泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体的制备

目的探讨制备泡沫细胞相关基因4多克隆抗体的方法。方法将从人胎肝文库经聚合酶链反应扩增获得的泡沫细胞相关基因4基因全长cDNA序列，通过生物信息学分析，预测泡沫细胞相关基因4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域．并进行了多序列比对，并根据蛋白质的亲疏水性、二级结构、偶联难度及实验难度等，确定泡沫细胞相关基因4抗原13肽PKLVKEEVFWRNY，采用固相多肽合成法合成该抗原片段．偶联后经过基础免疫，6次加强免疫，经追踪检测，于第四次免疫后10～14天颈动脉放血，分离血清，冷冻抽干，-20℃保存而制备了泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体。结果用固相多肽合成法成功制备了泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体，该抗体经间接酶联免疫吸附测定法检测其效价为1：16000，Western blot检测可见40kDa处有目的带，用免疫组织化学方法从HepG2细胞中检测到泡沫细胞相关基因4蛋白表达，证实该抗体具有较好的反应性和特异性。结论固相多肽合成法省时、省力、制备的抗体效价高；泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体的制备，为进一步研究泡沫细胞相关基因4蛋白在动脉粥样硬化中的功能作用奠定了基础。     

应用合成多肽技术制备肺癌转移相关蛋白1多克隆抗体的研究

目的应用人工合成多肽技术制备肺癌转移相关蛋白1(Lung Cancer Metastasis-Related Protein1,LCMR1)的多克隆抗体。方法运用生物信息学技术和人工合成多肽方法制备LCMR1特异性多肽,鉴定纯度后与牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白进行偶联制备多肽抗原,然后免疫新西兰雄性白兔,获得抗血清,经亲和层析法纯化后,用ELISA法鉴定抗体效价,用Western Blot鉴定特异性。结果成功获得了LCMR1的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1:100 000,Western Blot免疫印迹结果显示其具有抗原特异性识别。结论应用免疫原性肽抗体技术成功制备了LCMR1的多克隆抗体,为今后深入了解LCMR1基因的生物学功能提供了有用的研究工具。     

庚型肝炎病毒与GBV—B胞膜E1区抗原位点抗原性分析

本文应用Goldkey软件在分析了HGV／GBV—C与GBV—B胞膜E1区5’端部分氨基酸序列的抗原表位和亲水性等基础上，人工合成了处于同一区域的多肽，但其氨基酸序列的同源性只为8．3％。计算机分析可见该2肽的空间构象有一定相似性。对该2段合成肽分别作包被抗原进行EIA检测。结果表明，以2肽作抗原检测部分人群中的相关抗体所得结果，阳性及阴性符合率高选85%以上。由此表明HGV／GBV—C与GBV—B在胞膜E1区5’端至少存在一个共同的抗原表位。     

芯片法筛选钩端螺旋体外膜蛋白抗原表位

目的 通过芯片法筛选钩端螺旋体主要外膜蛋白中抗原表位,为后续研制有广泛交叉保护作用的通用钩体疫苗提供科学依据。方法 采用PCR及测序法检测主要外膜蛋白编码基因在不同血清群钩体中的分布情况及其序列相似性。采用生物信息学软件预测钩体外膜蛋白抗原表位。采用抗体纯化磁珠试剂盒纯化大鼠抗不同血清群钩体抗血清IgG。采用抗原芯片法检测各抗原肽的免疫反应性,确定优势抗原表位。结果 候选抗原蛋白编码基因均广泛存在于不同血清群的致病性钩体中且序列保守。综合生物信息学软件结果预测出30个候选T-B联合抗原表位。合成短肽结合芯片检测方法共筛选出9个优势抗原表位,各抗原肽对不同血清群钩体抗血清IgG反应性基本一致。结论 芯片法可高效筛选钩体外膜蛋白优势表位,为表位肽疫苗的研制提供支持。     

