大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率。方法：采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV。线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度。用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体αmRNA、蛋白表达。结果与结论：成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011pfu/L。重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高。该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础。     

血管生成抑制因子METH-1腺病毒载体的构建

目的:利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒。方法:实验于2004-08/2005-08在中山大学眼科中心国家重点实验室完成。自真核表达载体pMD18-T-METH1中酶切出METH1基因,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-METH1,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-METH1。以pAd-METH1为模板,经DNA测序正确后,用PacI酶切线性化pAd-METH1,转染293细胞,包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察转染细胞增强型绿色荧光蛋白的表达,采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定。结果:①构建了携带外源基因人血管生成抑制因子的穿梭载体pAdTrack-CMV-METH1。②制备了METH1重组腺病毒载体pAdEasy-METH1。③METH1重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制。结论:应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体,制备高滴度重组病毒,为METH1基因功能研究奠定了基础。     

大鼠蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒的构建

背景:研究者们早已发现蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase,PTP1B)可负性调节胰岛素信号转导,但目前制约PTP1B功能研究的重要环节是缺乏有效的工具.目的:拟构建PTP1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒.设计、时间及地点:体外细胞学基因转染实验,于2007-05/12在解放军第二军医大学长海医院中心实验室完成.材料:293细胞由中科院上海细胞研究所提供,真核表达质粒psiRNA-PTP1B由上海吉凯生物公司合成,AdEasy-1菌、穿梭载体pAdTrack、大肠杆菌DH5α由本室保存,重组腺病毒PCR鉴定引物由上海生工生物公司设计合成.方法:由生物公司合成针对大鼠PTP1B mRNA的特异性siRNA真核表达质粒psiRNA-PTP1B,双酶切得到siRNA-PTP1B表达片段,插入pAdTrack载体上,获得转移质粒pAdTrack-siRNA-PTP1B.后者经线性化后,转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组,PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-siRNA-PTP1B,酶切线性化后转染293细胞包装成重组病毒颗粒.通过反复感染扩增病毒,采用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒. 主要观察指标:荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,鉴定重组腺病毒穿梭载体及重组腺病毒是否构建成功.结果:PacⅠ酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAd-siRNA-PTP1B构建成功,转染293细胞后有绿色荧光蛋白表达.PCR鉴定表明重组腺病毒中含有siRNA-PTP1B片断,成功构建了携带PTP1B干扰RNA的重组腺病毒Ad-siRNA-PTP1B,293细胞扩增纯化后,获得约3.6×109 efu/mL滴度的重组腺病毒.结论:应用AdEasy-1系统可以高效快速制备表达PTP1B干扰RNA的重组腺病毒.     

人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达

目的构建HSP75基因重组腺病毒载体,观察HSP75蛋白在C17.2神经干细胞中的表达。方法采用PCR方法从含人HSP75基因质粒中扩增HSP75基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点区域,构建重组穿梭质粒p HBAd-MCM-HSP75-GFP,在LipofiterTM转染试剂的介导下与腺病毒辅助骨架质粒p HBAd-BHGloxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞,整合包装成重组腺病毒,TCID50法测定病毒滴度。使用荧光显微镜、流式细胞仪和Western blotting观察重组腺病毒在C17.2细胞中的感染情况及HSP75蛋白的表达水平。结果通过酶切鉴定、测序、PCR鉴定,HSP75基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒整合包装成重组腺病毒;重组腺病毒滴度为1.0×1010PFU/ml;Western blotting检测,转染后的神经干细胞表达HSP75蛋白。结论 HSP75重组腺病毒载体成功构建,对C17.2神经干细胞具有较高的表达效力。     

