首页 | 官方网站   微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 218 毫秒
1.
肝癌及癌旁肝组织的高尔基体差异蛋白质分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 筛选并鉴定肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组中差异表达的蛋白质,从高尔基体层面解释肝癌的发生和发展机制,为早期诊断和抗癌药物的研发提供线索.方法 应用亚细胞比较蛋白质组学研究方法,比较分析肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组.收集肝癌患者手术切除的癌组织和癌旁肝组织标本,蔗糖密度梯度离心法分离高尔基体.建立并优化两种组织高尔基体的双向电泳方法,用PD-Quest软件分析差异表达的蛋白质点,然后用质谱仪获取相应蛋白点的肽质指纹图谱,联网到Swiss-Prot蛋白质组数据库鉴定获得的差异蛋白质点,最后用Western blot验证双向电泳结果.蛋白质相对表达量的比较采用配对t检验.结果 获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱.与癌旁肝组织相比,肝癌高尔基体蛋白质组有包括膜联蛋白5在内的27个蛋白质位点表达上调,包括染色体修饰蛋白2b在内的20个蛋白质位点表达下调,初步鉴定出了其中17个蛋白质,并用Western blot从蛋白质水平上验证了双向凝胶电泳结果.结论 肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组具有不同的蛋白质位点,这些差异表达的蛋白质涉及到细胞的能量代谢、肿瘤的侵袭和转移,细胞周期调控等方面,为进一步阐释高尔基体在肿瘤的发生和发展中所起的作用提供了有价值的信息.  相似文献   

2.
目的 探讨CA125阴性卵巢上皮性肿瘤患者血清相关蛋白及意义.方法 取CA125阴性卵巢上皮性肿瘤和卵巢良性肿瘤、盆腔良性病变和正常妇女血清,采用双向电泳技术分离和鉴定生理状态与病理状态的差异表达蛋白,对有差异性表达的蛋白质运用MALDI-TOF-TOF串联质谱分析.结果 成功获得重复性好的双向电泳图谱,CA125阴性卵巢上皮性肿瘤患者血清蛋白质表达谱发生了改变,综合分析得到CA125阴性时的蛋白质有8种,分别为结合珠蛋白α1、prostasin、calgranulin A、calgranulin B、溶血磷脂酸、增殖细胞核抗原、HSP60和HSP90.结论 双向电泳-质谱法对卵巢上皮性肿瘤患者血清蛋白获得重复性好的结果,上述8种蛋白能为卵巢上皮性肿瘤提供早期诊断指标.  相似文献   

3.
采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对维吾尔族高尿酸血症人群和对照组人群血清进行差异蛋白质研究,并用Western印迹法进行差异蛋白质验证.结果显示,差异表达蛋白质点数为11个,质谱成功鉴定出4个差异蛋白质,分别是补体C3、触珠蛋白、补体C4和载脂蛋白A1,均呈上调表达.Western印迹法验证了补体C3在2组人群中的差异与蛋白质组学结果相一致.  相似文献   

4.
目的 通过比较二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝细胞癌发生过程中不同阶段的蛋白质表达谱,筛选在大鼠肝癌前病变阶段起重要作用的蛋白质分子. 方法大鼠分为DEN组和正常对照组,诱癌过程中定期处死动物并取其肝组织;以γ-谷氨酰转肽酶染色阳性的肝细胞增生灶为标志,识别和获取肝癌前病变的组织标本.用双向电泳及基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法对大鼠正常肝组织、癌前病变组织和肝癌组织的全蛋白质组表达谱进行比较和鉴定.用Western blot和RT-PCR方法对部分差异表达蛋白质(如层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶)进行表达水平的验证.结果 筛选出表达水平差异≥2倍的蛋白质共82种,其中在癌前病变阶段即发生明显改变的差异表达蛋白质有47种,包括在正常对照组、癌前病变组、肝癌组呈现依次上调的层黏连蛋白受体1等8种蛋白质和在上述组织中呈现依次下调的鲱精胺酶等22种蛋白质.Western blot和RT-PCR方法对层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶表达水平的验证结果与双向电泳的结果相似.结论 大鼠肝癌形成过程中不同阶段的蛋白质表达谱有所不同,对癌前病变的差异表达蛋白质如层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶等进行深入探讨,有望为人类肝癌的早期诊断和治疗提供线索.  相似文献   