血管壁细胞人突触相关蛋白的表达

目的　目前尚无文献报道人突触相关蛋白与脂蛋白代谢和泡沫细胞形成、凋亡的关系。本文研究氧化型低密度脂蛋白致THP 1细胞泡沫化过程中人突触相关蛋白基因的表达 ,用制备的兔抗人突触相关蛋白多克隆抗体检测其在血管细胞及肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。方法　THP 1细胞用 16 4 0培养 ,PMA处理诱导其向巨噬细胞分化 ,实验组加氧化型低密度脂蛋白(终浓度 80mg/L) ,对照组不加氧化型低密度脂蛋白。根据人突触相关蛋白基因序列设计引物 ,以看家基因GAPDH为内对照 ,反转录—聚合酶链反应半定量检测人突触相关蛋白基因的表达。用特异的抗人突触相关蛋白的多克隆抗体 ,采用免疫组织化学或流式细胞术检测人突触相关蛋白在人内皮细胞、平滑肌细胞、THP 1细胞和肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。结果　人突触相关蛋白基因在氧化型低密度脂蛋白致THP 1细胞泡沫化过程中表达增高 ,与抑制消减杂交结果一致。免疫组织化学或流式细胞术检测 ,人突触相关蛋白在人内皮细胞、平滑肌细胞、THP 1细胞和肝癌细胞系HepG2细胞中均有表达 ,主要定位在细胞质 ,与该基因的生物信息学分析结果一致。结论　人突触相关蛋白在多种细胞中均有表达 ,人突触相关蛋白基因在单核细胞泡沫化过程中表达增高 ,可能与单核细胞源性泡沫化细胞形成     

抗弓形虫水通道蛋白多肽抗体的制备及鉴定

目的 研制抗弓形虫水通道蛋白(TgAQP)的特异性多肽抗体,并应用于检测弓形虫ME49株中水通道蛋白的表达和亚细胞定位。方法 根据TgAQP氨基酸序列设计B细胞抗原多肽,并将合成的多肽与KLH偶联作为免疫原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA、Western blot和免疫荧光的方法对所得抗体进行鉴定。结果 选定并合成抗原表位多肽,与KLH偶联作为免疫原制备多克隆抗体;经ELISA测定其多肽抗体效价达1∶40 000; Western blot表明制备的抗体能特异地识别天然弓形虫中29.9 kDa处的条带,与预测的TgAQP相对分子量大小相符;免疫荧光检测到抗血清识别的蛋白定位于弓形虫胞质中。结论 制备了抗弓形虫水通道蛋白多肽的多克隆抗体,为进一步研究弓形虫水通道蛋白的生物学功能和代谢特点奠定了基础。     

抗HIV p24多肽单克隆抗体和抗血清的制备及初步应用

检测p2 4抗原的诊断试剂在AIDS研究和防治方面具有重要意义。为研制国产HIVp2 4抗原诊断试剂 ,根据国内外文献 ,合成了HIVp2 4抗原的六个肽段 :G -A 12 ,D -R 16 ,P -S 18,A -G 2 3(HIV - 2ROD) ,P -S 18,N -I 15以及D -C 2 2。六个肽段中 ,N -I 15肽和D -C 2 2肽用于制备McAb ,其余 4个用于制备山羊抗血清。除D -R 16肽的滴度较低 (1∶2 0 0 0 )外 ,其余三个肽的抗血清滴度都在 1∶10 0 0 0以上。McAb中 ,N -I 15肽的反应比D -C 2 2肽要强 ,但两者的腹水滴度相同 ,均为 1∶10 0 0。单抗铺板检测病毒 p2 4抗原的非特异性反应比较强。用山羊抗血清铺板 ,1∶80 0 0的稀释度检测效果最好。用我们研制的抗体检测不出裂解HIV - 1ⅢB中 p2 4 ,却能够测出Abbott公司p2 4抗原诊断试剂盒的阳性对照 (HIVAG - 1)。用北海道大学免疫科学研究所研制的单抗和人阳性血清做的交叉对照实验表明 ,可能是由于合成肽免疫产生的抗体与裂解病毒p2 4的亲和力较差引起     

