VEGF165基因联合抗细胞间黏附分子-1单克隆抗体对内膜损伤后血管重塑的影响

目的:探讨VEGF165基因联合抗细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体对大鼠股动脉内膜损伤后血管重塑的影响.方法:采用球囊拉伤术制备SD大鼠(40只)股动脉内膜损伤模型,将动物随机分为联合组、基因组、抗体组及手术对照组(各10只),通过尾静脉分别注射加有VEGF165cDNA 抗ICAM-1单克隆抗体、VEGF165 cDNA、抗ICAM-1单克隆抗体的生理盐水1 ml,手术对照组仅注射生理盐水1 ml.分别于注射后24 h或14 d观察各组动物注射后股动脉内膜的变化,并应用免疫组织化学染色、光镜和电镜等方法检测损伤局部血管内膜的变化情况.结果:注射后24 h,联合组损伤血管内膜处有极少量中性粒细胞浸润,抗体组次之,基因组有较多中性粒细胞浸润,而手术对照组损伤内膜有大量的中性粒细胞浸润.注射后14 d,联合组损伤血管内膜厚度明显小于其他各组(P＜0.05),且内膜有大量VEGF蛋白表达.结论:VEGF基因与抗ICAM-1单克隆抗体联合应用可减轻损伤血管内皮细胞的再损伤,抑制损伤血管内膜的增生.提示两者联合有利于防止血管病理性狭窄的发生.     

抗细胞间黏附分子-1单克隆抗体对大鼠血管重塑的影响

目的:探讨抗细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体对血管球囊拉伤术后血管重塑的影响作用.方法:制备抗ICAM-1单克隆抗体,将30只SD大鼠随机分为抗体组、手术对照组及正常对照组(各10只),每组又分为24h观察组(5只)和14d观察组(5只),抗体组通过尾静脉输入抗ICAM-1单克隆抗体观察球囊拉伤后的大鼠股动...     

血管内皮生长因子基因防治兔髂动脉狭窄

目的从基因治疗方面探讨解决经皮血管成型术和其他血管再塑引起的血管内膜损伤,血管狭窄途径。方法构建了ｐｃＤＮＡ３／血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）真核表达载体,通过多聚赖氨酸基因球囊法,将ＶＥＧＦ基因定位导入球囊拉伤的兔髂动脉内壁,应用原位杂交,免疫组织化学,电磁血流量仪,扫描电镜和光镜等方法检测ＶＥＧＦ基因作用效果。结果ＶＥＧＦ基因组球囊拉伤血管２周时内膜有大量ＶＥＧＦｍＲＮＡ和蛋白表达,内膜内皮化范围明显大于空载质粒对照组,内膜与中膜面积之比小于对照组,血流量明显改善。结论血管内导入ＶＥＧＦ基因,可促进内皮细胞增生,加速损伤内膜的修复,抑制血管内膜平滑肌细胞的增生,防治血管狭窄     

联合转染VEGF和PCNA-ASODN对血管成形术后再狭窄的影响

目的探讨联合转染血管内皮生长因子(VEGF)基因和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸(PCNA-ASODN)对血管成形术后再狭窄的影响。方法 32只新西兰纯种大白兔随机平均分为对照组、转染VEGF组、转染PCNA-ASODN组、联合转染VEGF和PCNA-ASODN组(联合转染组)。构建兔的股髂动脉球囊损伤术后再狭窄模型,以医用生物蛋白胶作为缓释载体,将300μg PCNA-ASODN或VEGF均匀喷布于处理血管段外膜。取损伤处理血管段标本,光学显微镜观察损伤血管内膜、中层结构和局部血栓形成情况;电子显微镜观察新生内膜内皮细胞及内膜、中膜,计算内膜/中膜(I/M)面积比与厚度比;采用RT-PCR法检测VEGF与PCNA基因的表达,采用免疫组化从蛋白质水平检测VEGF与PCNA的表达。结果联合转染组与其他组相比,其血管内皮较完整、光滑,内膜轻度增生,平滑肌细胞排列规则,外膜无明显变化;I/M面积比与厚度比明显较低(P<0.05);RT-PCR检测VEGF表达水平明显升高(P<0.05);免疫组化检测血管组织中VEGF蛋白表达阳性率较高(P<0.05)。结论联合转染VEGF和PCNA-ASODN能更有效地抑制球囊损伤术后的血管内膜增生和再狭窄的发生。     

