诱导大量的破骨细胞特异性靶基因的表达,从而使细胞融合并发挥其功能。     

骨保护素体外抑制小鼠单核巨噬细胞 成熟分化的实验研究

目的研究骨保护素（Osteoprotegerin, 0PG)抑制核因子NF-KB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear kappa B ligand,RANKL)诱导小鼠单核细胞RAW264. 7成熟分化而导致的溶骨效 应。方法50 ng/mL RANKL诱导RAW264. 7细胞1 d后,加人100 ng/mL 0PG(实验组,即0PG + RANKL组）或不加人0PG(对照组,即RANKL组）分别培养7 d和9 d,经细胞形态学观察其变化,抗 酒石酸酸性碟酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色法观察TRAP阳性多核细胞,扫描 电镜下观察在骨片上的破骨细胞所致的骨吸收陷窝形成情况。结果对照组培养7 d时,在倒置相 差显微镜、透射电镜、光镜下可见细胞形状为椭圆形或不规则形,胞体明显较KAW264.7细胞增大, 胞核多为6 ~ 10个,扫描电镜下还可见大量伪足形成,而实验组培养7 d后,细胞形状多为圆形,且扫 描电镜下未见明显伪足形成;对照组9 d时可见大量TRAP染色阳性的多核巨细胞（含3个或3个以 上的细胞核）,而实验组中TRAP染色阳性的多核破骨细胞偶见多核巨细胞,培养9 d时很难找到多 核巨细胞;仅用RANKL诱导RAW264.7细胞分化7 d时,对照组中破骨细胞表面可见大量伪足伸出, 并形成明显的骨吸收陷窝,实验组中破骨细胞见少许伪足突出,不能看到明显的骨陷窝形成。结论 单用50 ng/mL RANKL体外连续诱导RAWM4.7细胞7 d时,可以促进成熟的破骨细胞显著分化。 100 ng/mL 0PG培养9 d能有效地抑制破骨细胞的分化,减少破骨细胞的骨吸收效应。     

阿司匹林通过抑制大鼠破骨细胞 RANK 表达抑制骨质吸收

目的：研究不同浓度阿司匹林对体外培养大鼠破骨细胞（Osteoclast, OC）RANK（receptor activator of nuclear factor-κB,核因子κB受体活化因子）表达的影响。方法采用RANKL和M-CSF诱导大鼠骨髓单核巨噬细胞破骨分化模型,给予不同浓度的阿司匹林（0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L）和雌激素（雌二醇10-6 mmol/L）处理,而后进行抗酒石酸酸性磷酸酶（ The tartrate-resistant acid phosphatase ,TRAP）染色观察细胞形态特征,扫描电镜观察骨磨片破骨细胞骨吸收陷窝,RT-PCR技术检测破骨细胞表面RANK基因的表达,ELISA法检测RANK蛋白的表达。结果阿司匹林和雌激素都可以使大鼠破骨细胞成熟分化程度和骨吸收活性降低,抑制破骨细胞RANK基因和蛋白的表达,且阿司匹林的抑制作用具有剂量依赖性。结论阿司匹林对大鼠破骨细胞RANK的表达有抑制作用且呈剂量依赖性,从而抑制破骨细胞的成熟分化及骨吸收功能。     

姜黄素对类风湿关节炎破骨细胞分化中NF-κB p65和NFATc1表达的影响

目的研究姜黄素(curcumin,Cur)对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)破骨细胞(osteoclast,OC)分化中核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)p65、活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1,NFATc1)表达的影响。方法密度梯度离心法分离RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),经核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)诱导培养为OC,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色及骨吸收功能检测鉴定OC,分别用不同浓度(0、2.5、5及10μmol/L)的Cur进行干预。采用CCK-8法进行Cur细胞毒性检测;计数TRAP染色阳性细胞数;Western-blotting检测NF-κB p65、NFATc1蛋白的表达;免疫荧光染色检测NF-κB p65核易位。结果 CCK-8结果示,Cur2.5、5和10μmol/L的浓度对PBMC未产生细胞毒性;TRAP染色结果示,Cur抑制RANKL诱导的RA-OC分化;Westernblotting结果示,经不同浓度Cur干预后,NF-κB p65在细胞浆中的表达明显升高,在细胞核中的表达明显降低,NFATc1的蛋白表达明显降低;免疫荧光染色结果示Cur抑制NF-κB p65核易位。结论 Cur能明显抑制NF-κB的入核表达,降低NFATc1的表达,从而抑制RA-OC的分化。     

艾拉莫德对类风湿关节炎外周血破骨细胞分化及破骨细胞相关基因表达的影响

目的观察艾拉莫德对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)外周血破骨细胞分化形成及破骨细胞相关基因表达的影响。方法使用人核因子kB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)及人巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)诱导RA患者外周血淋巴细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)分化为成熟破骨细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色进行鉴定。CCK-8法筛选艾拉莫德抑制破骨细胞形成的浓度。观察艾拉莫德25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL对RA患者PBMCs生成破骨细胞的影响,RT-PCR法检测不同浓度艾拉莫德对破骨细胞分化过程中TRAP、组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)、细胞核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)、激活蛋白-1(Activator protein-1,AP-1)mRNA表达的影响。结果 100 ng/mL RANKL和50 ng/mL M-CSF在第14天将RA患者PBMCs诱导为破骨细胞。CCK-8检测结果显示艾拉莫德25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL三个浓度对PBMCs细胞活力无明显影响,且均能抑制破骨细胞的生成,以25μg/mL组最为显著。艾拉莫德能抑制TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA的表达水平,且随艾拉莫德浓度的升高抑制作用越明显。结论艾拉莫德通过抑制破骨细胞特异性基因表达来抑制破骨细胞分化、增殖。     

不同浓度金属磨损颗粒对破骨细胞体外分化的影响

[目的]观察不同浓度金属磨损颗粒对RAW 264.7在体外分化成破骨细胞的影响,明确浓度与破骨细胞分化数量的关系.[方法]真空球磨法制备人工关节磨损颗粒:RANKL诱导RAW 264.7体外分化成破骨细胞,通过TRAP染色,电镜扫描检测骨片吸收陷窝来鉴定破骨细胞;不同浓度人工关节磨损颗粒混悬液作用RAW 264.7,并用RANKL诱导后第7 d,TRAP染色后,光镜下计数破骨细胞数量.[结果]不同浓度磨损颗粒作用于RAW 264.7 7 d后,显微镜下计数破骨细胞数量,结果显示随着磨损颗粒混悬液浓度增加,RANKL诱导生成的破骨细胞增多,低、中、高浓度3组破骨细胞数均显著高于空白对照组(P<0.05),中、高浓度组破骨细胞数均显著高于低浓组(P<0.05),高浓度组破骨细胞数亦显著高于中浓组(P<0.05).[结论](1)RAW 264.7是一种较好的破骨前体细胞模型,RAW 264.7诱导形成破骨细胞的方法简便易行,所获得破骨细胞均一性好;(2)人工关节金属磨损颗粒为RAW264.7细胞向具有骨质吸收功能的破骨细胞转化发挥正向作用,而且与混悬液的浓度有量效关系.