妊娠相关血浆蛋白A重组抗原表位分析及抗体制备

目的探讨妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)的抗原表位及抗PAPP-A抗体制备方法。方法把PAPP-A的CDS序列翻译成氨基酸序列,利用互联网分析蛋白的疏水性和信号肽区段,利用DNAstar软件分析二级结构、表面可及性、亲水性、抗原指数以及柔韧性,综合分析抗原表位。通过分子生物学技术制备重组PAPP-A,进而免疫新西兰家兔制备抗PAPP-A抗体。结果 PAPP-A抗原性较强,抗原优势表位位于23～94、1 110～1 131氨基酸区段;PAPP-A重组蛋白以及抗PAPP-A抗体制备成功。结论本研究方法建立了PAPP-A的高灵敏免疫检测体系,能进一步提高PAPP-A的临床应用价值。     

蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素特异性优势抗原表位肽的抗原性分析

目的筛选蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫,Giardia lamblia)α-8贾第素(α-8 giardin)的优势抗原表位肽,并分析其抗原性。方法采用DNAstar、Biosun软件及CLUSTAL W软件进行生物信息学分析,筛选出贾第虫α-8 giardin的3个优势抗原表位肽,即G1(7~17 aa)、G2(30~40 aa)和G3(296~306 aa);3个抗原表位肽分别与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联后(KLH-G1、KLH-G2、KLH-G3)免疫雌性青紫蓝家兔(每组2只),分别行背部皮下多点(8~10点)免疫注射,首次免疫各偶联蛋白0.5 mg/只(每点100μl)。分别于首次免疫后14、21、28 d进行加强免疫(各偶联蛋白0.2 mg/只),于每次免疫前进行兔耳缘静脉采血,末次加强免疫后7 d颈动脉取血(各50 ml)。用间接ELISA检测3种(KLH-G1、KLH-G2和KLH-G3)免疫抗血清中Ig G抗体效价;蛋白质印迹(Western blotting)分析3种免疫抗血清与重组蛋白r Giardin的抗原性。结果利用生物信息学相关软件筛选出的贾第虫α-8 giardin 3个候选抗原表位肽分别与KLH偶联后获得3个偶联蛋白(KLH-G1、KLH-G2、KLHG3),经纯化后蛋白浓度分别为0.66、0.95和0.25 mg/ml。分别于加强免疫家兔后7 d,ELISA检测结果显示,3种(KLH-G1、KLH-G2、KLH-G3)免疫抗血清的抗体效价分别为1:12800,1:51200,1:51200;SDS-PAGE分析结果显示,经纯化后的3种抗血清均在相对分子质量(Mr)约36 000处出现特异性的清晰条带,无其它杂带。Western blotting分析结果显示,3种抗血清均可特异性识别重组蛋白r Giardin。结论筛选出的贾第虫α-8 giardin 3个优势抗原表位肽与KLH偶联后免疫家兔,可诱导产生特异性Ig G抗体;3种免疫抗血清中的特异性Ig G抗体均可识别重组蛋白r Giardin;3个贾第虫α-8 giardin抗原表位肽均有较好的抗原性。     