脉冲电场介导AT2R基因在血管局部表达及其对血管新生内膜的影响

目的研究脉冲电场对血管紧张素2型受体(AT2R)基因在血管局部表达的作用,探讨AT2R基因在体转染对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的作用。方法大鼠颈动脉球囊损伤后,用脉冲电穿孔法介导AT2R cDNA真核表达质粒或空质粒载体在动脉局部表达,于术后3、7 d和21 d用免疫组织化学、HE染色等方法,进行AT2R在颈动脉壁中表达的变化及定量组织形态学分析。结果免疫组织化学染色结果显示:脉冲电场介导AT2R cDNA真核表达质粒表达后,3 d时可见内膜、中膜、外膜大量AT2R的棕色阳性着色,7 d时可见少量棕色阳性着色,21 d棕色阳性着色几乎消失,未转染组及空质粒转染组未见AT2R的棕色阳性着色,表明脉冲电穿孔能有效导入AT2R基因,并在动脉壁获得稳定表达。在21 d时,AT2R cDNA真核表达质粒组的内膜面积与中膜面积比显著低于未转染组和空质粒载体组[分别为(0.76±0.08)、(1.39±0.08)、(1.32±0.10),P<0.01],空质粒转染组和未转染组间无统计学差异(P>0.01)。结论脉冲电穿孔可介导AT2R基因在血管局部有效表达,AT2R在体转染可抑制球囊损伤后大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖和新生内膜增生。     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转移预防再狭窄的实验研究

目的 观察腺病毒介导的血管内皮生长因子(vEGF)基因转移对大鼠颈总动脉损伤后新生内膜增生的影响。方法 将颈总动脉球囊损伤的大鼠分为3组，用局部灌注法将50μl溶液注射至颈总动脉。20min后恢复血流。分别于14d和28d处死大鼠。观察vEGF基因转移对再内皮化及内膜增厚的影响。结果 与两对照组比较，动脉损伤后14d和28d时，VEGF基因转移加速血管再内皮化，减少内皮缺失区域(P＜0．05)；且显著抑制动脉损伤后新生内膜增厚(P＜0．01)。结论 重组腺病毒介导VEGF基因转移对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

高同型半胱氨酸血症对大鼠血管损伤局部新生内膜形成和炎症因子(ICAM-1、MCP-1)表达的影响

目的:研究高同型半胱氨酸血症(HHCY)对大鼠颈动脉球囊拉伤后新生内膜形成和局部炎症因子(ICAM-1、MCP-1)表达的影响。方法:250~280g Wistar雄性大鼠48只,HHCY组24只,L-甲硫氨酸1g/kg.d灌胃制备HHCY大鼠模型;对照组24只,饮用水灌胃。4wk后行左颈动脉球囊拉伤,3d、7d、14d、28d处死取材,固定、包埋、切片,染色。检测血管损伤后新生内膜增生、平滑肌细胞增殖、内皮覆盖和局部MCP-1、ICAM-1表达情况。结果:HHCY组血浆同型半胱氨酸(Hcy)浓度明显高于对照组(106.19±19.75μmol/L vs4.90±0.10μmol/L)。血管损伤后14d、28d,HHCY组比对照组新生内膜增生面积增加41%、30%。14dHHCY组内膜、中膜增殖细胞核抗原(PCNA)阳性颗粒百分比是对照组的1.7倍和2.3倍。14d、28d血管内皮覆盖率HH-CY组比对照组减少52%和31%。HHCY组血管损伤局部ICAM-1、MCP-1表达增强,ICAM-1主要分布在内皮下和新生内膜,MCP-1主要分布在内膜和中膜,3d、7d明显,持续28d。结论:HHCY使血管损伤局部新生内膜增生显著,促进平滑肌细胞增殖,抑制内皮修复、上调局部炎症因子ICAM-1、MCP-1表达是其致病机制。提示HHCY可能是血管成形术后再狭窄发生的重要的危险因素。     