5.
目的: 对比分析肝纤维化患者和健康人血清中差异表达的蛋白质, 筛选与肝纤维化发生密切相关的血清蛋白质.方法: 肝纤维化患者和健康人空腹血清标本各6例分别等量混合成2个样本, 去除血清中的白蛋白和IgG. 利用双向凝胶电泳(2-DE)分离肝纤维化血清和健康人血清总蛋白质后, 硝酸银染色, 经图像分析筛选差异表达的蛋白点. 应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF-MS)鉴定差异表达的蛋白点, 并用ELISA法对其中部分差异蛋白的表达水平进行验证.结果: 筛选出2组间的差异蛋白点共517个, 对其中表达量差异3倍以上的24个蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析, 鉴定出包括触珠蛋白、载脂蛋白A-Ⅳ、转铁蛋白、T细胞受体b链、血清白蛋白及血清白蛋白前体等8个蛋白质, 其中3个蛋白质在肝纤维化血清中表达上调, 5个蛋白质在肝纤维化血清中表达下调. 与健康人血清比较, ELISA法检测肝纤维化血清中触珠蛋白、载脂蛋白A-Ⅳ表达均下调, 结果与双向凝胶电泳一致.结论: 肝纤维化血清与健康人血清的蛋白质表达谱表现出一定差异, 这些差异表达的血清蛋白质有望成为肝纤维化诊断与判定预后的血清标志物.  相似文献   

6.
目的筛选肝细胞癌门静脉癌栓相关的血清小分子量蛋白质标志物。方法收集健康志愿者、肝细胞癌无癌栓患者和肝细胞癌门静脉癌栓患者3组血清各l2份,用16%SDS-PAGE进行双向电泳,得到3组血清小分子量蛋白质表达图谱;经Image Master软件比对分析后,用基质辅助激光解析飞行时间质谱对差异点进行鉴定。结果在16%SDS-PAGE凝胶中,3×10^3~20×10^3区域内蛋白质条带间距较12.5%SDS-PAGE明显增宽,条带数目明显增多,且3组血清小分子量蛋白质表达图谱中均可清晰显示〈20×10^3的小分子量蛋白质斑点。组间比较显示,3组血清共有15个小分子量差异蛋白质点,经鉴定为5种蛋白质。与健康组比较,无癌栓组中载脂蛋白A-I、脂蛋白CⅢ、转甲状腺素蛋白和DNA拓扑异构酶Ⅱ表达降低,而结合珠蛋白-2表达增高;门静脉癌栓组5种蛋白质表达均较无癌栓组降低。结论在肝细胞癌的发生和发展过程中,血清小分子量蛋白质表达谱发生明显变化,差异表达的小分子量蛋白质有可能为肝细胞癌和门静脉癌栓早期预测及治疗监测提供参考。  相似文献   

7.
慢性乙型肝炎肝肾阴虚证血浆蛋白质组学   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:初步探讨参与慢性乙型肝炎肝肾阴虚证病理生理过程的分子机制.方法:采用双向电泳技术结合质谱分析等生物信息学分析方法对慢性乙型肝炎肝肾阴虚证及正常健康对照组的血浆全蛋白进行比较分析.结果:获得组间标准化总灰度值(%Vol)都相差2倍及以上的蛋白斑点共6个,通过基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,鉴定出慢性乙型肝炎肝肾阴虚证血浆蛋白中有明显规律性变化的差异表达蛋白质有4个:载脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ)、载脂蛋白AⅡ(ApoAⅡ)、结合珠蛋白(HPT)、视黄醇结合蛋白(RBP),相对于正常健康对照组,这4个差异表达蛋白质都表现为明显下调趋势.结论:以上差异表达蛋白质的组合性变化可能是慢性乙型肝炎肝肾阴虚证的物质基础,具有潜在的慢性乙型肝炎肝肾阴虚证诊断、预后标志物或治疗靶点的意义.  相似文献   

