双向凝胶电泳及质谱分析法在筛选人胃癌标记物中的应用

目的初步筛选人胃癌相关抗原,为进一步认识胃癌的发生、发展机制及其早期诊断、靶向治疗提供依据。方法采用双向凝胶电泳及免疫印迹法分离人胃癌组织的总蛋白质,以PD Quest 8.0软件分析图谱;用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱及蛋白质数据库搜索对差异蛋白点进行鉴定。结果获得分辨率高、匹配性好的人胃癌组织总蛋白双向凝胶电泳图谱,图像分析显示3块胶的点数为789±27、匹配点数为684±21、匹配率为86.7%;获得高分辨率的免疫印迹反应图谱,图像分析找出差异反应蛋白质19处,质谱鉴定共得到11种蛋白质(包括结蛋白、β微管蛋白、波形蛋白及胶转蛋白等)。结论利用血清蛋白质组分析可初步筛选、鉴定11种人胃癌相关抗原,此对进一步认识胃癌的发生、发展机制及其早期诊断、靶向治疗提供了依据。     

双向电泳结合免疫印迹技术分析蜉蝣变应原

目的用双向电泳和免疫印迹技术(Western blot)对蜉蝣提取液蛋白质组分进行分析,寻找蜉蝣主要致敏蛋白质。方法提取蜉蝣总蛋白,应用双向电泳结合免疫印迹技术,获得相应的电泳图谱和免疫印迹图谱,免疫印迹一抗为蜉蝣过敏患者血清,二抗为鼠抗人IgE抗体。结果蜉蝣蛋白质提取液经双向电泳后,考马斯亮蓝染色,电泳图谱显示约805个主要蛋白点。相对分子质量约为20 000~130 000;等电点主要集中在4.0~9.5。免疫印迹结果显示,阳性患者组与对照组的差异蛋白点数约为27个。结论双向电泳联合免疫印迹技术对蜉蝣提取液蛋白质组分分析具有实用价值,并可进一步用于变应原致敏组分的研究。     

肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的比较

目的 比较肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的表达变化情况,从中寻找特异性标志物.方法 用双向凝胶电泳分离正常人,慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清蛋白质,结合质谱技术对差异点进行鉴定; Western blot检测结合珠蛋白β链以验证蛋白质水平的表达.计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析和LSD检验进行两两比较.结果 4组血清的双向电泳图谱经软件匹配分析,并与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱相结合,成功鉴定出结合珠蛋白,SAA1、SP40等30个差异蛋白质点,K cluster聚类分析不同的变化模式.在差异蛋白质点中,7个蛋白质点均为结合珠蛋白,呈现由正常→肝炎→肝硬化持续下调、到肝癌又上调的模式.Western blot证实结合珠蛋白β链的表达与双向电泳表达相一致.结论 在肝癌发生的动态过程中各疾病阶段的血清蛋白质差异表达有4种明显变化模式,可能为肝癌的早期诊断和预后提供依据,与肝癌发生发展相关的结合珠蛋白很可能是肝硬化发展到肝癌的一个潜在早期诊断标志物.     

胰腺癌患者血清相关蛋白质差异表达的研究

目的 利用肿瘤血清蛋白质组分析方法 (serologic proteome analysis,SERPA)对胰腺癌患者血清和正常人血清进行蛋白质组的分析,寻找胰腺癌特异的肿瘤标记物.方法 利用HPLC柱去除血清中的自蛋白,通过双向电泳分离蛋白质,经图像采集与分析,切取胰腺癌患者血清和正常人血清的差异蛋白质点,进行质谱分析鉴定.结果 共获得4个差异蛋白质.正常人血清含量高而胰腺癌患者血清含量低的蛋白质为胍裂解环化酶激活蛋白2(guanylate cyclase-activating protein 2).胰腺癌患者血清含量高而正常人血清含量低的蛋白质3个,分别为结合珠蛋白2α(haptoglobin 2 alpha)、转甲状腺素蛋白(transthyretin)及KIAA1018蛋白.结论KIAA1018有望成为胰腺癌筛选和早期诊断的肿瘤标记物.     

