用SiRNA沉默SSAT基因表达降低人A549肺癌细胞对抗癌多胺类似物CPENSpm的敏感性

目的 探讨精脒/精胺乙酰转移酶(Spermidine/Spermine N1-Acetyltransferase,SSAT)基因表达沉默对多胺类似物CPENSpm抗瘤活性的影响。方法 用SiRNA技术获得SSAT基因表达沉默的人A549肺癌细胞株,QT-RT-PCR 法用于分析SSAT基因的表达水平,MTT法检测细胞的存活率,DNA片段化分析和流式细胞/亚凋亡峰分析检测细胞凋亡状况。结果 成功获得SSAT基因表达沉默的人A549肺癌细胞株。用10 μmol·L^-1 CPENSpm处理对照细胞24 h可使SSAT mRNA 水平升高23倍,但在SSAT表达沉默的细胞中CPENSpm无此影响。细胞增殖实验发现,SSAT表达沉默的细胞对CPENSpm (0~20 μmol·L^-1 )的药物敏感性显著性低于对照细胞。细胞凋亡分析发现,10 μmol·L^-1 CPENSpm处理细胞48 h导致对照细胞出现凋亡细胞典型的DNA片段化现象和亚凋亡峰,但在SSAT表达沉默的细胞株中,CPENSpm诱导细胞凋亡的能力明显减弱。结论 CPENSpm诱导肿瘤细胞内SSAT高表达可能是其抗癌药理活性的分子基础之一。     

siRNA抑制精胺氧化酶的表达可降低人A549肺癌细胞对多胺类似物CPENSpm的敏感性

目的研究精胺氧化酶(spermine oxidase,SMO)基因表达抑制对多胺类似物CPENSpm抗瘤活性的影响。方法用siRNA技术获得SMO基因表达抑制的人A549肺癌细胞株,QT-RT-PCR法和酶活性分析法用于鉴定SMO基因的表达水平,MTT法检测细胞的存活率,DNA降解分析和流式细胞/亚凋亡峰分析检测细胞凋亡状况。结果成功获得SMO基因表达抑制的人A549肺癌细胞株。用SMO-siRNA质粒转染的细胞中,SMO mRNA和酶活性的基础水平分别降低53%和14%。用10μmol·L-1 CPENSpm处理对照细胞24h可使SMO mRNA和酶活性分别升高10倍和20倍,但在SMO-siRNA质粒转染的细胞中,这种药物对SMO的表达诱导被抑制。细胞增殖实验发现,SMO表达抑制的细胞对CPENSpm(0～20μmol·L-1)的药物敏感性低于对照细胞。细胞凋亡分析发现,与对照细胞相比,CPENSpm诱导SMO表达,抑制细胞发生细胞凋亡的能力明显减弱。结论CPENSpm诱导肿瘤细胞内SMO高表达可能是其抗癌药理活性的分子基础之一。     

多胺类似物CPENSpm通过干扰多胺代谢抑制肺癌细胞的增殖

目的研究多胺类似物CPENSpm对肺癌细胞株A549增殖和细胞凋亡的影响,以探讨CPENSpm抗肿瘤的作用机制。方法MTS法分析细胞的增殖速度,化学分析法测定多胺代谢酶的活性,HPLC法分析细胞内的多胺含量,亚凋亡峰测定法和DNA片段化分析法鉴定细胞程序性凋亡。结果CPENSpm处理A549肺癌细胞可导致:①癌细胞生长抑制并激发细胞凋亡;②抑制多胺合成关键酶ODC的活性,活化多胺降解代谢关键酶SSAT和SMO的活性;③耗竭细胞内多胺含量。SMO抑制剂MDL72527可拮抗CPENSpm对A549细胞的生长抑制作用。结论CPENSpm通过干扰A549细胞的多胺代谢途径,耗竭肿瘤快速生长必需的多胺成分,诱导产生活性氧H2O2从而抑制癌细胞生长并激发细胞程序性凋亡。     