存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达

本研究旨在构建含有人存活蛋白(survivin)基因的重组腺病毒载体,并探讨其在转染树突状细胞中的表达。以质粒pcDNA3.0-survivin为模板,通过PCR扩增获得survivin基因全长序列。PCR产物回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pShuttle-CMV-survivin。通过双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pShuttle-CMV-survivin转化E.coliBJ5183菌(含腺病毒骨架质粒)并进行同源重组,然后筛选阳性克隆,提取质粒,将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,将病毒上清转染树突状细胞,应用Westernblot方法分析survivin的表达。结果表明成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.65×109pfu/ml。Westernblot鉴定显示,经重组腺病毒转染的DC可有效表达survivin。结论含survivin基因的重组腺病毒载体的构建成功,为下一步开展抗白血病免疫研究奠定实验基础。     

血管生成抑制因子METH-1腺病毒载体的构建

目的：利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒。方法：实验于2004—08／2005-08在中山大学眼科中心国家重点实验室完成。自真核表达载体pMD18-T—METH1中酶切出METH1基因，亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，形成转移质粒pAdTrack-CMV-METH1，在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组，得到重组腺病毒载体pAd-METH1。以pAd-METH1为模板，经DNA测序正确后，用PacⅠ酶切线性化pAd-METH1，转染293细胞，包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察转染细胞增强型绿色荧光蛋白的表达，采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：①构建了携带外源基因人血管生成抑制因子的穿梭载体pAdTrack-CMV-METH1。②制备了METH1重组腺病毒载体pAdEasy—METH1。③METH1重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制。结论：应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体，制备高滴度重组病毒，为METH1基因功能研究奠定了基础。     

人源性Notch-1胞内段腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建携带人Notch-1胞内区基因的腺病毒栽体(Ad-GFP-NICD),观察其在真核细胞中的表达.方法:通过PCR从pIRES2-EGFP-NICD质粒中扩增目的片段Notch-1胞内区,定向克隆至穿梭质粒栽体pShuttle-CMV-EGFP中,经酶切及测序鉴定后,将Notch-1胞内区定向克隆至重组腺病毒骨架载体pAdxsi,构建携带人Notch-1胞内区基因表达盒及绿色荧光蛋白的重组腺病毒栽体(pAdxsi-GFP-NICD).酶切鉴定正确后,转染人胚肾细胞系293细胞,进行重组腺病毒的包装,生产及纯化,半数组织感染量法测定病毒滴度.用重组腺病毒转染人脐静脉内皮细胞,荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达,并通过PCR扩增观察细胞Notch-1胞内区的表达.结果:成功构建了携带人Notch-1胞内区的重组腺病毒,纯化后病毒滴度达1.6×1010 pfu/mL.腺病毒载体转染人脐静脉内皮细胞后24 h在荧光显微镜下即可观察到绿色荧光蛋白,48 h更为强烈,PCR扩增证实细胞表达Notch-1胞内区.结论:成功构建了携带Notch-1胞内区的重组腺病毒载体,为进一步研究Notch信号通路促进动脉形成的机制研究奠定了实验基础.     

KGF和EGFP双基因共表达的重组腺病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞的研究

为了将角质生长因子(KGF)基因通过腺病毒载体转染到间充质干细胞(MSC)中,增强MSC胸腺修复功能,利用DNA重组技术,将目的基因KGF克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中包装、扩增,并测定病毒滴度。转染至小鼠骨髓MSC中,为胸腺组织修复免疫功能恢复提供前期实验基础。结果表明:重组穿梭质粒pShuttle-GFP-mKGF重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.6 kb和5.1 kb 2个条带;重组腺病毒载体质粒pAdxsi-mKGF病毒质粒经酶切鉴定得到阳性克隆;测定重组腺病毒Ad-EGFP-mKGF半数组织培养感染量的滴度为1.6×1010 pfu/ml。转染后10 hMSC开始表达荧光,6-8 d达高峰,转染率可达92.3%,28 d仍有表达。结论:pAdxsi-mKGF病毒质粒构建成功并能高效、安全地转染MSC。     