Coronin-1 C蛋白表达与肝癌侵袭和转移相关

目的 采用膜蛋白质组学技术筛选与原发性肝癌侵袭和转移相关的分子,并加以验证.方法 以不同转移潜能的人肝癌细胞HCCLM9和MHCC97L为研究对象,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电喷雾串联质谱技术比较和鉴定差异表达的膜蛋白,进一步行Westernblot、动物模型标本和临床标本验证. 结果电喷雾串联质谱鉴定表达差异条带中蛋白质14个,其中Western blot验证coronin-1 C在人肝癌细胞HCCLM9中灰度值coronin-1 C/整合素α3比值为7.31±0.73,在MHCC97L中为2.84±0.99.coronin-1C在HCCLM9细胞中的表达水平显著性升高(t=6.27,P<0.05).在裸鼠肝癌组织中免疫组织化学提示coronin-1C表达也明显升高.115例临床病理标本免疫组织化学显示,coronin 1C表达越强,肿瘤的侵袭程度越强、临床病期越晚.结论 Coronin-1C与肝癌的侵袭和转移相关.     

猪囊尾蚴特异性抗原的筛选、鉴定和生物信息学分析

目的 对猪囊尾蚴的特异性抗原进行筛选、鉴定和生物信息学分析。 方法 四川省雅江县呷拉乡猪带绦虫病患者,口服槟榔-南瓜子驱虫,收集、制备虫卵悬液（8万个/ml）。将6头20 d龄三元杂交乳猪均分实验组和空白对照组,实验组每猪灌胃虫卵悬液1 ml。40 d后,分别制备实验组心脏血混合血清及对照组心脏血混合血清;收集、制备实验组猪囊尾蚴蛋白,进行双向电泳（2-DE）分析。将凝胶蛋白斑点转移至聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）,用实验组混合血清及对照组混合血清（均为1 ∶ 10）为一抗,羊抗猪HRP-IgG（1 ∶ 200）为二抗,进行蛋白质印迹（Western blot-ting）分析,比较两组杂交蛋白点的差异,确定猪囊尾蚴抗原抗体阳性杂交斑点,据此挖取双向电泳与之对应的蛋白点,用电喷雾离子阱型质谱仪（ESI-Trap MS）进行质谱鉴定。搜索美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站信息进行生物信息学分析。 结果 双向电泳凝胶共检测到207±9个蛋白质斑点,相对分子质量为Mr 14 400～94 000,等电点（pI）为3.0～10.0。筛选出7个特异性抗原,其中的4个分别为AF239799-1膜联蛋白（AF239799-1 annexin）、细胞支架肌动蛋白-2（cytoskeletal actin-2）、原肌球蛋白（tropomyosin）和肌动蛋白-1（actin-1）。前1个蛋白已被鉴定为猪带绦虫特异性抗原,后3个蛋白抗原与NCBI网上登录的亚洲带绦虫成虫蛋白一致,为猪囊尾蚴特异性抗原。 结论 共获得3个猪囊尾蚴特异性抗原,即细胞支架肌动蛋白-2、原肌球蛋白和肌动蛋白-1。     

染氟成骨细胞的双向电泳和质谱鉴定

目的探讨双向电泳和质谱鉴定技术在染氟成骨细胞蛋白表达变化中的意义,为探索氟骨症发病机制提供有效手段。方法采用小鼠乳鼠颅骨来源的成骨细胞进行培养,抽提染氟(2mg/L)72h组和对照组成骨细胞蛋白,用双向凝胶电泳进行分离及ImageMaster2DElite软件分析电泳图谱,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪对两组间比较具有统计学意义的差异蛋白点进行鉴定。结果在对照组成骨细胞蛋白双向电泳图谱上可观察到671个蛋白点,而在染氟组双向电泳图谱上可见到837个蛋白点;在染氟成骨细胞表达有明显差异的蛋白点经质谱鉴定出12种(7种蛋白表达增多,5种降低),主要是与细胞代谢旺盛、蛋白质氧化折叠和氧化应激等相关的蛋白。结论实验所采用的双向电泳和质谱鉴定方法可有效分离和鉴定成骨细胞蛋白点,为氟骨症的发生机制提供了有价值的新线索,表明蛋白质组学技术较其他方法具有很大的优越性。     

肺癌与正常人血清蛋白质双向电泳差异分析

利用双向电泳(2-DE)分离肺癌患者和正常人的血清蛋白质,银染显色,Umax扫描仪获取图像,Melanie4软件分析图像,寻找肺癌相关差异蛋白质.结果建立了较稳定的肺癌和正常血清蛋白质2-DE图谱,平均蛋白质点数约400个.软件分析显示,两组共有11个差异蛋白质点,其中肺癌患者量上调的差异点9个,量下调的差异点2个.提示差异蛋白质分离为进一步肺癌相关血清蛋白质的鉴定和其他肿瘤血清蛋白质组学研究奠定了良好基础.     

