脂肪源性干细胞的体外分离培养与鉴定

背景：脂肪间充质干细胞来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的潜能,有望成为组织工程的种子细胞。
　　目的：体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞并进行鉴定。
　　方法：取SD大鼠腹股沟区皮下脂肪组织,0.075%I型胶原酶消化分离、培养脂肪源性干细胞,倒置相差显微镜下观察脂肪源性干细胞的细胞形态和增殖特征。取第3代细胞用 MTT 比色法描绘生长曲线,免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44,含有体积分数10%胎牛血清、地塞米松和胰岛素的 DMEM/F12定向诱导成脂分化,油红“O”染色成脂分化鉴定。免疫组化法鉴定向神经细胞诱导分化的结果。
　　结果与结论：分离出的大鼠脂肪源性干细胞生长曲线呈“S”形,强烈表达干细胞标志物CD44。成脂诱导分化经油红“O”染色呈橘红色。向神经细胞诱导分化后表达神经元标志物神经元特异性烯醇化酶。说明SD大鼠脂肪源性干细胞在体外具有易于分离培养和扩增,表达间充质干细胞相关表型,特定条件下可诱导分化的特点。     

新生大鼠海马神经干细胞培养及皮质醇和氟西汀对其增殖的影响

目的：探索新生大鼠海马神经干细胞培养及鉴定方法，观察高浓度的皮质酮和抗抑郁剂氟西汀对其增殖的影响。方法：2004-02／06在解放军军事医学科学院毒物药物研究所完成。分离新生第1天大鼠的海马组织，将其制成单细胞悬液后置于无血清条件培养基中进行培养，用免疫细胞化学技术对所培养的细胞特性进行鉴定，用四甲基氮唑兰法观察高浓度的皮质酮和氟西汀对其增殖的影响。结果：从新生大鼠海马分离得到的细胞接种于含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子两种丝裂原刺激因子的条件培养基中，可以持续分裂增殖形成细胞克隆(神经球)，该神经球可以表达神经上皮干细胞蛋白(巢蛋白)。神经球中可以探测到外源性给与的细胞增殖特异性的标记物Brdu。撤除培养基中的丝裂原后，所培养的细胞可以分化，并且分化后可以表达成熟神经元的标志物神经元特异性烯醇化酶或星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白。四甲基氮唑兰法显示，高浓度的皮质酮(100—500μmol／L)可以使吸光度(A570nm)明显降低。而氟西汀(0．5～1．0μmol／L)则使之升高。结论：用此方法分离得到的细胞具有神经干细胞的特性。高浓度的皮质酮可以抑制新生大鼠神经干细胞的增殖，氟西汀可以促进新生大鼠神经干细胞的增殖。     

新生大鼠全大脑组织分离诱导分化神经干细胞的体外实验

背景：神经干细胞的供体一股以胎鼠和成年鼠为主，利用细胞培养技术分离步骤较繁琐。目的：以新生大鼠为神经干细胞供体，拟建立一种较为简便、细胞获得率较高的分离培养方法。设计、时间及地点：以细胞为对象观察性实验，于2006—10／2007—03在重庆医科大学完成。材料：新生1～3d的Wistar大鼠全大脑。方法：以胰蛋白酶消化、无血清、悬浮培养原代细胞，并加含体积分数为0．10胎牛血清的DMEM／F12培养液诱导其分化。主要观察指标：应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。应用间接免疫细胞化学染色法鉴定神经千细胞及其分化后神经元和胶质细胞标志蛋白的表达。以BrdU标记神经干细胞，观察其增殖情况。结果：新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续传代和增殖的能力，能稳定表达神经干细胞特异性巢蛋白。诱导分化后的细胞能表达神经元细胞、旱形胶质细胞、少突胶质细胞的特异性蛋白。结论：从新生大鼠脑组织分离培养出的神经干细胞获得率高，保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新和多项分化潜能。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础,从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neuralstemcells,NSCs),并观察其向神经元的分化情况。方法分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织,采用无血清原代及传代培养方法,获得具有克隆能力的细胞群;应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达;应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力,表达神经上皮干细胞蛋白(nestin),分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;随着贴壁后分化时间的延长,表达nestin的细胞数量从80.5%下降到10.9%,而神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)阳性细胞数量则从1.1%上升到31.6%。结论用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力,并具有多分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;随着分化时间的延长,神经干细胞数量下降,而神经元比例有明显上升。     