人Nanog基因重组腺病毒载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达

摘要:目的：构建重组人Nanog基因腺病毒载体(Ad-Nanog),转染人脐带间充质干细胞（hucMSCs）,用于后续研究。 方法：设计含有KpnⅠ及XhoⅠ酶切位点的引物,PCR扩增Nanog基因,将扩增产物亚克隆到pAdTrack-CMV穿梭质粒上,经双酶切和基因测序鉴定,重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重组,筛选获得Ad-Nanog重组腺病毒质粒。经PacⅠ酶切线性化,脂质体转染293A细胞,包装和扩增病毒,并感染hucMSCs。 结果：重组腺病毒质粒经PCR和双酶切鉴定正确,测序结果和设计片段的序列一致。荧光显微镜下观察在感染的hucMSCs中绿色荧光蛋白高效表达。 结论：成功构建了Nanog腺病毒表达载体,能高效转染hucMSCs,可用于后续转基因的研究。     

人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的:构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体,并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率。方法:实验于2004-03/2005-04在第三军医大学完成。采用基因工程技术,将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒,将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度,应用Westernblot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达。结果:①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度可达2.5×109pfu/mL,具有很强感染能力。②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48h,Westernblot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达。结论:应用细菌内同源重组法,可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体,且能高效转染大鼠骨髓基质细胞。     

大鼠缝隙连接蛋白Connexin 43的shRNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建缝隙连接蛋白connexin 43(CX43)特异性shRNA重组腺病毒载体,为应用基因沉默技术从转录后水平进行基因治疗研究奠定基础。方法:合成CX43发夹样shRNA的DNA单链一对和对照单链scramble一对,退火后将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的穿梭质粒pAd shRNA/H1,得到pAd shRNA/H1-CX43和pAd shRNA/H1-scramble。分别酶切及DNA测序鉴定后,经Pme I线性化后转化入BJ5187-AD-1感受态细菌,在细菌内进行同源重组构建含目的基因的重组腺病毒质粒载体。用Pac I酶切鉴定重组菌。将Pac I酶切重组的两种腺病毒质粒载体后,经脂质体转化293细胞进行包装得到重组的腺病毒颗粒,并通过293细胞绿色荧光表达反应重组腺病毒表达情况。将重组的腺病毒Ad-Cx43 shRNA和对照病毒Ad-scramble shRNA分别感染大鼠原代培养的星形胶质细胞,并检测星形胶质细胞CX43的表达。结果:证实穿梭质粒的以及重组腺病毒质粒均构建正确,腺病毒质粒转染293细胞后48 h即可见绿色荧光蛋白表达,10 d后全部细胞表达绿色荧光,并有半数细胞飘起,收获病毒感染培养星形胶质细胞后48 h,均有绿色荧光表达,经感染Ad-Cx43 shRNA的星形胶质细胞CX43的表达明显低于感染对照病毒Ad-scramble shRNA的星形胶质细胞。结论:成功构建表达大鼠CX43特异性发夹状shRNA的重组腺病毒载体,将为应用基因沉默技术研究CX43在神经系统疾病尤其是缺血性脑损伤中的作用提供依据。     

构建双突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的实验

目的:前期实验已成功构建无突变及564位是单突变腺病毒载体。在此基础上构建人双突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体,为进一步研究低氧诱导因子1α基因及其突变体的临床应用奠定基础。方法:实验于2005-12/2006-12在南方医院心内科重点实验室完成。①实验材料:限制性内切酶PacI(NEB),PI-SceI、I-CeuI(Clontech);IPTG、X-Gal(Takara),转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen),凝胶回收试剂盒(Omega);DMEM(Omega);小牛血清(PAA);北京天为时代公司病毒基因组提取试剂盒;HIF-1α单克隆抗体(Chemicon International公司);羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗(北京鼎国生物公司)。质粒、菌珠、细胞系等:Adeno-XTM-Adenoviral Expression Systems(BD.CLONTECH):包括有pShuttle2、pShuttle2-lacZ、Adeno-XTMViralDNA等;重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803及pShuttle2-lacZ(本室已构建成功);大肠杆菌DH5α(本室保存);HEK293A细胞(中科院上海细胞所)。②实验方法:采用分子克隆技术,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803,然后切下含有低氧诱导因子1αcDNA表达的盒片段,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-XViralDNA连接,重组成pAdeno-HIF-1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293A细胞中包装成为重组腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803。③实验评估:进行PCR鉴定及滴度测定。用重组腺病毒转染293A,采用Westernblot鉴定低氧诱导因子1α蛋白表达。结果:提取重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala564-Ala803以引物A、B和引物1、2、3、4进行PCR鉴定,分别扩增出287,460,214bp的3种引物片段,与预期一致,经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功。pAdeno-lacZ转染293A细胞后X-Gal原位染色,显示约有近20%左右细胞染成蓝色,病毒滴度为6.8×107pfu/mL。Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803转染293A后稳定表达低氧诱导因子1α蛋白。结论:成功构建了重组腺病毒突变型的Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803。     