7- 二氟甲氧基-5, 4′- 二- 正辛烷氧基金雀异黄素诱导肺癌A549 细胞凋亡

目的研究7二氟甲氧基-5,4＇二正辛烷氧基金雀异黄素（7-difluorom＋hoxyl-5,4＇-di-n-octylgenistein,DFOG）诱导人肺癌A549细胞凋亡作用。方法体外培养A549细胞。二氟甲基化或烷基化得到一系列金雀异黄素衍生物。MTT法测定细胞活力;碘化丙啶（PI）染色流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带;Western blot分析Bcl-2和Bax蛋白表达。结果 9个金雀异黄素衍生物较先导化合物GEN具有更强的抗肿瘤活性。其中DFOG对A549细胞活性显示最强的抑制作用,IC50为3.9μmol·L^-1。DFOG（2.0、4.0和8.0μmol·L^-1）作用48h的细胞凋亡率依次增高。8.0μmol·L^-1DFOG处理A549细胞48h导致典型DNA梯形条带形成。8.0μmol·L1DFOG处理A549细胞6h、12h和24h,Bcl-2蛋白表达水平下降,而Bax蛋白表达上升。结论 DFOG诱导A549细胞凋亡作用与其增高Bax/Bcl-2比值有关。     

大豆苷元对人非小细胞肺癌A549、H1299细胞增殖、迁移能力的影响及机制

目的探究大豆苷元(daidzein,Daid)对非小细胞性肺癌细胞株A549和H1299增殖、迁移能力的影响及可能机制。方法以A549和H1299为研究对象,CCK-8法检测Daid(0,5,10,25,50,100,200μmol·L^-1)抑制A549和H1299两种细胞的增殖情况。划痕和Transwell小室实验检测Daid对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。Western blot检测Cleaved Caspase-3和LC3Ⅱ/Ⅰ等的蛋白表达。结果与对照组相比,Daid在体外可明显抑制肺癌细胞的增殖,且抑制作用呈浓度依赖关系。Daid(100μmol·L^-1)可明显降低人肺癌细胞A549和H1299的迁移侵袭能力。Western blot结果显示,Daid(100μmol·L^-1)预处理后,两种肺癌细胞的Cleaved Caspase-3及LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高。结论Daid可抑制人非小细胞肺癌A549和H1299细胞的增殖,使上述细胞的迁移侵袭能力明显下降,其机制可能与Daid诱导细胞凋亡及自噬有关。     

三氧化二砷对人肺腺癌细胞凋亡及LRP、MRP基因表达的影响

目的探讨三氧化二砷（As2O3）对人肺腺癌细胞凋亡和LRP、MRP基因表达的影响。方法选用人肺腺癌A549细胞株,运用体外细胞培养法,MTT法,流式细胞术检测As2O3对人肺腺癌的抑制和诱导凋亡作用;用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测LRP、MRP mRNA的表达。结果As2O3对人肺腺癌A594细胞具有抑制作用．其抑制率呈时间-剂量依赖关系。不同浓度的As2O3均可诱导凋亡。1．0μmol·L^-1、2．0μmol·L^-1。浓度的As2O3可下调LRP、MRP mRNA的表达。结论As2O3具有诱导人肺腺癌细胞凋亡的作用,其机制与其下调LRP、MRP mRNA的表达密切相关。     

姜黄素诱导人肺腺癌A549细胞脱落凋亡作用的研究

目的检测姜黄素诱导人肺腺癌细胞(A549)脱落凋亡的作用。方法采用DNA ladder法,流式细胞仪(FCM)技术结合PI及AnnexinV-FITC双标记染色试验方法及W estern-b lot法观察姜黄素是否能诱导A549脱落凋亡。结果A549细胞具有抗脱落凋亡的特性,而10μmol.L-1的姜黄素即可引起悬浮培养的A549细胞发生脱落凋亡。结论姜黄素可诱导人肺腺癌细胞(A549)脱落凋亡。     