新生大鼠海马神经干细胞培养及皮质醇和氟西汀对其增殖的影响

目的:探索新生大鼠海马神经干细胞培养及鉴定方法,观察高浓度的皮质酮和抗抑郁剂氟西汀对其增殖的影响。方法:2004-02/06在解放军军事医学科学院毒物药物研究所完成。分离新生第1天大鼠的海马组织,将其制成单细胞悬液后置于无血清条件培养基中进行培养,用免疫细胞化学技术对所培养的细胞特性进行鉴定,用四甲基氮唑兰法观察高浓度的皮质酮和氟西汀对其增殖的影响。结果:从新生大鼠海马分离得到的细胞接种于含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子两种丝裂原刺激因子的条件培养基中,可以持续分裂增殖形成细胞克隆(神经球),该神经球可以表达神经上皮干细胞蛋白(巢蛋白)。神经球中可以探测到外源性给与的细胞增殖特异性的标记物BrdU。撤除培养基中的丝裂原后,所培养的细胞可以分化,并且分化后可以表达成熟神经元的标志物神经元特异性烯醇化酶或星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白。四甲基氮唑兰法显示,高浓度的皮质酮(100～500μmol/L)可以使吸光度(A570nm)明显降低。而氟西汀(0.5～1.0μmol/L)则使之升高。结论:用此方法分离得到的细胞具有神经干细胞的特性。高浓度的皮质酮可以抑制新生大鼠神经干细胞的增殖,氟西汀可以促进新生大鼠神经干细胞的增殖。     

大鼠胚胎脑源性神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：分离培养大鼠胚胎脑源性神经千细胞，并进行增殖分化鉴定。 方法：实验于2005—06／12在中国科学技术大学生命科学学院周江宁研究室进行。①自孕14dWistar大鼠胚胎分离大脑皮质及皮质下组织，经机械吹打分离成单细胞后，利用无血清原代及传代培养方法，在添加重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子和B27添加剂的DMEM／F12（1：1）培养基中进行悬浮培养，获得具有克隆能力的细胞群；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆。②从培养基中撤除生长因子和B27添加剂，换成含体积分数为0．1的胎牛血清的DMEM／F12培养基，将培养的细胞球接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的培养皿，诱导分化。③以免疫荧光细胞化学技术，用神经干细胞的特异性单克隆抗体（巢蛋白）和增殖细胞单克隆抗体（5一溴脱氧尿苷嘧啶）鉴定克隆细胞，以鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力。④以免疫荧光细胞化学技术，用神经细胞的特异性抗体（神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂）鉴定分化细胞，以鉴定神经干细胞的多向分化潜能。 结果：①从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力，表达神经上皮干细胞蛋白抗原和增殖细胞抗原。②在血清诱导下，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞3种神经细胞的特异性抗原。 结论：运用上述方法分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多向分化潜能和具有神经干细胞的特异性抗原。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的 神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础，从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs)，并观察其向神经元的分化情况。方法 分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织，采用无血清原代及传代培养方法，获得具有克隆能力的细胞群；应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达；应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果 从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力，表达神经上皮干细胞蛋白(nea6n)，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原；随着贴壁后分化时间的延长，表达nestin的细胞数量从80．5％下降到10．9％，向神经力特异性烯醇化酶(newonspecific enolase，NSE)阳性细胞数量则从1．1％上升到31．6％。结论 用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多分化潜能，是中枢神经系统的干细胞；随着分化时间的延长，神经干细胞数量下降，而神经元比例有明显上升。     

兔骨髓基质细胞体外培养、诱导及分化成神经干细胞的实验研究

目的：研究新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养及诱导分化情况。方法：梯度密度离心法分离新西兰大白兔骨髓基质细胞(BMSCs)，于体外用神经干细胞培养基和多种细胞因子进行培养、诱导、分化，细胞免疫化学方法进行鉴定。结果：新西兰大白兔骨髓基质细胞能在体外培养中增殖、分化，具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)，这些细胞最终能分化出类神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有神经核蛋白抗体(NeuN)的表达。结论：新西兰大白兔骨髓基质细胞是具多向分化潜能的细胞，具有较强的增殖、自我更新能力。在适宜的条件下，可以分化成能表达神经系细胞特异性抗原的细胞。骨髓基质细胞来源方便、取材较容易，体外培养和扩增的技术条件简便，具有向神经系细胞分化的潜能，可以考虑作为细胞移植治疗的种子细胞     