8.
目的 利用肿瘤血清蛋白质组分析方法 (serologic proteome analysis,SERPA)对胰腺癌患者血清和正常人血清进行蛋白质组的分析,寻找胰腺癌特异的肿瘤标记物.方法 利用HPLC柱去除血清中的自蛋白,通过双向电泳分离蛋白质,经图像采集与分析,切取胰腺癌患者血清和正常人血清的差异蛋白质点,进行质谱分析鉴定.结果 共获得4个差异蛋白质.正常人血清含量高而胰腺癌患者血清含量低的蛋白质为胍裂解环化酶激活蛋白2(guanylate cyclase-activating protein 2).胰腺癌患者血清含量高而正常人血清含量低的蛋白质3个,分别为结合珠蛋白2α(haptoglobin 2 alpha)、转甲状腺素蛋白(transthyretin)及KIAA1018蛋白.结论KIAA1018有望成为胰腺癌筛选和早期诊断的肿瘤标记物.  相似文献   

9.
目的比较蛋白质组,分析羟基喜树碱诱导肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡前后的线粒体蛋白质表达谱。方法用羟基喜树碱诱导肝癌SMMC-7721细胞发生线粒体跨膜电位耗散,提取线粒体并用Western blot法对线粒体纯度进行鉴定;用二维凝胶电泳分离溶解度不同的3种蛋白质组分并对蛋白质进行银染色;利用PDQuest图像分析软件分析比较凝胶结果,获得差异蛋白质;采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定部分差异蛋白质,并用Western blot法对部分差异蛋白质进行进一步的鉴定。结果羟基喜树碱成功地诱导线粒体发生跨膜电位耗散,并获得纯度很高的线粒体;通过PDQuest图像分析软件发现,线粒体发生跨膜电位耗散前后比较约有39个蛋白质点表达有差异,对其中28个差异蛋白质斑点进行了肽质指纹图分析,鉴定出20种可能的蛋白质。结论获得了羟基喜树碱诱导线粒体凋亡前后差异蛋白的相关信息,为从蛋白质水平进一步研究羟基喜树碱诱导癌细胞发生凋亡的机制奠定了基础。  相似文献   

10.
目的 探讨不同发育时期胎儿肝组织形态学及蛋白质表达谱的差异.方法 胎儿肝组织常规切片、HE染色、光学显微镜下观察肝组织形态.采用基于双向电泳-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的蛋白质组学分析方法,分析早,晚期胎儿肝脏蛋白质表达谱的差异,并与肝癌组织蛋白质表达谱比较;用Mascot软件对差异表达的蛋白质在蛋白质数据库中进行检索并鉴定.结果 早、晚期胎儿肝脏不仅组织形态学上存在明显差异,而且蛋白质表达谱也存在明显差异.与肝癌组织蛋白质表达谱比较,对有差异的和相似的32个蛋白质点进行分析,初步鉴定出26个蛋白质.它们涉及细胞的增殖、凋亡及各种物质代谢等方面.结论 提示肝癌的发生是原始胎儿肝细胞发育分化的重现,在肝癌的发生过程中由于癌细胞遗传特性的紊乱获得了某些胎儿肝细胞的特性.  相似文献   

