CD3AK细胞冻融提取液的抗肿瘤活性研究

为研究ＣＤ３ＡＫ细胞冻融提取液的抗肿瘤作用,作者采集正常人外周血分离单个核细胞（ＰＢＭＣ）,先用抗ＣＤ３的单克隆抗体（ＣＤ３ＭｃＡｂ）的ｒＩＬ－２诱导和激活,使之成为ＣＤ３ＭｃＡｂ激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ）,再制备ＣＤ３ＡＫ的冻融提取液,然后进行体内,外抗肿瘤实验。结果;低剂量的ＣＤ３ＭｃＡｂ和ｒＩＬ－２能明显诱导ＰＢＭＣ的活化和增殖;激活后的ＣＤ３ＡＫ细胞冻融提取液可抑制小鼠肝癌实体瘤细胞Ｈ２     

螺旋藻多糖对CD3AK细胞增殖能力的影响

研究了螺旋藻多糖（ＰＳ）对ＣＤ３ＭｃＡｂ激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＭｃＡｂ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ，ＣＤ３ＡＫ ｃｅｌｌｓ）增殖能力的影响。结果表明，当ＰＳ浓度为２．５μｇ／ｍｌ培养体系条件下，对ＣＤ３ＡＫ细胞具有明显的刺激细胞增殖作用（Ｐ〈０．０２）；对培养长达２３ｄ的ＣＤ３ＡＫ细胞杀伤肿瘤细胞（ＫＬ５６２细胞）的活性仍维持在较高的水平（４６．５％￣５０％）。     

CD23单克隆抗体的研制及其鉴定

目的：制备高度特异性和高纯度的抗ＣＤ２３单克隆抗体（ＣＤ２３ＭｃＡｂ）。方法：用ＥＢＶ感染的人Ｂ淋巴细胞（ＲＰＭＩ－８８６６）免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,采用杂交瘤技术,细胞ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ等方法制备、纯化和鉴定了ＣＤ２３ＭｃＡｂ。结果：筛选出了强分泌抗Ｂ细胞膜ＣＤ２３分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株（２Ｂ６）。结论：该单抗对Ｍｒ４５×１０３的ＣＤ２３分子反应具有高度特异性。     

抗人CD3,CD7—PAPs免疫毒素对T细胞的联合杀伤效应

免疫毒素杀伤试验分８组进行。主要采用改进的ＭＴＴ法测定不同浓度的抗ＣＤ３－ＰＡＰｓ、抗ＣＤ７－ＰＡＰｓ１抗ＣＤ３－ＰＡＰｓ＋抗ＣＤ７－ＰＡＰｓ、爽抗ＡＨＴＧ－ＰＡＰｓ杀伤Ｔ细胞的效率，同时以Ｂ细胞作非靶细胞对照。结果证实，两种抗人Ｔ细胞单抗和多抗ＩＴ均具有特异性杀伤Ｔ细胞的作用。     

RBC—C3b,sIL—2R,CD4／CD8在正常家兔服用三虫汤后的变化

目的：观察三虫汤对正常家兔体内ＲＢＣ－Ｃ３ｂ, ｓＩＬ－２Ｒ, ＣＤ４／ＣＤ８的影响。方法：采用连续胃管灌药,于服药前后取血测定ＲＢＣ－Ｃ３ｂ, ｓＩＬ－２Ｒ, ＣＤ４／ＣＤ８。结果：实验组用药后ＲＢＣ－Ｃ３ｂ, ｓＩＬ－２Ｒ, ＣＤ４,ＣＤ８均升高（Ｐ＜ ０．００１）, ＣＤ４／ＣＤ８下降（Ｐ＜ ０．００１）。结论：三虫汤通过ＲＢＣ－Ｃ３ｂ, ｓＩＬ－２Ｒ, ＣＤ４／ＣＤ８进行免疫调节     

抗CD3McAb诱导外周血单个核细胞活化增殖的观察

目的：观察抗ＣＤ３ＭｃＡｂ诱导人外周血单个核细胞（ＨＰＢＭＣ）活化增殖过程中的影响因素及抗ＣＤ３ＭｃＡｂ激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ细胞）免疫学特性的变化。方法：采用ＭＴＴ法和苔盼蓝染色法，ＩＬ－２依赖细胞株（ＣＴＬＬ细胞）增殖实验、ＴＮＦ－α（双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法）试剂盒以及间接免疫荧光法检测ＣＤ３ＡＫ细胞的增殖活性，ＩＬ－２，ＴＮＦ－α的产生及ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ－２Ｒ等的表达。结果：     