星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离、培养与鉴定

背景：肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小部分具有无限增殖潜能和自我更新能力,能够分化为成熟细胞表型的干细胞样细胞,对肿瘤发生、增殖、侵袭起关键作用。目的：建立体外分离、培养与鉴定星形胶质细胞瘤干细胞的方法。方法：采用直接培养法分离培养星形胶质细胞瘤干细胞。参照神经干细胞培养条件,进行体外培养。观察其增殖、分化并进行巢蛋白、CD133免疫细胞化学鉴定和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白及O4免疫细胞化学鉴定。结果与结论：培养7-10d,可形成大量悬浮生长巢蛋白及CD133免疫阳性的神经球,经诱导分化后细胞呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白或O4免疫阳性。提示星形胶质细胞瘤中存在具有神经干细胞特性的肿瘤干细胞。CD133和巢蛋白是星形胶质细胞瘤干细胞重要的表面标记,可以用于星形胶质细胞瘤干细胞的分离。     

大鼠胚胎脑源性神经干细胞的分离培养和鉴定

目的:分离培养大鼠胚胎脑源性神经干细胞,并进行增殖分化鉴定。方法:实验于2005-06/12在中国科学技术大学生命科学学院周江宁研究室进行。①自孕14dWistar大鼠胚胎分离大脑皮质及皮质下组织,经机械吹打分离成单细胞后,利用无血清原代及传代培养方法,在添加重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子和B27添加剂的DMEM/F12(1∶1)培养基中进行悬浮培养,获得具有克隆能力的细胞群;用有限稀释法,得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆。②从培养基中撤除生长因子和B27添加剂,换成含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM/F12培养基,将培养的细胞球接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的培养皿,诱导分化。③以免疫荧光细胞化学技术,用神经干细胞的特异性单克隆抗体(巢蛋白)和增殖细胞单克隆抗体(5-溴脱氧尿苷嘧啶)鉴定克隆细胞,以鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力。④以免疫荧光细胞化学技术,用神经细胞的特异性抗体(神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂)鉴定分化细胞,以鉴定神经干细胞的多向分化潜能。结果:①从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并具有增殖的能力,表达神经上皮干细胞蛋白抗原和增殖细胞抗原。②在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞3种神经细胞的特异性抗原。结论:运用上述方法分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力,并具有多向分化潜能和具有神经干细胞的特异性抗原。     

不同年龄段大鼠脊髓源性神经干细胞的体外培养及鉴定

背景：不同年龄段神经千细胞的增殖及分化特性目前未见报道。目的：观察不同年龄段人鼠脊髓源性神经干细胞的体外分离、培养及鉴定。方法：取不同年龄大鼠的脊髓,制成单细胞悬液,用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和B27的DMEM／F12培养基,以细胞浓度5.0×10^5L^-1进行原代培养,每隔3d传代1次。结果与结论：不同年龄段大鼠的脊髓中均可培养出细胞,其形态为结构紧密、大小不等的悬浮细胞球,称之为“神经干细胞球”;经过传代后单细胞又迅速增殖成球且数目明显增多。提示不同年龄段大鼠脊髓中均能够在体外培养出神经细胞球。     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离及培养