11.
血清蛋白质组分析技术筛选肝癌自发抗体   总被引:7,自引:1,他引:7  
目的采用血清蛋白质组分析技术(SERPA)筛选、鉴定肝癌自发抗体。方法双向电泳分离肝癌细胞系HCCLM3的总蛋白后将其转膜,肝癌、肝炎和正常组血清各8份与膜免疫印迹,图像分析确定不同血清免疫印迹图谱间的差异点及其与双向电泳图谱的对应关系,最后用基质辅助激光解吸飞行时间质谱进行鉴定。结果建立了高重复性HCCLM3的双向电泳图谱及其肝癌、肝炎及正常组血清的免疫印迹图谱,图谱均点数分别为603、70.75±24.25、68.50±23.44和41.38±15.05,肝癌、肝炎组图谱点数明显多于正常组,但肝癌与肝炎组差异无统计学意义。质谱鉴定确定了核蛋白、细胞骨架、代谢酶及热休克蛋白等五类肝癌自发抗体。结论SERPA是一种高通量筛选、鉴定肿瘤自发抗体的新技术,大量肝癌自发抗体的发现为肝癌进一步的免疫诊断及治疗奠定了基础。  相似文献   

12.
目的 对比分析燃煤污染型砷中毒肝损伤患者和健康人血清中差异表达的蛋白,筛选与燃煤污染型砷中毒致肝损伤发生密切相关的血清蛋白质.方法 6例血清标本来自于贵州省兴仁县交乐病区燃煤型砷中毒肝损伤患者及病区健康人(对照组),采用双向凝胶电泳(2-DE)分离血清中总蛋白,硝酸银染色后经图像分析识别差异表达的蛋白质,基质辅助激光解吸电离飞行时问质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达的蛋白质点,寻找与燃煤污染型砷中毒致肝损伤有关的蛋白质.结果成功地建立了血清2-DE图谱.差异蛋白分析显示,砷中毒肝损伤组平均蛋白点数为(824±31)个,对照组为(782±42)个,两组血清2-DE图谱的匹配率为94.9%(782/824).筛选出两组间的差异蛋白点49个,对其中表达量差异3倍以上的30个蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析,鉴定出相关蛋白10个.与对照组比较,其中α2-巨球蛋白、B细胞受体相关蛋白31、细胞角蛋白1、载脂蛋白A-I在砷中毒肝损伤组表达上调,触珠蛋白、α2-HS-糖蛋白、细胞外信号调节激酶4、锌指蛋白323、ZAP-70、SP40表达下调.结论成功地建立了分辨率高、重复性较好的燃煤污染型砷中毒肝损伤患者血清2-DE图谱,并筛选出一些与健康人血清中差异表达的蛋白质,这些蛋白质能否作为燃煤污染型砷中毒肝损伤诊断的血清标志物还有待于进一步验证.  相似文献   

13.
HBV相关性肝细胞癌肝组织蛋白质组差异的初步分析   总被引:1,自引:1,他引:1  
目的分析HBV相关性肝细胞癌蛋白质组与癌周组织(肝硬化组织、慢性肝炎组织)蛋白质组之间的差异,鉴定其中的差异蛋白质点。方法应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳,对18例肝细胞癌组织与12例肝硬化组织、6例慢性肝炎组织的蛋白质组表达谱进行差异分析,应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行了鉴定。结果肝细胞癌组织与癌周组织的对比中,共发现有表达水平存在显著差异的47个蛋白质点,17个差异蛋白质点得到了初步鉴定,其中8个蛋白质点在既往文献中未曾报道其与肝细胞癌变相关。结论慢性肝炎基础上发生的癌变与肝硬化基础上发生的癌变,其癌变机制存在差别。本实验研究中初步鉴定的差异蛋白质,可能有助于HBV相关性肝细胞癌的癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。  相似文献   