抗P^185McAb的制备,鉴定及其在免疫组化检测的应用

本文以ＨＥＲ－２／ｎｅｕ癌基因表达产物为抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，采用常规淋巴细胞杂交瘤技术立一株稳定分泌抗Ｐ＾１８５ＭｃＡｂ的杂交瘤株５Ｅ１２，ＭｃＡｂ５Ｅ１２属ＩｇＧ亚类，与ＳＫＢＲ－３，Ｔ４７Ｄ乳癌细胞系呈阳性反应，与ＨＴ２９，ＥＣ１０９，ＤＡＣ－１，ＳＰ２／０，成纤维细胞及小鼠ＮＩＨ３Ｔ３等细胞系列呈阴性反应，３０例乳癌组织石蜡切片同时以自制抗Ｐ＾１８５ＭｃＡｂ５Ｅ１２及进口ＭｃＡｂＣ－ｅ     

CD3AK细胞对白血病细胞的体外杀伤作用

ＣＤ３单克隆抗体（ＣＤ３ＭｃＡｂ）对Ｔ细胞具有强烈的丝裂原作用。本文显示将ＣＤ３ＭｃＡｂ联合ＩＬ－２激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ）对人急性白血病新鲜细胞和Ｋ５６２细胞均有明显匀伤作用。正常人ＣＤ３Ａ铎各型急性白血病杀伤活无差别;正常人与白血病缓解期的ＣＤ３ＡＫ细胞杀伤力类同,且自体与异体亦无区别,但是,复发期ＣＤ３ＡＫ细胞杀瘤作用明显减弱。     

CD3AK细胞治疗中晚期肝癌的初步观察

目的：观察中晚期肝细胞癌（ＨＣＣ）患者采用抗ＣＤ３单克隆抗体激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ细胞）治疗的效果。方法：４０例中晚期ＨＣＣ患者分为３组：Ａ组５１例（ＣＤ３ＡＫ细胞加化疗）;Ｂ组４５例（单纯化疗）;Ｃ组４４例（单纯ＣＤ３ＡＫ细胞治疗）。治疗前后分别作肝脏Ｂ超或（和）ＣＴ检查。并检测外周血Ｔ细胞亚群和血清可溶性白细胞介素２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）水平。结果：（１）Ａ、Ｂ、Ｃ组的部分缓解率分别为４５．     

分泌抗人IgMμ链McAb杂交瘤细胞株的建立

本文从正常人血清中分离纯化人ＩｇＭ，以此作为抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，根据ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ杂交瘤细胞建株原理，采用本室建立的常规方法，将免疫脾细胞和小鼠ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，建立了分泌抗人ＩｇＭμ单克隆抗体杂交瘤细胞株。经过间接ＥＬＩＳＡ双向琼脂扩散试验及封闭试验等方法证实，所分泌的抗体抗人ＩｇＭμ链ＭｃＡｂ，其中３Ａ４，３Ｄ３２株杂交瘤细胞经反复冻存，复苏及多次传匀能分泌高     

抗EGFR/CD3双特异性抗体的制备与功能的初步研究

目的 构建抗表皮生长因子受体(anti-EGFR)和抗CD3(anti-CD3)的双特异性抗体(anti-EGFR/CD3),并在体外初步评价其杀伤肿瘤的功能. 方法 通过基因工程技术,利用 knobs-into-holes模式分别构建表达anti-EGFR-HC-knob、anti-EGFR-LC和anti-CD3-scFV-HC-hole的载体,共同转染 Expi 293F细胞,表达双特异性抗体,依次用抗体特异的亲和层析和分子排阻层析进行纯化,再用流式细胞仪和实时无标记细胞功能分析仪评价其体外结合能力和体外肿瘤杀伤功能. 结果 成功获得较高纯度的抗体.流式细胞仪体外结合实验结果显示,双特异性抗体能够同时与EGFR+的U87 Ⅷ脑胶质瘤细胞系、HCT-116结肠癌细胞系和CD3+的Jurkat T 淋巴瘤细胞系结合,具有2种抗体的功能,同时还能很好地激活T细胞(P<0.0001);在体外杀伤效果方面,双特异性抗体作用后杀伤效果明显高于其他抗体和对照组(均为 P<0.0001),具有很好的杀伤效果. 结论 用knobs-into-holes技术获得的anti-EGFR/CD3具有较好的生物活性,为双特异性抗体的肿瘤免疫治疗奠定了一定的基础.     

