雷帕霉素联合环孢素对肾移植患者长期存活的影响

目的研究雷帕霉素(Rapa)联合环孢素(CsA)对移植肾患者长期存活的影响及机制。方法①40例肾移植患者,其中20例术后采用CsA和泼尼松(CsA组),20例采用Rapa联合CsA和泼尼松(Rapa组);随访5 a,分析临床和移植肾活检资料。②不同浓度Rapa干预CsA诱导的人脐静脉内皮细胞(ECV304),用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法和3H-亮氨酸掺入法测定细胞DNA和蛋白质合成,免疫印迹(Western blot)检测细胞信号蛋白p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、细胞外信号调节激酶(ERK2)表达的变化。结果①Rapa组a 3和a 5 Ccr水平均低于CsA组(P<0.05);a 5移植肾活检组织学比较,Rapa组慢性指数(CI)比CsA组明显降低,分别为(4±0.6)vs(7±1.4),差异有统计学意义(P<0.05),其中移植肾血管病变降低最明显。②Rapa各浓度组与CsA组比较,均抑制血管内皮细胞DNA和蛋白质的合成,cpm值呈剂量依赖性下降。③R10组和R100组与C1000组比较p70S6K表达明显下降(P<0.05),而ERK2的表达在Rapa不同浓度组中均无明显变化。结论Rapa联合CsA的免疫抑制方案有利于移植肾长期存活,可能与降低CsA的肾毒性,尤其是抑制移植肾血管内皮细胞的增生,阻断PI3K-p70S6K信号通路有关。     

PI3K/Akt抑制剂CCT128930抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖与血管生成的实验研究

目的探讨一类新的PI3K/Akt抑制剂CCT128930对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖与血管生成的影响。方法采用MTT法检测CCT128930对HUVEC存活的影响;流式细胞术分析细胞周期变化;AnnexinⅤ-FITC试剂盒检测细胞凋亡;体外小管形成实验观察CCT128930对HUVEC体外小管形成的影响;免疫印迹法检测蛋白表达水平。结果CCT128930可通过阻滞细胞于G1期而抑制HUVEC的增殖,且抑制作用呈剂量依赖性,但对HUVEC的凋亡无影响;HUVEC经CCT128930处理后,体外小管形成能力受到明显抑制;低浓度的CCT128930抑制内皮细胞中VEGF的表达,但对Akt的磷酸化水平无影响。结论 CCT128930能够抑制HUVEC的增殖与血管生成,其抑制血管生成活性可能与其调控VEGF的表达水平相关。     

PI3Kα抑制剂BYL719抑制脐静脉血管内皮细胞增殖及血管生成的研究

目的 探讨PI3Kα抑制剂BYL719对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖与血管生成的影响。方法 采用MTT法测定BYL719对HUVEC活力的抑制作用;用流式细胞术检测BYL719对其细胞周期的影响;体外小管形成实验观察BYL719对血管生成的影响;western blot检测Akt、p-Akt、cyclinD1和CDK4蛋白表达水平的变化。结果 BYL719抑制了HUVEC中Akt的磷酸化水平;BYL719作用细胞后,HUVEC的细胞活力显著降低;BYL719能够通过下调cyclinD1和CDK4的表达而阻滞细胞于G1期,进而抑制HUVEC的增殖;HUVEC经BYL719处理后,体外小管形成能力受到显著抑制。结论 BYL719降低了HUVEC中Akt的磷酸化水平,能够抑制HUVEC的细胞增殖和血管生成。     

中药抑制血管平滑肌细胞增殖的新途径-mTOR

血管平滑肌细胞异常增殖是动脉粥样硬化等多种疾病的病理基础。哺乳类雷帕霉素靶蛋白（mTOR）可被PKB磷酸化后激活．作用于下游信号分子，具有调控细胞的存活、增殖和凋亡等重要功能。雷帕霉素能特异性地与mTOR结合，抑制下游底物活化．阻止下游底物的活化．阻止细胞周期进程。某些中药的有效成分可作用于PI3K—mTOR通路，抑制血管平滑肌细胞增殖。     