重组多肽酶联免疫吸附法检测抗Scl-70抗体的初步应用

目的制备人Scl-70抗原207～765位氨基酸片段融合蛋白作为自身抗原,探讨ELISA检测抗Scl-70抗体的敏感性和特异性。方法构建编码Scl-70抗原第207至第765位氨基酸片段的重组体,在宿主菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白,经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化后,免疫印迹法鉴定抗原性,ELISA检测北京协和医院免疫科血清库中系统性硬化（SSc）及部分其他结缔组织病患者血清抗Scl-70抗体。结果重组融合蛋白在宿主菌中获得可溶性表达,免疫印迹法鉴定表明其能与标准抗Scl-70抗体阳性血清反应,而与正常血清、其他抗血清无反应。在36份SSc患者血清中,天然抗原免疫双扩散（DID）法共检出的6份阳性血清用重组多肽ELISA检测有5份呈阳性,30份经天然抗原DID法检测为阴性的血清用重组多肽ELISA检测有3份呈阳性;20份其他结缔组织病患者血清用重组多肽ELISA检测均为阴性。结论重组的207—765位氨基酸片段是Scl-70抗原的主要抗原表位区域,以重组多肽为基质ELISA检测抗Scl-70抗体的敏感性较高,为进一步研究抗体水平与临床病情变化的相关性奠定了基础。     

血型A抗原模拟多肽与抗A抗体的分子对接

目的：从分子结构水平研究血型A抗原及其模拟多肽（肽P1 QIWYERTLPFTF,肽P2EYWYCGMNRTGC）与血型A抗体的相互作用。方法：利用Chimera软件构建血型A抗原模拟多肽（P1,P2）的三维结构;将天然血型A抗原及其模拟多肽通过Autodock软件与血型A抗体Fv段（PDB：1jv5）对接。结果：天然血型A抗原和多肽P1、P2都能与1jv5分子中一个由疏水性氨基酸组成的凹槽对接,且对接部位重叠。天然A抗原和P1可以与1jv5形成2个氢键,且天然抗原和模拟多肽都能够与1jv5中的多个氨基酸相合作用。结论：通过生物信息学计算软件成功模拟了血型A抗原及其模拟多肽与抗体1jv5的相互作用情况。此2个模拟多肽是从功能上对天然A抗原进行模拟的。     

蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素特异性多克隆抗体的制备及免疫电镜定位研究

目的制备针对蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素的特异性抗体,免疫胶体金电镜观察该贾第素的亚细胞定位。方法生物信息学分析并合成α-4贾第素抗原肽,与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联后免疫新西兰白兔,Protein A亲和层析纯化抗血清,采用α-4贾第素重组蛋白和贾第虫滋养体全虫体裂解物通过Western blot验证抗血清结合力和结合特异性,选择高特异性抗体通过免疫胶体金电镜观察α-4贾第素的亚细胞定位。结果筛选出3段可能的抗原肽,合成的抗原肽与KLH偶联后免疫兔得到高效价抗血清,Protein A纯化效果良好;3种纯化抗血清均能与α-4贾第素结合,其中anti-P2具有较高的抗原结合特异性。采用anti-P2进行免疫胶体金电镜,显示α-4贾第素主要定位于鞭毛,胞浆也有少量散在表达。结论制备的α-4贾第素多克隆抗体具有抗原结合特异性。用anti-P2进行免疫胶体金电镜,α-4贾第素主要定位于贾第虫鞭毛。     

人工合成ADP／ATP转运蛋白多肽在扩张型心肌病的初步探讨

报告人工依据心肌线粒体ＡＤＰ／ＡＴＰ转运蛋白（ＡＮＴ）的氨基酸序列合成的１１肽的多肽，用间接微固相放射免疫法检测了扩张型心肌病（ＤＣＭ）患者用此多肽和天然ＡＮＴ作抗原检测的抗体结果，符合率达９４％且相关性良好（ｒ＝０．８７）。ＤＣＭ抗ＡＮＴ多肽抗体的检出阳性率为３１％，阳性患者的心衰病程多短于１年。风湿性心脏病、缺血性心脏病及健康对照者均未发现此种抗体，提示ＤＣＭ发病与自身免疫反应有关，用人工合成ＡＮＴ抗原决定簇替代其天然完整蛋白，在ＤＣＭ诊断及治疗上可能具有一定价值。     