特异性人工抗原提呈细胞体外激活CD19嵌合抗原受体T细胞的构建

目的 构建CD19特异性人工抗原提呈细胞(aAPC)用于体外激活扩增CD19嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞(CD19-CAR-T),并考察其杀伤效应.方法 通过慢病毒介导的方法制备以NIH3T3为细胞骨架、表达共刺激分子CD86和/或CD137L的CD19特异性aAPC (NIH3T3-CD 19/86、NIH3T3-CD19/86/137L).采用照射的CD19特异性aAPC与CD 19-CAR-T细胞按一定比例混合培养激活扩增CD19-CAR-T细胞,台盼蓝染色法检测并绘制CD 19-CAR-T细胞生长曲线;流式细胞术检测CD19-CAR-T细胞CAR表达变化及分化表型;生物发光细胞毒性法检测扩增的CD19-CAR-T细胞体外靶特异杀伤效应.结果 流式检测结果显示NIH3T3-CD19/86和NIH3T3-CD19/86/137L细胞表面分别高表达CD19、CD86和/或CD137L分子;NIH3T3-CD19/86和NIH3T3-CD19/86/137L细胞都能够高效扩增CD 19-CAR-T细胞,NIH3T3-CD19/86/137L细胞具有更好的扩增效应,其与CD19-CAR-T细胞混合培养14d后,扩增的T细胞数量明显高于NIH3T3-CD19/86细胞组(P＜0.05);同时,与刺激前相比NIH3T3-CD 19/86和NIH3T3-CD19/86/137L细胞刺激扩增的T细胞中CD19-CAR-T细胞比例显著增加(P＜0.05);扩增的CD 19-CAR-T细胞具有靶特异杀伤效应,能够特异性杀伤CD19阳性靶细胞;流式检测显示NIH3T3-CD19/86/137L扩增的CD19-CAR-T细胞含有约20％作用中心记忆性T细胞.结论 成功制备CD19特异性aAPC,其可在体外特异性扩增功能性CD 19-CAR-T细胞,为初步建立制备高质量临床级CD19-CART细胞的方法提供了技术支撑.     

Preparation and characterization for bispecific antibodies of anti-CD3 X anti-idiotype to B cell lymphocytic leukemia

Summary Bispecific antibodies (BsAbs) of anti-CD3 X anti-idiotype (Id) to B-cell lymphocytic leukemia (CLL) were prepared by chemical conjugation and direct hybridization technique of hybridoma and hybridoma without screening markers. The specificity of BsAbs from culture supernatants or ascites was assayed by indirect ELISA and indirect immunoflurescence (IF). The results showed that BsAbs could specifically react with homologous serum IgM from patients with B-CLL and cells carrying CD3 marker respectively. Cell combination test and LDH assay demonstrated that BsAb significantly increased the conjugate formation between lymphocyte activated kill (LAK) cells and Daudi cells, and enhanced the cytotoxic activity of LAK cells against Daudi cells. This project was supported by a grant from the National Sciences Foundation of China (No. 39370627).     

人p53四价功能域对提高抗体功能性亲和力的作用

目的探讨人p53四价功能域在提高抗体功能性亲和力和生物学活性方面的的作用。方法利用基因克隆技术,将人IgG3上游铰链区／p53四价功能域融合基因与前列腺癌／抗CD3双特异性单链抗体基因融合,构建多价抗体(mBsAb),测序正确后,将其亚克隆入真核表达载体进行表达,纯化表达产物,并利用流式细胞仪及^51Cr释放试验进行生物学活性测定。结果经酶切、测序分析证实mBsAb构建成功,其真核表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子量为67000,mBsAb与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为70．4％和81％,明显高于BsAb组。^51Cr释放试验结果显示,mBsAb激活的T细胞可以裂解PC-3细胞,裂解百分率明显高于IL-2组和BsAb组。结论人IgG3上游铰链区／p53四价功能域基因与抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体基因融合后表达产物的功能性亲和力和生物学活性大大提高,为提高抗体的功能性亲和力和生物学活性开辟了新的思路。     

双特异性抗体介导的CD3AK体外杀伤实验研究

目的:研究在双特异性抗体的介导下CD3AK细胞(CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞)对人小细胞肺癌细胞株LTEP-sml细胞毒作用。方法:用51Cr-Na2CrO4释放试验检测单抗(2D6、UCHT1)和双特异性抗体(WST-HT)与CD3AK共同对人小细胞肺癌细胞株的杀伤活性。结果:双特异性抗体外能明显增强CD3AK细胞对人小细胞肺癌的杀伤活性。结论:与单纯CD3AK相比加入双特异性抗体后的CD3AK细胞的细胞毒活性显著增强。     