14.
目的 应用蛋白质组学寻找溃疡性结肠炎(UC)血清差异蛋白,初步探索UC可能的生物标志物.方法 收集UC患者30例和健康对照者30名的血清标本,双向凝胶电泳(2-DE)分离等量混合血清的蛋白质,运用图像分析软件进行比较和分析,识别差异表达蛋白质.应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定部分差异蛋白质点.结果 UC组和对照组之间年龄、体重指数、吸烟情况和饮酒量的差异均无统计学意义(P值均>0.05).初步筛选出UC患者与健康对照者存在明显差异的39个蛋白点,选择其中9个点,经质谱分析发现触珠蛋白、热休克转录因子2、受体酪氨酸激酶、醛脱氢酶、载脂蛋白C-Ⅲ、中心粒旁物质1在UC患者中表达水平升高,角蛋白1、细丝蛋白A结合蛋白1、肌球蛋白3在UC患者中表达水平降低.结论 采用蛋白质组学2-DE和质谱技术,筛选并鉴定出与UC相关的9个血清蛋白质,为提供新的UC生物学行为研究分子标志物奠定基础.  相似文献   

15.

Background:

Hepatocellular carcinoma (HCC), a major fatal cancer worldwide, is induced by different etiological factors in the liver.

Objectives:

To gain insight into serum protein profiling of HCC with different etiologies.

Patients and Methods:

We subjected the sera of HBV-HCC, HCV-HCC, non-B non-C-HCC patients, and healthy volunteers to two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

Results:

We found 30 differentially expressed protein spots (≥ 1.5 fold P < 0.05) between these two analyses; of them 17 protein spots corresponding to 8 proteins were identified by MS. Transthyretin, leucine rich α-2-glycoprotein, and ficolin 3 were differentially expressed between HBV-related HCC and non-B non-C-HCC sera. Moreover, haptoglobin α-2 isoforms were decreased in HCV-HCC compared to non-B non-CHCC.

Conclusions:

Serum proteome analyses of HCC with different origins showed a differential protein pattern, presumably related to different hepatopathogenesis in liver induced by different agents. Further studies are required to clarify the importance of identified proteins for early diagnosis of HCC with different origins.  相似文献   

16.
目的 研究转染HBV X基因的人肝癌细胞株中蛋白质表达谱的改变,为筛查在HBV相关性肝细胞癌发生中发挥重要作用的关键蛋白质分子奠定基础.方法 利用分子生物学方法建立稳定表达HBV X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2+HBx,同时设空载体peDNA3转染细胞HepG2-pcDNA3及HBV全基因转染的人肝癌细胞株HepG2.2.15为对照.PCR法扩增Neo基因检测质粒DNA片段的插入,免疫印迹法检测HBx蛋白的表达.利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离3种肝癌细胞株HepG2-pcDNA3、HepG2-HBx和HepG2.2.15的总蛋白,用图像分析软件比较、分析、识别细胞间的差异表达蛋白质.统计学分析采用t检验.结果 获得分辨率高、重复性好的3种细胞的双向电泳(2-DE)图谱.软件分析表明,HepG2-pcDNA3、HepG2-HBx和HepG2.2.15细胞的2-DE凝胶可识别蛋白点分别为(2 095±137)、(2 188±105)和(2 109±20)个.比较HepG2-pcDNA3与HepG2-HBx细胞的2-DE图谱发现37个差异显著的蛋白点,其中21个在HepG2-HBx表达上调,16个下调.6个表达量差异在5倍以上(t=0.027,P<0.05);HepG2.2.15与HepG2-HBx细胞相比,有38个差异显著的蛋白点,其中35个在HepG2-HBx细胞中上调,3个下调,14个表达量差异在5倍以上(t=0.031,P<0.05).结论 HBx基因转染引起人肝癌细胞株蛋白质表达谱的变化,可能与感染的肝细胞发生恶性转化的分子生物学机制有关.  相似文献   

17.
龙云铸  范学工  李宁  黄宇琨 《肝脏》2004,9(4):238-240
目的分析乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌患者肝硬化组织与癌组织蛋白质组之间的差异,鉴定其中的差异蛋白质点。方法应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳,对12例肝细胞癌患者的肝细胞癌组织与肝硬化组织的蛋白质进行差异分析,应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行了鉴定。结果经肝细胞癌绀织与癌周组织的差异对比分析,共发现有表达水平存在显著差异的35个蛋白质点,14个差异蛋白质点得到了初步鉴定,其中5个蛋白质既往文献中曾报道其与肝细胞癌变相关。结论HBV相关性肝细胞癌蛋白质组与肝硬化组织蛋白质组之间存在差异;本实验研究中初步鉴定的差异蛋白质,可能有助于HBV相关性肝细胞癌的癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。  相似文献   