家族性食管癌组织中蛋白质组分析

目的探讨具有家族史的食管癌和正常食管组织内蛋白质组的表达差异,为寻找参与食管癌发生的相关蛋白奠定基础。方法采用双向凝胶电泳分离人食管癌和正常食管上皮组织的总蛋白图谱,经图像分析后,应用蛋白质谱仪对差异蛋白进行鉴定分析。结果食管癌组织中有（45±12）个蛋白为新增蛋白,同时相对正常食管上皮中有（9±3）个蛋白缺失。随机选择其中的18个位点进行质谱鉴定发现,9个蛋白质与肿瘤细胞的增殖、分化和肿瘤转移有关。其中肿瘤组织中特异表达的8个,缺失1个。结论建立了分辨率较高的食管癌组织双向电泳图谱,并识别鉴定出了一些与肿瘤相关的蛋白质,为进一步筛选食管癌特异性的分子标志物奠定了基础。     

小鼠肝癌细胞H22膜蛋白组的双向电泳

目的 运用双向电泳及生物信息学技术,对小鼠肝癌细胞H22与正常肝细胞的膜蛋白进行比较和鉴定,以期为探索膜蛋白在肝癌发生,发展及侵袭转移过程中的作用提供实验依据.方法 运用顺序抽提法结合与双向电泳兼容的膜蛋白抽提试剂盒提取小鼠肝癌细胞H22和正常小鼠肝细胞膜蛋白,用考马斯亮蓝法定量,经双向凝胶电泳分离、银染,Image Master 2D Platinum软件分析,切取差异蛋白点,采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱技术检测,Aldente软件检索Swiss-Prot数据库进行匹配鉴定. 结果与正常小鼠肝细胞膜蛋白双向电泳图谱对比分析鉴定了8个在小鼠肝癌细胞H22中表达明显增强的膜蛋白,分别为硫酸酯酶修饰因子2,蛋白激酶C和肌酸激酶Ⅱ底物蛋白3,序列装配结构组件50同系物,巨噬细胞清道夫受体Ⅰ/Ⅱ,非特异蛋白C9或f135同系物,紧密结合蛋白ZO-2,3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶,空泡蛋白序列相关蛋白52同系物.结论 已鉴定的8个膜蛋白的生理功能涉及细胞代谢、细胞增殖、细胞信号转导、细胞骨架等,且在肝癌细胞H22中表达明显增强,提示小鼠肝癌细胞H22发生发展及侵袭转移可能涉及相关膜蛋白生理功能的改变.     

乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌患者肝硬化组织与癌组织蛋白质组的差异

目的分析乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌患者肝硬化组织与癌组织蛋白质组之间的差异,鉴定其中的差异蛋白质点。方法应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳,对12例肝细胞癌患者的肝细胞癌组织与肝硬化组织的蛋白质进行差异分析,应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行了鉴定。结果经肝细胞癌绀织与癌周组织的差异对比分析,共发现有表达水平存在显著差异的35个蛋白质点,14个差异蛋白质点得到了初步鉴定,其中5个蛋白质既往文献中曾报道其与肝细胞癌变相关。结论HBV相关性肝细胞癌蛋白质组与肝硬化组织蛋白质组之间存在差异;本实验研究中初步鉴定的差异蛋白质,可能有助于HBV相关性肝细胞癌的癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。     