槲皮素抑制血管生成作用的实验研究

目的　研究槲皮素 (Quercetin)对血管生成和培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)的影响。方法　采用生长因子 (血管内皮细胞生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF)诱导的鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管增生模型观察槲皮素对血管生成的影响 ;利用培养的HUVEC ,用MTT法观察槲皮素抑制内皮细胞增殖的作用 ;流式细胞仪观察槲皮素对HUVEC细胞周期的影响。结果　槲皮素 (0 1、0 0 5和 0 0 2 5mmol·L-1)能明显抑制VEGF诱导的CAM小血管生成 ;槲皮素 (0 1和 0 0 5mmol·L-1)能明显抑制bFGF诱导的CAM小血管生成 ;槲皮素 (2 4 0、12 0 μmol·L-1和 6 0 μmol·L-1)对内皮细胞增殖有抑制作用 ,抑制率分别为 6 7 0 %、5 8 1%和39 7% ;槲皮素 (2 4 0、12 0 μmol·L-1)能显著导致HUVEC的S、G2 期阻滞。结论　槲皮素能抑制VEGF和bFGF诱导的血管生成 ,且对内皮细胞增殖具有抑制作用。     

抵抗素通过ERK 1/2信号途径诱导人血管平滑肌细胞增殖

抵抗素与动脉粥样硬化具有相关性。血管平滑肌的增殖是动脉粥样硬化形成的关键步骤。血管平滑肌表达抵抗素。研究旨在评估抵抗素是否诱导血管平滑肌增殖以及其具体机制。人血管平滑肌细胞以不同浓度抵抗素干预。3H-掺入法检测提示抵抗素呈剂量依赖性诱导细胞增殖。为获得更多抵抗素作用机制我们研究了细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号途径。抵抗素作用后人血管平滑肌细胞出现ERK 1/2磷酸化。ERK磷酸化特异抑制剂U0126显著抑制抵抗素诱导的人血管平滑肌细胞ERK 1/2磷酸化以及细胞增殖。研究结果表明抵抗素通过ERK 1/2信号途径诱导人血管平滑肌细胞增殖。这可能是抵抗素导致动脉粥样硬化的机制之一。     

Losartan和CGRP对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖作用的影响

目的比较非肽类血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型阻断剂氯沙坦(Losartan)和血管活性肽降钙素基因相关肽(CGRP)对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖作用的影响,为探讨此两类物质的降压机制提供实验依据。方法采用MTT,3H-参入法和流式细胞仪分别测定血管紧张素Ⅱ刺激下,Losartan或CGRP干预下血管平滑肌细胞的增殖变化,W est-ern b loting法测定不同状态下血管平滑肌细胞内ERK1/2的活性变化。结果Losartan或CGRP能抑制血管紧张素Ⅱ刺激下血管平滑肌细胞的生存率、DNA合成、细胞周期增殖指数,以及细胞内ERK1/2的活性,并呈剂量依赖性。而且,CGRP抑制作用强于Losartan。结论Losartan或CGRP能抑制血管紧张素Ⅱ刺激下血管平滑肌细胞增殖,其细胞内的信号传导途径与ERK1/2有关。     

肝素十二糖对血管平滑肌细胞增殖作用的研究

目的:研究肝素十二糖(dp12)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖作用的影响,并分析其分子水平的作用机制。方法:通过以10%新生牛血清诱导牛胸主动脉血管平滑肌细胞增殖建立模型,然后考察实验室精制的不同浓度的肝素寡糖对血管平滑肌细胞增殖作用的影响;四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测dp12对VSMCs增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期分布;RT-PCR法检测ERK1/2转录变化情况;Western Blotting法检测ERK1/2和p-ERK1/2的表达。结果:MTT结果显示不同浓度的dp12可以明显抑制由10%新生牛血清诱导的血管平滑肌细胞的增殖;细胞周期实验揭示dp12抑制血清诱导的VSMCs从G1期进入S期,影响细胞周期;dp12通过下调ERK基因的转录进而下调ERK1/2的表达,此外dp12抑制ERK1/2的磷酸化进而影响细胞增殖。结论:dp12使VSMCs在G1期/S期阻滞,通过抑制ERK基因的转录和ERK蛋白的磷酸化抑制VSMCs增殖,可能是dp12抗VSMCs增殖的机制之一。     

下调血管生成素样蛋白7表达对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨下调血管生成素样蛋白7(Angptl7)表达对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法 采用CCK-8法检测AngⅡ诱导的VSMC生长,流式细胞术检测下调Angptl7蛋白表达对细胞周期的影响。分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测转染后细胞中Angptl7 mRNA和Angptl7、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E1、p21、Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果 采用1μg/mL的AngⅡ处理24 h能提高VSMC活力(0.63±0.06 vs.0.37±0.06)(P<0.01),促进Angptl7 mRNA和蛋白的表达(3.05±0.21 vs.0.97±0.06和1.61±0.14 vs.1.01±0.12)(P<0.01)。下调Angptl7蛋白表达可抑制CDK2、细胞周期蛋白E1和Bcl-2蛋白的表达,促进p21和Bax蛋白的表达(P<0.05)。结论 AngⅡ能促进VSMC增殖,上调Angptl7 mRNA和蛋白表达。下调Angptl7表达可抑制AngⅡ诱导的V...     