芍药苷对肺腺癌细胞A549凋亡的诱导作用

目的:研究芍药苷对肺腺癌A549细胞凋亡的诱导作用。方法:以0(阴性对照)、5、10、20、40μmol/L芍药苷培养A549细胞48 h后,以MTT法检测A549细胞活力。上述浓度芍药苷培养A549细胞24 h后,酶标法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性;Western blot法检测Bcl-xl、Bax、核因子κB p65(NF-κB p65)、磷酸化核因子κB p65(NF-κB pp65)蛋白表达。结果:与阴性对照比较,5~40μmol/L芍药苷培养A549细胞48 h后,细胞活力减弱;5~40μmol/L芍药苷培养细胞24 h后,细胞Caspase-3活性、Bax蛋白表达增强;10~40μmol/L芍药苷培养细胞24 h后,细胞Bcl-xl蛋白表达减弱,NF-κB pp65蛋白表达减弱;以上差异均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论:芍药苷可诱导A549细胞凋亡,其机制可能与激活NF-κB信号通路、调节相关基因表达有关。     

紫花牡荆素诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及其机制的探讨

目的探讨紫花牡荆素（CAS）诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及其机制。方法平皿集落法测定CAS对A549细胞生长的抑制作用;碘化丙啶（PI）染色流式细胞术（FCM）分析细胞凋亡率;丫啶橙／溴乙啶（AO／EB）荧光染色观察细胞凋亡形态;Westernblot检测FoxMl（forkhead box protein M1）表达水平。结果CAS能抑制人肺腺癌A549细胞生长,呈浓度依赖性,半数抑制浓度（IC50）值为7．26p．mol·L^-1;CAS处理后A549细胞呈典型凋亡细胞形态学改变,诱导细胞凋亡呈浓度依赖性;CAS诱导A549细胞FoxM1蛋白表达下调,呈浓度和时间依赖性。结论CAS抑制人肺腺癌A549细胞的生长并诱导其凋亡,其作用机制可能与FoxM1表达下调有关。     

海蓬子皂苷甲调控SHP/STAT信号通路抗肝癌的研究

目的研究海蓬子皂苷甲(bigelovii A,BA)诱导细胞凋亡的作用及其机制。方法使用MTT实验检测BA对肿瘤细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪分析BA对细胞凋亡的影响;Western blot分析p-STAT3、STAT3、p-STAT5、STAT5、SHP-1、SHP-2的表达。结果20和40μmol·L^-1 BA可诱导HepG2细胞发生凋亡,具有剂量依赖性。10、20和40μmol·L^-1 BA可抑制IL6诱导的STAT3和STAT5磷酸化,但酪氨酸磷酸酶抑制剂过钒酸钠可逆转该抑制作用,且20μmol·L^-1 BA能激活蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2。结论BA可能通过SHP-1/SHP-2和STAT3/STAT5通路诱导HepG2细胞凋亡。     

大鼠心肌多胺代谢限速酶ODC、SSAT活性分析

目的建立大鼠心肌多胺代谢限速酶鸟氨酸脱羧酶(ODC)及精脒/精胺乙酰转移酶(SSAT)活性分析方法。方法以Langendorff离体灌流心肌为实验材料,制备心肌组织匀浆;分别以dl[114C]Ornithine及[114C]acetylCoenzymeA为底物,以液体闪烁计数仪记录生成的14CO2及[14C]acetylspermidine的放射活度,并以其代表ODC,SSAT的活性;计算大鼠心肌ODC、SSAT的酶促反应动力学参数,筛选出适宜的底物浓度;同时观察一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)对酶活性的影响。结果①大鼠心肌ODC、SSAT基础活性分别为:(9.67±3.09)nmol·mg-1Pro·h-1;(3.59±0.91)nmol·mg-1Pro·min-1。②ODC催化LOrnithine的酶促反应动力学参数Km=(54.95±8.14)μmol·L-1;Vmax=(2.364±0.37)nmol·mg-1·h-1;SSAT催化AcetylCoenzymeA的酶促反应动力学参数Km=(12.87±1.88)μmol·L-1;Vmax=(0.50±0.07)nmol·mg-1·min-1。③大鼠心肌ODC、SSAT活性检测的底物浓度分别为:90μmol·L-1(18.5kBq)DL[114C]Ornithine及36μmol·L-1(2.96kBq)[114C]acetylCoA。④SNP呈浓度依赖性地抑制ODC的活性、诱导SSAT的活性。结论建立了大鼠心肌多胺代谢限速酶鸟氨酸脱羧酶(ODC)及精脒/精胺乙酰转移酶(SSAT)活性的分析方法,该方法简便易行;根据Km值确定测定大鼠心肌ODC及SSAT?     