FRG4基因全长克隆及生物信息学分析

为了对新的人突触相关蛋白FRG4进行全长克隆及生物信息学分析,从人胎肝文库PCR扩增FRG4基因全长cDNA序列,用生物信息学方法 对FRG4基因进行基因组结构分析、多序列同源性比较、跨膜区段、亲疏水性分析、功能结构域预测等.结果 表明cDNA文库基础上运用热启动PCR获得FRG4全长cDNA序列,生物信息学分析显示FRG4基因与人类的突触相关蛋白有99%同源性;定位在X染色体的短臂2区2带2亚带2次亚带;由9个外显子和8个内含子组成;无跨膜区段;有一结构域BSD;该基因编码蛋白可能为一水溶性蛋白.     

弓形虫抗血清IgG的制备及其检测效果研究

目的比较弓形虫不同免疫原所制备抗血清 IgG 的检测效果,优选高效价的抗体诊断试剂。方法制备弓形虫的细胞质抗原(C)、代谢抗原(S)。用抗原 C、C S、S 及活虫(P)各免疫2只家兔,收集抗血清经纯化而获得 IgG 抗体(多抗)并制备酶标记抗体;用上述4种多抗与对应的多抗-HRP 组合成4种双抗体夹心型 ELISA,检测人血清 CAg 和 C、S 抗原,评价试剂的敏感性;抗血清与疟原虫、隐孢子虫等抗原进行交叉反应性试验,评价试剂的特异性;采用捕获法检测人血清 IgM 抗体,比较4种多抗-HRP 的检测效果。结果各种 ELISA 夹心法同步检测 CAg 阳性标本7例,阴性样本8例,均未出现假阴性和假阳性反应,其 OD 均值的 P/N 比值依次为 C C 组33.5、S S 组27.8、CS CS 组21.2、P P 组13.2;C 和 S 抗原的最低检出量均为0.5μg/ml;与其它寄生虫未出现交叉反应。4种多抗-HRP 同步检测IgM 抗体阳性标本3例,阴性样本7例,均未出现假阴性和假阳性反应,其 OD 均值的 P/N 值最高的是抗 C-HRP。结论 4种抗体用于检测人血清 IgM 抗体、CAg、C 和 S 抗原以及其它抗原的结果表明,各种抗体试剂均具有良好的敏感性和特异性,其中以抗 C 抗体试剂最为满意。(2)4种组合形式的夹心ELISA,检测弓形虫抗原的差异无统计学意义,表明弓形虫 C 和 S 抗原间存在着共同抗原成分。     

Mi-2抗原的制备抗Mi-2抗体的检测及其意义

目的　制备Mi 2抗原 ,测定自身免疫性结缔组织疾病 (CTD)中的抗Mi 2抗体 ,并初步探讨其临床意义。方法　制备兔胸腺丙酮粉 ,提取粗Mi 2抗原 ,用离子交换层析法纯化抗原。应用免疫双扩散法检测 315份CTD和 4 0份正常对照血清中的抗Mi 2抗体。分析抗Mi 2抗体在CTD中的分布 ,并比较皮肌炎 (DM)患者中抗Mi 2抗体阳性组与阴性组的临床特点。结果　自制的Mi 2抗原与标准Mi 2抗血清免疫双扩散出现清晰的沉淀线。经DE5 2离子交换层析 ,Mi 2抗原在 0 1～0 2mmol LNaCl洗脱组分中被检出。抗Mi 2抗体在DM和多发性肌炎中的阳性率分别为 2 6 1%(12 4 6 )和 4 5 %(2 4 4 )。在其他CTD和正常人均未检测到抗Mi 2抗体。抗Mi 2抗体对DM的特异性为 99 4 %。对DM而言 ,阳性组多以皮肤损害为首发表现 ,病程中多出现V型或围巾型皮疹 ;而阴性组常以肌肉症状首发 ,病程中发热多见 ,两组间差异有显著性 (P <0 0 5 )。结论　兔胸腺丙酮粉中含有Mi 2抗原成分。抗Mi 2抗体是一种对DM诊断较为特异的自身抗体 ,该抗体阳性的DM可能是DM中的另一亚型。     