活血软坚方在斑马鱼和内皮细胞模型上的促血管新生作用及其机制研究

目的研究活血软坚方(SEHM)在斑马鱼和内皮细胞模型上的促血管新生作用及其作用机制。方法建立内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VEGFR tyrosine kinase inhibitor II,VRI)诱导的斑马鱼节间血管损伤模型,在倒置荧光显微镜下观察活血软坚方在不同浓度下对节间血管的保护作用和对斑马鱼肠下静脉的干预作用;Real-time PCR检测活血软坚方在不同浓度干预下斑马鱼体内flt-1、kdr、kdrl的mRNA表达;MTT法检测活血软坚方对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的毒性作用和促增殖作用;Western blot检测同一浓度下,6、12、24 h 3个时间段各组细胞Akt、p38、p-p38、p44/42、p-p44/42以及VEGFR-1的蛋白表达情况。结果活血软坚方对斑马鱼肠下静脉有明显的促血管新生作用(P<0.01),对VRI诱导的斑马鱼节间血管损伤有保护作用(P<0.01);且可明显促进VRI抑制的斑马鱼体内flt-1、kdr、kdrl mRNA的表达(P<0.05);与对照组比较,活血软坚方对HUVEC细胞有明显的促增殖作用,且能增加细胞内Akt、p38、p-p38、p44/42、pp44/42以及VEGFR-1的蛋白表达量(P<0.05)。结论活血软坚方在体内和体外具有促血管新生作用,其机制与上调血管内皮生长因子的表达相关。     

扇贝糖胺聚糖对氧自由基损伤血管内皮细胞的保护作用

目的 研究扇贝裙边提取物一糖胺聚糖(SS-GAG)体外培养应用对氧自由基所致的血管内皮细胞损伤的保护作用，探讨SS-GAG抗动脉粥样硬化(AS)的机理。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，建立氧自由基诱导的HUVEC损伤模型，用MTT比色法观察SS-GAG对HUVEC增殖活性抑制的影响，用比色法观察SS-GAG对HUVEC损伤后乳酸脱氢酶(LDH)的漏出量的影响，应用放射免疫方法．观察SS-GAG对Fenton体系所引发的HUVEC损伤后内皮素(ET)及血管紧张素Ⅱ(AⅡ)分泌改变的影响。结果 与对照组比较，Fenton体系损伤组血管内皮细胞(VEC)的增殖活性、培养液中LDH释放、ET及AⅡ的分泌差异明显．而细胞经不同浓度的SS-GAG预先处理后，细胞增殖活性的损伤减轻，LDH释放以及ET、AⅡ的分泌均明显减少。结论 本研究结果证实，SS-GAG可减轻氧自由基对血管内皮细胞的损伤，抑制内皮细胞LDH的释放以及ET和AⅡ分泌，具有保护血管内皮细胞作用，此作用可能与其抗AS的机理有关。     

核酸适配体对纤溶酶原Kringle 5抗血管生成功能的影响

目的 研究核酸适配体K-a2ct与纤溶酶原Kringle 5(K5)的特异性结合对K5抑制血管内皮细胞增殖和迁移以及促进血管内皮细胞凋亡功能的影响。方法 利用原核系统对重组K5蛋白进行克隆和表达,并采用亲和层析法对表达的K5蛋白进行分离纯化;使用等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)和酶联寡核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide adsorption assay,ELONA)对K-a2ct与K5的亲和特异性进行验证;采用CCK-8、细胞划痕试验观察K-a2ct对K5抑制人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖和迁移功能的影响;采用激光共聚焦显微镜观察Hoechst 33342染色的HUVEC细胞凋亡形态,并采用Annexin V/PI双染流式细胞术检测K-a2ct对K5促进HUVEC细胞凋亡功能的影响。结果 重组蛋白K5在大肠杆菌中实现了高效表达,经亲和层析纯化的重组K5相对分子质量为12 kDa,浓度为0.32 mg·mL     