目的：在神经干细胞的分离培养过程中，国内外的报道多数是用胰蛋白酶对组织细胞进行消化，但是消化时间比较难把握。采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养和初步的免疫组织化学检测，为相关研究建立实验条件。 方法：实验于2006—10／2007-09在广西医科大学基础医学实验室完成。实验室为广西重点实验室、基础医学博士后工作站。①实验材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织，经胰酶消化加机械吹打后，在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清培养基中培养。③实验评估：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。 结果：在无血清DMEM／F12培养液中，加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子及B27的条件下，培养24h后可见细胞以悬浮方式生长，三五聚集成团块，48h后形成由十数个至数十个细胞组成的，大小不等的细胞球，形态规则，细胞无突起，形成典型的神经球，可传代。免疫细胞化学法检测显示，细胞表达神经巢蛋白。 结论：①来自昆明种小鼠胎脑的神经干细胞能在体外培养、增殖并具有增殖传代能力。②无血清B27培养基添加表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子有利于神经干细胞的体外培养和促进其增殖。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题.目的观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法.设计单一样本观察.单位四川大学生命科学院细胞生物学实验室.材料孕14 d SD大鼠10只,DMEM/F12 11,碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子;巢蛋白抗体IgG,β-微管蛋白Ⅲ抗体Ig G,胶质纤维酸性蛋白抗体Ig G,生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗.方法实验于1999/2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成.①从胎鼠前脑取出脑组织,采用酶消化、机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆.②神经干细胞以2×108L-1密度接种培养,分4组,每组6瓶细胞,DMEM/F12组加入DMEM/F12(11)培养基含体积分数为0.1的小牛血清;碱性成纤维细胞生长因子组培养基为含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子组培养基含30μg/L表皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子组先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2 h后再换成含表皮生长因子的培养基培养.培养24 h后更换培养瓶,培养14 d后显微镜下计数原代克隆数,免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达.主要观察指标①神经干细胞的原代克隆.②单细胞克隆培养结果.③诱导分化结果.结果①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力,免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高(0.630%).③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞.结论①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法.     

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

背景：人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。 目的：探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。 方法：采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。 结果与结论：形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。     

体外大鼠肝卵圆细胞的长期培养方法

背景：肝卵圆细胞是目前公认的成体肝干/祖细胞,但其体外长期培养时会不可避免地丢失干细胞的活性。目的：探索大鼠肝卵圆细胞体外长期培养的方法。方法：构建2-乙酰胺基芴/部分肝切除肝再生大鼠模型,通过酶消化和Percoll梯度离心分离纯化大鼠异质卵圆细胞并进行免疫染色鉴定,用含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养基体外长期培养,后撤去表皮生长因子、白血病抑制因子,通过形态学的观察和分子标志物的检测判断其能否保持干/祖细胞活性。结果与结论：采用含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养基体外培养卵圆细胞4个月后,大鼠异质卵圆细胞仍能表达肝细胞标志物ALB、胆管上皮细胞标志物CK-19,经不含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养液继续培养后,卵圆细胞胎肝标志AFP表达量迅速下降。该研究结果表明大鼠肝卵圆细胞在表皮生长因子、白血病抑制因子等培养条件下可长期增殖并保持干细胞活性。     

神经干细胞培养及其影响因素

背景：神经干细胞移植治疗是中枢神经系统损伤性、难治性疾病研究的热点。如何有效提高神经干细胞存活率、克隆形成率将是其应用的重要基础和前提。目的：探讨影响神经干细胞培养质量的可能因素,为神经干细胞的基础和临床应用研究提供参考。方法：①神经干细胞分离和培养：分离出生24h内SD大鼠的大脑,剪碎离心后以1×108L-1的浓度接种,经含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基预培养4h后改用无血清条件培养基（DMEM/F12,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27）培养,2d或3d换液1次,6d时传代。②神经干细胞鉴定：倒置显微镜下观察细胞形态及生物学特性;免疫组化检测第3代细胞神经巢蛋白表达和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶和神经胶质酸性蛋白的表达。结果与结论：出生24h的新生大鼠可获得足量的神经干细胞;血清预培养可提高神经干细胞的增殖和存活率;免疫组化结合血清诱导分化可对培养的神经干细胞进行定性鉴定。取材时间、细胞接种密度、传代时间、细胞因子、血清等多种因素都将影响神经干细胞的培养质量。     