日本血吸虫23kD抗原表位及多价疫苗的初步研究

目的　研究日本血吸虫 2 3kD抗原表位及日本血吸虫 2 3kD抗原大亲水区多肽 (LHD -Sj2 3)与脂肪酸结合蛋白(SjFABP)两个基因重组抗原联合免疫小鼠的保护效果。 方法　人工合成血吸虫 2 3kD抗原中一段可诱导T细胞和B细胞免疫应答的抗原表位多肽p14 ,与鸡白蛋白偶联后免疫小鼠。用LHD -Sj2 3和SjFABP两个基因重组抗原联合免疫大鼠 ,观察诱导的免疫保护效果。结果与结论　人工合成肽 p14诱导了 2 2 2 2 %～ 30 18% (P <0 0 5～ 0 0 0 1)的减虫率。用LHD -Sj2 3和SjFABP两个基因重组抗原免疫大鼠时 ,分别获得 32 14 %和 31 85 %的减虫率 (P >0 0 5 ) ,当用这两种基因重组抗原联合免疫大鼠时 ,获得了 4 7 2 8%的减虫率。加强抗原表位及“鸡尾酒”疫苗研究 ,可为寻找更高保护作用的抗血吸虫病疫苗提供基础。     

弓形虫循环抗原诊断试剂的研究

目的　比较弓形虫不同免疫原所制备抗体检测CAg的效果 ,优选高效价的抗体诊断试剂。 方法　制备弓形虫的细胞质抗原 (C)、代谢抗原 (S)。用抗原C、C +S、S及活虫各免疫 2只家兔 ,收集抗血清经纯化而获得IgG抗体 (多抗 )并制备酶标记抗体 ;用上述 4种多抗与多抗 -HRP组合成 16种双抗体夹心型ELISA ,检测人血清CAg和C、S抗原 ,评价试剂的敏感性 ;抗血清与疟原虫、隐孢子虫等抗原进行交叉反应性试验 ,评价试剂的特异性。结果　各种ELISA夹心法同步检测CAg阳性样本 7例 ,阴性样本 8例 ,均未出现假阴性和假阳性反应 ,其OD均值的P/N比值依次为C +C组 33 5、S +S组 2 7 8、CS +CS组 2 1 2、P +P组 13 2 ;C和S抗原的最低检出量均为 0 5 μg/ml;与其它寄生虫未出现交叉反应。 结论　 (1) 4种抗体用于检测人血清CAg、C和S抗原以及其它抗原的结果表明 ,各种抗体试剂均具有良好的敏感性和特异性 ,其中以抗C抗体试剂最为满意。 (2 ) 16种组合形式的夹心ELISA ,检测弓形虫抗原的差异无统计学意义 ,表明弓形虫C和S抗原间存在着共同抗原成分。     

肝癌和癌旁肝组织中癌基因多肽产物抗体的制备及初步应用研究

采用Microgenie微机处理系统分析人胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)、IGF-Ⅱ受体和C-fms癌基因cDNA的核苷酸顺序亲水性及空间结构,选择不同的氨基酸之间亲水性密集片断,经多肽合成仪以固相法进行全合成。用合成的三种基因多肽片断为抗原,分别免疫家兔制备成抗IGF-Ⅱ、IGF-Ⅱ受体和C-fms基因多肽产物抗体。采用免疫印迹法对3例配对的肝癌及癌旁肝组织进行初步应用研究,结果提示三种基因的异常过量表达与肝癌的发生关系密切。     

重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定

目的：构建人神经肽Y（NPY）基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清。方法：取已构建好且经测序确认无误的再组质粒pET28a—NPY转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a—NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果经IPTG诱导含有pET28a—NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础。