Apelin-13促大鼠血管平滑肌细胞增殖的PKC-ERK1/2信号通路研究

目的研究G蛋白偶联受体APJ(血管紧张素受体样受体或称血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白,putativere-ceptor protein related to the angiotensin receptor AT1)的内源性配体apelin-13通过PKC-ERK1/2-Cyclins信号通路促进大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响。方法培养SD大鼠胸主动脉VSMCs,Western blot检测p-ERK1/2、ERK1/2、细胞周期蛋白CyclinD1和CyclinE的表达,四噻唑蓝比色法观察PKC阻断剂GF109203X对apelin-13促大鼠VSMCs增殖的影响。结果Apelin-13剂量依赖性和时间依赖性地促进大鼠VSMCsp-ERK1/2表达增加,对ERK1/2表达没有明显影响,GF109203X可明显抑制apelin-13诱导的细胞增殖及p-ERK1/2、CyclinD1和CyclinE的表达。结论Apelin-13促进大鼠VSMCs增殖可能与ape-lin-APJ-PKC-ERK1/2-Cyclins信号通路有关。     

依那普利拉对新生鼠心室成纤维细胞增殖的影响

目的观察血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂(angiotensinⅠ converting enzyme inhibitor,ACEI)依那普利拉(enalaprilat,Ena)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞(CFb)增殖及其对细胞周期蛋白的影响,探讨Ena抗CFb增殖的机制。方法以培养的新生Wistar大鼠乳鼠CFb为实验模型,实验分为对照组、AngⅡ组、用药3个剂量组,采用胰酶消化、差速贴壁法培养CFb,四氮唑盐(MTT)比色法检测CFb增殖;羟脯氨酸法测定胶原量;流式细胞仪、免疫细胞荧光染色法、免疫印迹法测定细胞周期和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27kip1(cyclin dependent kinase inhib-itor,CKI)表达。结果Ena能够抑制AngⅡ诱导的CFb增殖(P<0·01,P<0·05),降低羟脯氨酸含量(P<0·01,P<0·05),提高细胞周期抑制蛋白p27kip1表达(P<0·01,P<0·05)。结论Ena能够通过提高p27kip1含量抑制AngⅡ诱导的CFb增殖。     

力达霉素抑制内皮细胞增殖和诱导细胞凋亡

目的研究力达霉素(lidamyein,LDM)对内皮细胞的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡作用。方法用MTT测定法和[^2H]胸苷掺入测定法观察LDM对内皮细胞的增殖抑制；用流式细胞分析、形态观察、蛋白质印迹分析等方法研究LDM诱导内皮细胞凋亡及对相关调节蛋白的影响。结果 LDM呈浓度依赖性抑制内皮细胞增殖和诱导内皮细胞凋亡。LDM浓度1～10nmol／L可将内皮细胞阻断在G2／M期。LDM可导致内皮细胞中的游离钙增高，可使Bcl-2和PCNA蛋白的表达下调，但对Bax蛋白的表达无影响。结论 力达霉素抑制内皮细胞增殖与诱导内皮细胞凋亡。可进一步说明其抑制血管生成的相关机制。     

雷帕霉素洗脱支架损伤血管内皮的作用机制探讨

目的探讨雷帕霉素洗脱支架损伤血管内皮的作用机制。方法（1）对兔行局部肌肉注射雷帕霉素（雷帕霉素组）,模拟雷帕霉素洗脱支架安全性评价中的肌肉植入,同时设正常对照组和丙酮对照组。观察各组形态变化及测定匀浆液钙含量。（2）采用雷帕霉素0.1、1、10 及100 μg/L 处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）48 h 及1 μg/L 雷帕霉素处理HUVEC 6、12、24 及48 h,采用MTT 法检测细胞存活率,分析细胞存活率与药物浓度及处理时间的关系。（3）HUVEC 分设正常对照组、1 μg/L 雷帕霉素组。48 h 后HE 染色观察细胞形态变化,用NO 检测试剂盒测定细胞培养液NO 含量,采用Fluo-3/AM 荧光探针标记细胞内Ca2+。结果（1）雷帕霉素组出现支架植入类似的蓝染表现,雷帕霉素组较正常对照组和丙酮对照组钙含量升高（P < 0.05）。（2）雷帕霉素处理HUVEC 后,细胞存活率随浓度增加和时间延长均呈逐渐降低趋势（P < 0.01）。（3）雷帕霉素组细胞胞浆出现空泡、核固缩及核碎裂,与正常对照组比较,细胞培养液NO 含量降低,细胞内游离Ca2+含量增高（P < 0.05）。结论雷帕霉素洗脱支架中抗增殖药雷帕霉素对血管内皮有损伤作用,其机制可能与引起细胞内钙升高有关。     