DLL4/Notch信号途径对A549细胞VEGF表达的影响

目的：研究Delta-like ligand 4（DLL4）与血管内皮生长因子（VEGF）在人肺腺癌A549细胞中的表达,以及DLL4对VEGF表达的影响。方法（1）用免疫组化检测DLL4与VEGF在A549细胞中的表达;（2）设计和化学合成靶向DLL4基因的小干扰RNA（siRNA）序列,用lipofectamineTM2000介导DLL4 siRNA转染人A549细胞;（3）提取细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增检测DLL4、VEGF mRNA;（4）用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测A549细胞培养上清液中VEGF质量浓度。结果（1）DLL4、VEGF表达于A549细胞的细胞质内;（2）DLL4 siRNA可使DLL4沉默,同时,明显上调VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C mRNA表达,差异有统计学意义（P＆lt;0.05）;（3）DLL4转染后,细胞培养上清液中VEGF质量浓度明显增加,差异有统计学意义（P＆lt;0.01）。结论阻断A549细胞中Notch通路可刺激VEGF过表达。     

Small interfering RNA suppression of polyamine analog-induced spermidine/spermine n1-acetyltransferase

N1,N11-diethylnorspermine (DENSPM) is a polyamine analog that down-regulates polyamine biosynthesis and potently upregulates the polyamine catabolic enzyme spermidine/spermine N1-acetyltransferase (SSAT). In certain cells, such as SKMEL-28 human melanoma cells, induction of SSAT is associated with rapid apoptosis. In this study, we used small interfering RNA (siRNA) to examine the role of SSAT induction in mediating polyamine pool depletion and apoptosis. siRNA duplexes were designed to target three independent sites in the SSAT mRNA coding region (siSSAT). When transfected under nontoxic conditions, two of the duplexes selectively reduced basal SSAT mRNA in HEK-293 cells by >80% and prevented DENSPM-induced SSAT mRNA by 95% in SK-MEL-28 cells. Treatment of SK-MEL-28 cells with 10 muM DENSPM in the presence of 83 nM siSSAT selectively prevented the 1400-fold induction of SSAT activity by approximately 90% and, in turn, prevented analog depletion of spermine (Spm) pools by approximately 35%. siSSAT also prevented DENSPM-induced cytochrome c release and caspase-3 cleavage at 36 h and apoptosis at 48 h as measured by annexin V staining. Overall, the data directly link analog induction of SSAT to Spm pool depletion and to caspase-dependent apoptosis in DENSPM-treated SK-MEL-28 cells. This represents the first use of siRNA technology directed toward a polyamine gene and the first unequivocal demonstration that SSAT induction initiates events leading to polyamine analog-induced apoptosis.     