人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的：构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体，并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率。方法：实验于2004-03／2005-04在第三军医大学完成。采用基因工程技术，将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上，利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组，经293细胞包装、扩增，得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒，将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定，利用绿色荧光报告基因转染结果，以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度，应用Westernblot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达。结果：①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功，病毒滴度可达2．5&;#215;10^9pfu／mL，具有很强感染能力。②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48h，Westernblot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达。结论：应用细菌内同源重组法，可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体，且能高效转染大鼠骨髓基质细胞。     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景:超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因.目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供.携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存.腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司.方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;1-Ceu Ⅰ+1-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率.结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp(pshutIle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用Xho Ⅰ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10~(11) PFU/mL.成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%.结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞.     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒

目的:AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组,经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞获得重组病毒,极大简化了载体的构建过程.实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒.方法:实验于2006-08/2007-05在青岛大学医学院病毒学实验室完成.①实验材料:清洁级SD大鼠5只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,骨架质粒pAdeasy-1,大肠杆菌BJ5183和DH10B,人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物教研室罗兵教授惠赠.②实验方法:从脂多糖刺激培养的大鼠脾细胞中提取细胞总RNA,应用反转录多聚酶链反应技术扩增白细胞介素10 cDNA,定向亚克隆至pAdtrack-CMV中构建腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-10,酶切线性化后转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌中,获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10,Lipofectamin包装转染293细胞,获得重组腺病毒vAd-IL-10,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.将293细胞接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中,测定重组腺病毒滴度.用重组腺病毒vAd-IL-10感染293细胞3 d后,以TRIzol一步法提取细胞总RNA,所获RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后,PCR产物行琼脂糖电泳检测白细胞介素10 mRNA的表达.结果:①重组腺病毒的包装及滴度测定:经限制性内切酶转染293细胞16 h后,荧光显微镜观察到细胞中有GFP荧光,可间接反映目的基因的表达.将病毒上清反复感染293细胞扩增重组腺病毒,通常传至第4～5代于接种病毒后24～48 h,几乎可观察到所有细胞出现荧光,此时收获病毒,重组病毒命名为vAd-IL-10.vAd-IL-10滴度为5.5×108 pfu/mL,vAd-GFP滴度为9.0×108 pfu/mL.②目的基因RT-PCR产物的鉴定:提取重组腺病毒感染293细胞总RNA,RT-PCR扩增后琼脂糖电泳显示特异性580 bp预计大小的片段,表明该重组腺病毒可在293细胞中有效转录.结论:利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了携带白细胞介素10基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度的重组腺病毒vAd-IL-10,可在293细胞中有效转录.     