油酰乙醇胺对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究油酰乙醇胺(OEA)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的抑制作用以及对p38信号通路的影响。方法分离大鼠胸主动脉,组织贴块法培养VSMCs,AngⅡ刺激VSMCs建立细胞增殖模型,不同浓度OEA(5,10,20μmol/L)作用后,用溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)掺入的方法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞周期变化;Western-bolt法检测对P-p38和p38蛋白表达的影响。结果与AngⅡ组比较,随着OEA浓度升高,VSMCs的增殖受到抑制、G0/G1比例显著升高,G2/M比例显著降低,且P-p38和p38蛋白的表达量降低并呈浓度依赖关系。结论 OEA对VSMCs的增殖有抑制作用,其机制可能是抑制了p38MAPK信号通路。     

银杏内酯对血管紧张素Ⅱ依赖性血管平滑肌细胞增殖的作用

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对培养牛主动脉血管平滑肌细胞(VSM C)增殖的作用及银杏内酯对其增殖的影响.方法采用组织块贴壁法培养牛主动脉VSMC ,以3H-TdR掺入法和流式细胞仪分别测定VSMC的DNA合成量及细胞周期中各期细胞构成比.结果 AngⅡ(0.1μmol/L)作用24h 使3H-TdR掺入量比对照组增加34%;S期和G2/M期细胞增多,细胞增殖指数由35.15%增至45.03%.与AngⅡ组相比,AngⅡ加银杏内酯B(G -B,0.1～10μmol/L)组、AngⅡ加G-B和银杏内酯A(G-A)的混合物(G-AB,0.1～10μmol/L)组的3H-TdR掺入量减少;S期细胞构成比和细胞增殖指数减少.结论 AngⅡ对VSMC有促增殖作用 ,可被G-B和G-AB所拮抗.     

他莫昔芬对人肝胚细胞瘤HepG2细胞中mTOR和survivin表达的影响研究

目的 研究他莫昔芬对人肝胚细胞瘤HepG2细胞中mTOR和survivin表达的影响。方法 运用RT-PCR、双荧光素酶报告基因检测系统和Western blot生物学方法对接受他莫昔芬刺激的HepG2细胞内survivin和p70S6k的转录水平和蛋白表达水平进行分析。结果 他莫昔芬明显抑制了survivin的蛋白表达,并且减少了p70S6k激酶的合成。20μM的他莫昔芬即可有效抑制survivin mRNA的转录。运用mTOR特异性抑制因子雷帕霉素处理HepG2细胞,发现HepG2细胞内survivin的蛋白表达水平明显下降,但是雷帕霉素并未影响survivin基因的转录,表明他莫昔芬和雷帕霉素通过协同作用抑制HepG2细胞内survivin的表达。结论他莫昔芬通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路有效地抑制了HepG2细胞内survivin因子的表达。     

钩藤提取物抑制血管紧张素Ⅱ诱导血管成纤维细胞增殖及胶原合成的研究

目的探讨钩藤碱和异钩藤碱对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管成纤维细胞(VAF)增殖及胶原沉积的抑制效应及相关机制。方法建立AngⅡ诱导VAF增殖模型,通过四甲基偶氮唑盐比色法、扫描电镜技术、流式细胞术、天狼猩红染色法和逆转录聚合酶链反应等观察钩藤碱和异钩藤碱对其增殖活性、细胞形态、细胞周期、细胞凋亡率、细胞c-myc蛋白表达、细胞培养液中羟脯氨酸含量、细胞间胶原蛋白含量、细胞ColⅠmRNA和ColⅢmRNA的影响。结果AngⅡ刺激VAF增殖,钩藤碱和异钩藤碱抑制AngⅡ诱导VAF增殖;在钩藤碱和异钩藤碱作用下VAF处于G0/G1期的细胞数增多、S期的细胞数减少、细胞凋亡率增加、细胞c-myc蛋白表达降低、细胞培养液中羟脯氨酸含量降低、细胞间胶原表达降低、细胞ColⅠmRNA和ColⅢmRNA转录也降低。结论钩藤碱和异钩藤碱对AngⅡ诱导VAF增殖和胶原沉积有抑制效应,部分机制与其阻滞VAF G0/G1期向S期转化、诱导细胞凋亡、下调细胞c-myc蛋白表达和细胞ColⅠmRNA和ColⅢmRNA转录有关。