肝癌及癌旁肝组织的高尔基体差异蛋白质分析

目的 筛选并鉴定肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组中差异表达的蛋白质,从高尔基体层面解释肝癌的发生和发展机制,为早期诊断和抗癌药物的研发提供线索.方法 应用亚细胞比较蛋白质组学研究方法,比较分析肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组.收集肝癌患者手术切除的癌组织和癌旁肝组织标本,蔗糖密度梯度离心法分离高尔基体.建立并优化两种组织高尔基体的双向电泳方法,用PD-Quest软件分析差异表达的蛋白质点,然后用质谱仪获取相应蛋白点的肽质指纹图谱,联网到Swiss-Prot蛋白质组数据库鉴定获得的差异蛋白质点,最后用Western blot验证双向电泳结果.蛋白质相对表达量的比较采用配对t检验.结果 获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱.与癌旁肝组织相比,肝癌高尔基体蛋白质组有包括膜联蛋白5在内的27个蛋白质位点表达上调,包括染色体修饰蛋白2b在内的20个蛋白质位点表达下调,初步鉴定出了其中17个蛋白质,并用Western blot从蛋白质水平上验证了双向凝胶电泳结果.结论 肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组具有不同的蛋白质位点,这些差异表达的蛋白质涉及到细胞的能量代谢、肿瘤的侵袭和转移,细胞周期调控等方面,为进一步阐释高尔基体在肿瘤的发生和发展中所起的作用提供了有价值的信息.     

HBV相关性肝细胞癌肝组织蛋白质组差异的初步分析

目的分析HBV相关性肝细胞癌蛋白质组与癌周组织（肝硬化组织、慢性肝炎组织）蛋白质组之间的差异，鉴定其中的差异蛋白质点。方法应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，对18例肝细胞癌组织与12例肝硬化组织、6例慢性肝炎组织的蛋白质组表达谱进行差异分析，应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行了鉴定。结果肝细胞癌组织与癌周组织的对比中，共发现有表达水平存在显著差异的47个蛋白质点，17个差异蛋白质点得到了初步鉴定，其中8个蛋白质点在既往文献中未曾报道其与肝细胞癌变相关。结论慢性肝炎基础上发生的癌变与肝硬化基础上发生的癌变，其癌变机制存在差别。本实验研究中初步鉴定的差异蛋白质，可能有助于HBV相关性肝细胞癌的癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。     

Comparative Proteomics of Sera From HCC Patients With Different Origins

Background:

Hepatocellular carcinoma (HCC), a major fatal cancer worldwide, is induced by different etiological factors in the liver.

Objectives:

To gain insight into serum protein profiling of HCC with different etiologies.

Patients and Methods:

We subjected the sera of HBV-HCC, HCV-HCC, non-B non-C-HCC patients, and healthy volunteers to two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

Results:

We found 30 differentially expressed protein spots (≥ 1.5 fold P < 0.05) between these two analyses; of them 17 protein spots corresponding to 8 proteins were identified by MS. Transthyretin, leucine rich α-2-glycoprotein, and ficolin 3 were differentially expressed between HBV-related HCC and non-B non-C-HCC sera. Moreover, haptoglobin α-2 isoforms were decreased in HCV-HCC compared to non-B non-CHCC.

Conclusions:

Serum proteome analyses of HCC with different origins showed a differential protein pattern, presumably related to different hepatopathogenesis in liver induced by different agents. Further studies are required to clarify the importance of identified proteins for early diagnosis of HCC with different origins.     

Proteome analysis of cultured fibroblasts from type 1 diabetic patients and normal subjects

CONTEXT: Protein profiling of diabetic tissues could provide useful biomarkers for early diagnosis, therapeutic targets, and disease response markers. Cultured fibroblasts are a useful in vitro model for proteome analysis and study of the molecular mechanisms involved in diabetes. OBJECTIVE: The objective of the study was to isolate and characterize the proteins of cultured fibroblasts, obtained by skin biopsy, from long-term type 1 diabetic patients without complications and age- and sex-matched normal subjects as controls. DESIGN: Proteins were separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE), and the gel images were qualitatively and quantitatively analyzed. Protein identification was performed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. RESULTS: Reproducible protein maps of fibroblasts from diabetic and healthy subjects were obtained. A total of 125 protein spots were isolated and identified, among them 27 proteins not previously reported in published human fibroblast 2-DE maps, including 20 proteins never reported previously in the literature in human skin fibroblasts. Quantitative analyses revealed six protein spots differentially expressed in the fibroblasts from the diabetic vs. the control subjects (P < 0.05), representing glycolytic enzymes and structural proteins. An increase of triosephosphate I isomerase of two splice isoforms of pyruvate kinase and alpha-actinin 4 and a decrease of tubulin-beta2 and splice isoform 2 of tropomyosin beta-chain were detected. CONCLUSIONS: We generated 2-DE reference maps of the proteome of human skin fibroblasts from both normal and uncomplicated type 1 diabetic patients. Differences in glycolytic enzymes and structural proteins were found. The functional implications of the identified proteins are discussed.     