CD3AK细胞联合BCG对膀胱癌细胞的体外杀伤活性研究

目的探讨CD3AK细胞对膀胱癌细胞的体外杀伤活性,以及CD3AK细胞与BCG联合作用于膀胱癌细胞的效应.方法采用抗CD3单抗和IL-2共同刺激健康人外周血单个核细胞诱导出CD,AK细胞;以流式细胞仪测定细胞表型;用MTT法测定CD,AK以及CDaAK联合BCG对膀胱癌细胞系(T24)的杀伤活性.结果CD3AK细胞为异质细质细胞群,其细胞类型主要是CD8 细胞;在效靶比为10:1及20:1时,培养4 d的CD:,AK细胞BCG联合作用于T24细胞的杀伤率高于二者分别对T24细胞的杀伤率.结论CD3AK细胞是一种高效的抗肿瘤效应细胞,对膀胱癌细胞具有较强的杀伤作用;CD3AK细胞与BCG对膀胱细胞呈协同杀伤作用.CD3AK细胞在膀胱癌过继免疫治疗中具有重要的临床应用前景.     

双功能抗体抗CD3/抗CyclinD1的制备及对子宫内膜癌细胞的杀伤作用

目的 :制备抗CD3/抗CyclinD1双功能抗体 ,探讨子宫内膜癌主动免疫治疗的可行性 .方法 :以化学交联方法将抗CD3单克隆抗体与抗CyclinD1单克隆抗体交联为双功能抗体 ,进行介导对子宫内膜癌细胞的杀伤作用 .结果 :该双功能抗体介导效应细胞对靶细胞的杀伤率为 6 1.2 3% ,高于单抗CD3(4 2 .15 % )的介导作用 (P <0 .0 1) ,并随着效靶比的提高杀伤率也升高 (78.96 % ) .结论 :采用化学交联法制备的抗CD3/抗CyclinD1双功能抗体具有主动免疫治疗宫颈癌的临床可行性 .     

抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达

目的 构建并表达抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体,观察其生物学活性及临床意义。方法 利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术,构建抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体融合基因,测序正确后,利用EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达,表达产物纯化后,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果 经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为1．5kb,序列与设计完全一致;SDS-PAGE和Western印迹实验证明：表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子质量为6l000;流式细胞仪结果显示：双特异性单链抗体与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为54．1％和53．7％。结论 抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性,为进一步的体内实验奠定了基础。     

抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备和活性检测

目的制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体,用以抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。方法采用常规免疫学方法制备抗抗CD3ScFv单克隆体并制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体免疫亲和层析柱,用于抗CD3ScFv蛋白和去除E-tag的Diabody[CD3×Pgp]的分离纯化。采用FACS法测定分别经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱及抗E-tag亲和层析柱纯化的抗CD3ScFv蛋白和Diabody[CD3×Pgp]对K562/A02和Jurkat细胞特异结合活性。采用间接ELISA法进行抗抗CD3ScFv抗体特异性结合活性的检测。结果抗抗CD3ScFV单克隆抗体能特异性地与抗CD3ScFv蛋白结合而不与血清发生反应。经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱和经抗E-tag亲和层析柱纯化后的抗CD3ScFv蛋白均能与Jurkat细胞特异结合。经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱纯化的去除E-tag的Diabody[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合的阳性率分别为89.87%和83.95%;与其亲代抗体竞争结合K562/A02和Jurkat细胞后,结合率分别下降为56.30%和43.78%。结论制备了抗抗CD3单克隆抗体和亲和层析柱,可用于抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。     

角蛋白19致敏的DC/CTL对MCF-7体外抑瘤作用的实验研究

目的探讨体外经角蛋白19（K19）致敏的树突状细胞（DC）诱导的细胞毒T细胞（CTL）对MCF-7细胞株的抑瘤作用.方法经抗原多肽K19体外致敏外周血来源的DC诱导特异性CTL,流式细胞仪检测DC表面标志及细胞因子分泌,3H-TdR掺入法检测DC诱导CTL增殖,51Cr释放法测定CTL对MCF-7细胞的杀伤活性.结果外周血单个核细胞经体外扩增培养出可见树突状形状的DC,流式细胞仪检测细胞表面CD83、CD40、CD80及CD86高表达,混合淋巴细胞反应观察经K19致敏的DC刺激的自体淋巴细胞增殖明显较对照组高（P＜0.01）.在同一效靶比时,K19致敏的DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤率与对照组比较差异有显著性（P＜0.01）,且随着效靶比增加,杀伤作用增强（P＜0.01）.结论DC在体外经K19抗原致敏后,可诱导产生对MCF-7细胞有特异性杀伤作用的效应细胞杀伤MCF-7细胞,且随效靶比增加,杀伤力增强.