槲皮素通过miR-101/EZH2轴介导的EMT途径改善NSCLC吉西他滨耐药的机制研究 #br#

目的 从微小RNA-101（miR-101）/Zeste基因同源蛋白2（EZH2）轴的角度探究槲皮素逆转非小细胞肺癌 （NSCLC）上皮间质转分化（EMT）及吉西他滨（Gb）耐药性的分子机制。方法 用不同浓度槲皮素培养A549及A549/ Gb，CCK-8法筛选适宜的槲皮素浓度进行后续试验；取A549细胞分为空白组、A549+EMT诱导剂组、A549+槲皮素 组、槲皮素+EMT诱导剂组；A549细胞和A549/Gb分为A549组、A549/Gb组、A549/Gb+槲皮素组、A549/Gb+EMT诱导 剂组、miR-101-inhibitor组、槲皮素+miR-101-inhibitor组、miR-NC组；实时荧光定量PCR（qPCR）检测各组miR-101 表达水平；Western blot法检测EZH2、转化生长因子（TGF）-β1、果蝇母亲DPP同源物4（SMAD4）、p-SMAD4和EMT标 志蛋白E钙黏蛋白（E-cadherin）、N钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表达；CCK-8法检测各组细胞光密度 （OD）值，并计算半数抑制浓度（IC50）及耐药指数（IR）。结果 槲皮素对A549及A549/Gb的IC50分别为64、128 μmol/L。 EMT诱导剂增强A549细胞EMT特性（N-cadherin及Vimentin表达升高，E-cadherin表达降低）后，A549细胞miR-101 表达降低，EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表达水平，IC50及IR升高（P＜0.05）；槲皮素可抑制A549细胞EMT 特性、降低IC50及IR，并上调miR-101，抑制EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表达（P＜0.05）；EMT诱导剂可逆 转槲皮素的上述作用（P＜0.05）。与 A549 细胞相比，A549/Gb 细胞的 EMT 特性增强，IC50、IR、EZH2、TGF-β1、pSMAD4/SMAD4表达均升高（P＜0.05）；抑制miR-101或EMT 诱导剂处理，均可进一步增强A549/Gb 细胞的EMT 特 性，升高IC50、IR，上调EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表达（P＜0.05）；槲皮素可抑制A549/Gb细胞的EMT进 程、降低其IC50、IR及EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表达（P＜0.05）；抑制miR-101表达可逆转槲皮素的上述 作用（P＜0.05）。结论 槲皮素可通过上调miR-101，抑制EZH2表达，进而抑制EMT进程，降低NSCLC细胞耐药性。     

Effect of thymoquinone on hepatorenal dysfunction and alteration of CYP3A1 and spermidine/spermine N-1-acetyl-transferase gene expression induced by renal ischaemia-reperfusion in rats

Objectives Renal ischaemia–reperfusion (I/R) is a well‐characterised model of acute renal failure that causes both local and remote organ injury. The aim of this work was to investigate the effect of thymoquinone, the main constituent of the volatile oil extracted from Nigella sativa seeds, on renal and hepatic changes after renal ischaemia–reperfusion. Methods Male Sprague‐Dawley rats were divided into sham I/R vehicle‐treated groups, and I/R thymoquinone‐treated groups. Thymoquinone (10 mg/kg, p.o.) was administered for ten consecutive days to the I/R thymoquinone group before injury. I/R and I/R thymoquinone groups were subjected to 30‐min ischaemia followed by 4‐h reperfusion. Key findings I/R resulted in a significant increase in malondialdehyde (MDA) level and decreases in glutathione‐S‐transferase (GST) and superoxide dismutase (SOD) activity in liver and kidney tissues. Thymoquinone treatment caused the reversal of I/R‐induced changes in MDA as well as GST and SOD activity. Moreover, I/R caused a significant rise in creatinine and alanine aminotransferase serum levels. CYP3A1 mRNA expression was induced significantly by I/R in both liver and kidney tissues compared with sham group. Thymoquinone reduced significantly this increase. I/R caused induction of mRNA expression of spermidine/spermine N‐1‐acetyl‐transferase (SSAT), a catabolic enzyme that participates in polyamine metabolism, in liver and kidney tissues. Thymoquinone reduced SSAT mRNA expression significantly in liver and markedly in kidney. Conclusions These findings suggested that thymoquinone protected against renal I/R‐induced damage through an antioxidant mechanism as well as the decrease of CYP3A1 and SSAT gene expression.     