Screening and detection of portal vein tumor thrombi-associated serum low molecular weight protein biomarkers in human hepatocellular carcinoma

Purpose Serum low molecular weight protein biomarkers might be important in relation to portal vein tumor thrombi (PVTT) in hepatocellular carcinoma (HCC). This study aimed to screen and to detect these biomarkers. Methods We selected sera of 3 groups from 12 healthy volunteers, 12 HCC patients without PVTT and 12 HCC patients with PVTT, respectively. By using two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) in which the first dimension was 16% SDS-PAGE, serum protein images of 3 groups were analyzed by Image Master Software. The differential protein spots were further identified by MALDI-TOF MS/MS. Results Compared with 12.5% SDS-PAGE gel, there were more protein bands between 3 and 20 kDa in 16% SDS-PAGE gel and low molecular weight (MW) protein spots (<20 kDa) were clearly shown. Fifteen differential protein spots representing five proteins were found in the three groups by inter-class comparison and were then identified. Compared with the healthy group, apolipoprotein A-I, lipoprotein CIII, transthyretin and DNA topoisomerase II were down regulated in HCC groups while haptoglobin-2 was over expressed. All the five proteins were less in PVTT group than in non-PVTT group. Conclusion The expression of low MW serum protein changes obviously in the beginning and progressive stage of HCC, and differentially expressed low MW proteins might be the potential biomarkers in early prognostication and surveillance of treatment for HCC and PVTT.     

便秘型肠易激综合征结肠黏膜组织蛋白质组双向凝胶电泳分析

目的:分析便秘型肠易激综合征(C-IBS)患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质表达的差异．方法:采用双向凝胶电泳(2-DE)技术和计算机辅助的图像分析方法,对C-IBS患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质进行分离和比较分析．结果:正常对照组平均胶蛋白斑点数为308,C-IBS组平均胶蛋白斑点数为238,与正常对照组平均胶匹配点数为178,匹配率74．79％．有18个蛋白质点的表达量存在明显差异,其中有3个蛋白点表达发生明显上调,有15个蛋白点表达发生明显下调．结论:C-IBS患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质表达存在明显差异,可能与C-IBS的发病机制有关．     

应用免疫蛋白质组学方法鉴定日本血吸虫虫卵诊断抗原

目的虫卵可溶性抗原（soluble egg antigen,SEA）是目前日本血吸虫病免疫诊断中最常用的抗原。本研究联合应用双向凝胶电泳（2-DE）、Western blot和MALDI-TOF质谱等技术,鉴定SEA中诊断抗原蛋白质。方法 SEA经2-DE分离蛋白质后进行银染,或应用日本血吸虫感染兔血清Western blot筛选抗原蛋白点,用MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定每一抗原蛋白质分子。结果虫卵可溶性蛋白分子经2-DE分离后转印PVDF膜上,与感染兔血清孵育出现29个特异性阳性反应点,与健康兔血清出现3个非特异的阳性反应点;29个特异性抗阳性反应点中,从银染2-DE胶图上找到21个匹配的抗原蛋白质点;MALDI-TOF/TOF质谱鉴定和NCBI数据库检索,13个点（61.9%）获得匹配蛋白质,4个点（19.0%）获得匹配EST,4个点（19.0%）未能从数据库中找到相匹配的信息。重组表达筛选出的SjCHGC06040和SjP40两个抗原蛋白质,Western blot结果显示reSjCHGC06040、reSjP40均能与感染兔血清抗体发生特异性反应,具有潜在的应用价值。结论 2-DE、MALDI-TOF质谱联合Western blot的免疫蛋白质组学研究方法,用于筛选、鉴定SEA中诊断抗原蛋白质,是切实可行的;但该方法存在一定的局限性,有待进一步改进。