18.
目的 应用比较蛋白质组学方法筛选出肺结核患者发病免疫相关蛋白质,为阐明结核病的发病的免疫机制和诊断治疗提供理论依据.方法 收集10例肺结核患者和10名健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC),采用双向凝胶电泳分离细胞总蛋白,运用Image Master 2D Elite 5.0图像分析软件识别差异表达的蛋白质点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱获取肽质量指纹图谱,检索数据库鉴定差异表达的蛋白质点,并对差异表达的蛋白质用Western blot进行验证.两组间比较采用秩和检验.结果 建立了重复性良好的肺结核患者和健康志愿者PBMC的双向凝胶电泳图谱,找出14个表达量有明显差异的蛋白质点并鉴定出共12种蛋白质,其中冠蛋白1A等10种蛋白在肺结核组中表达上调,普列克底物蛋白(PLEK)和Ras基因抑制蛋白1(RSU1)在肺结核组中表达下调;Western blot法验证PLEK在肺结核组表达下调,与双向凝胶电泳结果一致.结论 对肺结核患者PBMC的比较蛋白质组学研究鉴定出冠蛋白1A、PLEK等12种差异蛋白质,其中PLEK和冠蛋白1A可能通过对单核巨噬细胞吞噬作用的调节在肺结核发病中起着重要作用.  相似文献   

19.
目的研究急性肺栓塞(APE)大鼠血清和正常大鼠血清的差异蛋白表达变化。方法采用血栓颈静脉注入法制备大鼠APE模型,采用双向电泳技术找出差异蛋白,用MALDI-TOF技术和生物信息学技术鉴定差异蛋白,并对部分差异表达蛋白采用Western-blot技术作进一步验证。结果大鼠血清蛋白的2-DE胶银染可分离出1 400多个点,考染可达到1 200个点以上。经图像分析得到的24个差异表达蛋白中有12个蛋白得到鉴定。对部分差异蛋白采用Western-blot方法在蛋白水平的验证结果与2-DE结果基本相符。结论采用比较蛋白质组学的方法可以发现APE大鼠血清中的差异表达蛋白,这些差异表达蛋白分子将为我们寻找新的APE血清学标志物提供重要的线索和依据。  相似文献   

20.
Purpose Serum low molecular weight protein biomarkers might be important in relation to portal vein tumor thrombi (PVTT) in hepatocellular carcinoma (HCC). This study aimed to screen and to detect these biomarkers. Methods We selected sera of 3 groups from 12 healthy volunteers, 12 HCC patients without PVTT and 12 HCC patients with PVTT, respectively. By using two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) in which the first dimension was 16% SDS-PAGE, serum protein images of 3 groups were analyzed by Image Master Software. The differential protein spots were further identified by MALDI-TOF MS/MS. Results Compared with 12.5% SDS-PAGE gel, there were more protein bands between 3 and 20 kDa in 16% SDS-PAGE gel and low molecular weight (MW) protein spots (<20 kDa) were clearly shown. Fifteen differential protein spots representing five proteins were found in the three groups by inter-class comparison and were then identified. Compared with the healthy group, apolipoprotein A-I, lipoprotein CIII, transthyretin and DNA topoisomerase II were down regulated in HCC groups while haptoglobin-2 was over expressed. All the five proteins were less in PVTT group than in non-PVTT group. Conclusion The expression of low MW serum protein changes obviously in the beginning and progressive stage of HCC, and differentially expressed low MW proteins might be the potential biomarkers in early prognostication and surveillance of treatment for HCC and PVTT.  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司    京ICP备09084417号-23

京公网安备 11010802026262号