小鼠毛囊来源间充质干细胞体外诱导成软骨的细胞标记物★

背景:小鼠毛囊来源的间充质干细胞有很强的多向诱导分化能力,但少有研究关注其在诱导分化为软骨细胞过程中的细胞表面标记物。目的:观察小鼠毛囊来源的间充质干细胞分化为软骨细胞过程中的形态、细胞表面标记物和硫酸黏多糖含量的变化。方法:体外分离培养ICR新生小鼠皮肤干细胞,用成软骨细胞诱导液诱导培养7,14d观察各项指标。结果与结论:经成软骨细胞诱导液处理后,小鼠毛囊来源的间充质干细胞中CD44(+)细胞数量无明显增加,硫酸黏多糖含量无变化,CD54(+)细胞和CD166(+)细胞则显著增加,两者硫酸黏多糖含量亦明显升高。表明小鼠毛囊来源的间充质干细胞能诱导形成软骨样细胞;CD44不能作为小鼠毛囊来源的间充质干细胞向软骨细胞分化的细胞表面标记物;CD54和CD166以及硫酸黏多糖可作为对小鼠毛囊来源的间充质干细胞向软骨细胞分化的监测指标。     

人脑神经干细胞对不同储存方式及分离培养和诱导分化条件的要求

背景近年来发现神经干细胞可于体外增殖并分化为神经细胞,是用来修复替代损伤神经组织的较为理想的来源,但是神经干细胞的培养中如何提高它的增殖能力,诱导分化成需要的表现型,尚处于研究探讨阶段.目的探讨细胞冻存和非冻存方法分离培养人脑神经干细胞及诱导其向成熟神经细胞分化的培养条件.设计以细胞为观察对象,单一样本研究.单位江西医学院泌尿外科研究所,江西医学院第二附属医院神经外科.材料实验于2003-12/2004-06在江西医学院泌尿外科研究所完成.取16周龄新鲜人胚脑组织.方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,细胞冻存1个月后复苏或/和新鲜细胞用无血清培养基进行体外培养,碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶的表达.观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及血清对分离培养的人脑神经干细胞增殖与分化的影响.主要观察指标①冻存与新鲜细胞后续培养的生长状况.②细胞形态变化.③神经干细胞标志物神经巢蛋白及成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶的鉴定.结果①从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞.人胚脑原代细胞为圆形亮球状,培养3d后可见细胞开始聚集成神经球,部分呈悬浮生长,2周后神经球增大,部分细胞增大数倍,具有极强折光性,可见分裂增殖.经传代后细胞仍保持原有特征,细胞形态不变.克隆细胞在有血清培养基中培养,24 h后可见大部分细胞贴壁生长,细胞从神经球游出分散,形态不规则;48 h后多数细胞分化为大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞,突起相互交织成网.②分离出的神经干细胞在体外培养条件下传代培养,并表达神经于细胞标志巢蛋白;含血清培养基培养48h分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶.③冻存复苏的细胞95%以上为活细胞,与新鲜细胞比较,细胞生长状况无明显差别.结论用无血清培养条件下结合碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的作用,使干细胞体外得到了分离培养、增殖和纯化,证实其方法可行,同时冻存和新鲜细胞的比较,说明可用冻存方法保存人胚脑细胞,复苏后使用.     

人胎脑皮质神经干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨人脑皮质中分离培养神经干细胞并鉴定其增殖及分化潜能。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术，从30周自愿水囊引产人胎脑皮质中分离出神经干细胞，并进行培养、传代、分化观察，应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从30周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长，形成神经球，该细胞具有连续克隆能力，可传代培养，表达神经巢蛋白抗原(Nestin)；在含血清培养时诱导神经干细胞分化，分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用；30周人胎脑皮质仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

胶质瘤细胞系SHG44中肿瘤干细胞存在的可能性

[摘要] 目的 探讨人类胶质瘤SHG44干细胞存在的可能性。方法 应用N2无血清培养基进行培养，碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞扩增；应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果 SHG44在无血清的培养条件下细胞的形态明显改变，部分细胞聚集成球，类似神经干细胞的神经球，呈悬浮状态生长，其余细胞贴壁生长，细胞体呈球形或椭球形，伸出双极或多极的突起。细胞表达波形蛋白和巢蛋白两种神经干细胞的标志物，细胞表达胶质纤维酸性蛋白；大部分细胞也表达神经元的标志物神经元特异性烯醇化酶、神经微丝蛋白200和βⅢ管蛋白。结论 体外的培养条件下，胶质瘤细胞系SHG44可以同时表达神经元和星形胶质细胞表型，具有干细胞的性质。