miR-552通过PTEN/AKT信号通路促进非小细胞肺癌A549细胞的恶性生物学行为

目的 探讨miR-552通过调控PTEN/AKT信号通路促进人非小细胞肺癌A549细胞的恶性生物学行为及其相关机制。方法 通过qRT-PCR检测人肺癌组织样本和人非小细胞肺癌A549细胞系中miR-552、PTEN mRNA的表达情况;通过Western blotting检测PTEN、AKT、p-AKT蛋白的表达情况;通过CCK-8检测miR-552表达对A549细胞增殖能力的影响;通过Transwell小室检测miR-552表达对A549细胞迁移和侵袭能力的影响;通过流式细胞术检测miR-552表达对A549细胞凋亡能力的影响。结果 miR-552在肺癌组织和A549细胞中的表达显著上调。过表达miR-552可显著促进A549细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡,而抑制其表达则结果相反。与癌旁组织相比,肺癌组织中PTEN表达显著下调。过表达miR-552可下调PTEN蛋白表达,上调p-AKT蛋白表达,对AKT蛋白无影响,而抑制其表达则结果相反。结论 miR-552可能通过PTEN/AKT信号通路促进人非小细胞肺癌A549细胞的恶性生物学行为。     

Spermidine/spermine n(1)-acetyltransferase catalyzes amantadine acetylation.

Amantadine acetylation was demonstrated to occur both in vivo and in vitro using transgenic male mice overexpressing spermidine/spermine N(1)-acetyltransferase (SSAT). We previously reported that neither NAT1 nor NAT2 was responsible for catalyzing acetylation of the primary amine group of amantadine. We hypothesized that the inducible polyamine-catabolizing enzyme, SSAT, was an alternate pathway for acetylating amantadine. Transgenic mice injected s.c. with 3 mg/kg amantadine excreted 4.5 +/- 1% (mean +/- S.E.) of the administered dose as acetylamantadine in 24-h urine samples while, by contrast, nontransgenic control mice failed to excrete any detectable acetylamantadine in their urine. In vitro studies with the cytosolic liver fraction from transgenic mice as the source of SSAT demonstrated spermidine acetylation catalytic activity with an apparent K(m) = 267 +/- 46 microM and V(max) = 0.009 +/- 0.002 nmol/min/mg of protein. Amantadine competitively inhibited spermidine acetylation with an apparent K(i) = 738 +/- 157 microM. Incubation of amantadine, SSAT, and an acetyl CoA-regenerating system produced modest amounts of acetylamantadine. The NAT2 substrate, sulfamethazine, inhibited spermidine acetylation with a calculated K(i) = 3.5 mM, suggesting that SSAT may be an alternate pathway for acetylation of NAT2 substrates. The NAT1 substrate, p-aminobenzoic acid, had no inhibitory effect. These results provide evidence that amantadine can be acetylated by SSAT and may be a specific drug substrate for this enzyme. Further investigation of the role of SSAT as a potential drug-metabolizing pathway is warranted.     

靶向调控AQP4对非小细胞肺癌细胞化疗敏感性的调控作用

摘要：目的 探讨靶向沉默水通道蛋白4（AQP4）基因对非小细胞肺癌细胞化疗敏感性影响,并研究其分子作用 机制。方法 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）和 Western blot 分别检测非小细胞肺癌 A549 细胞以及顺铂耐药菌株 A549/DDP中AQP4 mRNA和蛋白的表达。设计靶向AQP4的siRNA-1和siRNA-2,采用siRNA抑制A549/DDP细胞 中AQP4的表达,筛选出最优siRNA,将其转染A549/DDP细胞,设立siRNA-NC组和空白对照组。CCK-8法检测细胞 增殖能力并计算各组细胞的半数抑制浓度（IC50）;流式细胞术检测细胞凋亡。Western blot检测P53和Bcl-2蛋白的 表达。结果 AQP4 mRNA和蛋白在A549/DDP细胞中的表达水平显著高于A549细胞,AQP4表达沉默后A549/DDP 细胞增殖抑制,细胞凋亡增加,对顺铂的敏感性增加,凋亡相关蛋白P53表达增加,而Bcl-2蛋白表达降低。结论 通 过靶向调控AQP4的表达可以增加非小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性。