组织工程化成年心肌细胞的构建

背景：采用成年心肌细胞构建组织工程细胞已成为心脏疾病领域新的科研热点。 目的：探讨简单、快捷的成年大鼠心肌细胞分离方法,并初步探索组织工程化成年心肌细胞的构建方式。 方法：采用分段式酶消化方法消化成年大鼠心室肌心肌细胞。分别转染腺病毒和脂质体介导的红色荧光蛋白基因,倒置荧光显微镜、流式细胞仪检测组织工程细胞的构建效率。转染腺病毒介导的缺氧诱导因子1a,采用Western blot检测目标蛋白的表达。 结果与结论：采用分段式酶消化方法可获得大量心肌细胞。流式细胞分析表明所获得的成年心肌细胞的存活率为（87.03±0.70）%。与脂质体转染相比（转染效率为0）,腺病毒感染效率高,为（70.31±1.39）%,荧光显微镜下细胞发出红色荧光。在腺病毒转染第4天后,可有效表达目标蛋白缺氧诱导因子1a。以上结果表明分段式酶消化法是成熟心肌细胞的快速分离方式,并明确重组腺病毒载体是转染心肌细胞的最佳基因载体。     

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的:构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达,探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法:实验于2004-8/12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板,反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因,经测序验证后,亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,与骨架质粒pAdEasy1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增,利用AdEasy1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达,并用病毒上清转化大鼠神经干细胞,检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果:①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸,同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆,转染293细胞包装后的病毒滴度为1x109PFU/mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论:成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。     

pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ载体构建及在免骨髓间充质干细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增殖物激活受体γ是细胞分化重要的调控因子,通过调节其他转录因子的表达,参与调节骨髓间充质干细胞的分化。目的：构建pEGFP．N1过氧化物酶体增殖物激活受体γ真核表达载体,体外转染兔骨髓间充质干细胞,为过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体功能和基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。设计、时间及地点：单一样本观察,于2007—09／2008—07在南华大学附属一医院临床研究所完成。材料：选择雄性2～5月龄新西兰大白兔,用于分离培养骨髓间充质干细胞。方法：应用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,贴壁法不断纯化。从正常小鼠的肝组织中提取总RNA,反转录-聚合酶链反应法获得过氧化物酶体增殖物激活受体γcDNA,经XhoI,ApaI双酶切,定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP—N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ。主要观察指标：经酶切分析和测序鉴定重组质粒中过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的完整性和真实性,脂质体介导下体外转染骨髓间充质干细胞,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率,提取总RNA和总蛋白,进行反转录聚合酶链反应和Westernblot检测。结果：获得的过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因片段经酶切和测序鉴定正确,重组质粒经酶切和测序鉴定证实构建正确,成功转染骨髓间充质干细胞,在其中检测到目的基因及蛋白表达。结论：实验成功构建了pEGFP-N1过氧化物酶体增殖物激活受体γ重组质粒,同时存转染的骨髓间充质干细胞中获得了过氧化物酶体增殖物激活受体γ的高效表达。     

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的：构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达，探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法：实验于2004-8／12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板，反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因，经测序验证后，亚克隆至穿梭质粒pAdTrack CMV中，与骨架质粒pAdEasy 1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增，利用AdEasy 1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达，并用病毒上清转化大鼠神经干细胞，检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果：①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸，同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆，转染293细胞包装后的病毒滴度为lxl09PFU／mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论：成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。     

应用腺病毒载体介导RNA干扰技术构建糖皮质激素受体基因阻断的人U937巨噬细胞模型

目的:利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术,建立糖皮质激素受体基因阻断的人U937巨噬细胞模型。方法:实验于2004-06/2005-05在解放军第三军医大学新桥医院呼吸研究所实验室完成。将针对糖皮质激素受体发挥RNA干扰效应的合成寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1/Adeno中,在含有pAdEasy-1病毒骨架的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;重组子通过脂质体介导转染293T细胞,并在293T细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒,通过反复感染扩增病毒以达到感染靶细胞的适当滴度,通过绿色荧光表达来监控腺病毒扩增;应用Westernblot法检测U937巨噬细胞感染后糖皮质激素受体蛋白的表达。结果:转染腺病毒载体的293T细胞表达绿色荧光,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度。受腺病毒感染的U937巨噬细胞内糖皮质激素受体蛋白表达明显降低。结论:可以成功构建针对糖皮质激素受体基因的RNA干扰腺病毒载体。