雷红冲剂对兔动脉球囊损伤术后狭窄影响的实验研究

目的探讨雷红冲剂对兔动脉球囊损伤术后狭窄的干预作用。方法健康新西兰大白兔40只,随机分为假手术组、模型组、雷红冲剂低剂量组、雷红冲剂高剂量组,每组10只。运用球囊原位扩张、拉伤致兔髂动脉损伤建立经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)后内皮损伤模型。观察雷红冲剂对损伤血管内膜及管腔内径的影响。结果球囊损伤侧血管均显示弥漫性内膜增厚,光镜下形态学观察增生内膜以增殖的梭形平滑肌细胞为主。与假手术组比较,模型组管腔面积明显缩小(P<0.001),内膜、中膜显著增生(P<0.001);与模型组比较,雷红冲剂低、高剂量组管腔面积及内膜增生程度均明显改善(P<0.001),两组比较高剂量组优于低剂量组。与模型组比较雷红方对增殖细胞核抗原(PCNA)、血管内皮生长因子(VEGF)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)表达有减少的趋势(P<0.01),对细胞周期调控蛋白(p21cip1)表达有升高趋势(P<0.01)。结论雷红冲剂可抑制损伤血管的内膜增生,对兔髂动脉球囊损伤术后狭窄有不同程度的抑制作用。     

Egr-1诱骗寡核苷酸对大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增殖及内皮功能的影响

目的探讨早期生长反应因子1(Egr-1)诱骗寡核苷酸(诱骗基因)对大鼠颈总动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖及内皮功能的影响。方法建立Wistar雄性大鼠颈总动脉球囊损伤模型。随机分4组,每组4个时相点(3,7,14,21d),每个时相点3只大鼠。取大鼠颈总动脉行病理形态学检查和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色,同时测定血清一氧化氮(NO)水平。结果对照组1(对照基因组)和对照组2(转染试剂组)分别与诱骗基因组相比,球囊损伤后7d可见内膜增生,14d、21d增生更明显(P<0.01)。正常动脉未见PCNA表达,动脉损伤后7d,新生内膜及中膜中PCNA阳性表达达高峰,14d后逐渐下降。诱骗基因治疗后,与对照组1和对照组2相比,动脉PCNA表达减少(P<0.01)。诱骗基因组NO含量较两对照组增高,第14d最明显(P<0.01)。结论Egr-1诱骗寡核苷酸可抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖并能升高血中NO水平。     

大鼠动脉内膜损伤后血管重塑相关因子的动态变化

目的:研究大鼠血管内膜损伤后血管重塑的相关因子,包括基质金属蛋白酶(MMP-1,MMP-2),金属蛋白酶组织抑制物(TIMP-2),转化生长因子-1β(TGF-1β)的变化规律。方法:建立大鼠胸主动脉球囊拉伤模型,分为对照组,术后3d、5d、8d、14d、21d和35d组。采用免疫组化方法检测各因子的表达。结果:动脉内膜损伤后3d各因子均明显表达增加,随后下降,TGF-β1至术后8d,MMP-1至术后14d,MMP-2至术后21d降低至与对照组无区别,TIMP-2至术后21d仍持续高于对照。结论:大鼠血管损伤后修复过程中各因子作用时间窗不完全相同,动脉球囊拉伤术后3周内可能是药物干预的最佳时机。     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

构建人血管内皮生长因子cDNA逆转录病毒表达质粒

目的 :构建人血管内皮生长因子 ( VEGF) c DNA逆转录病毒表达质粒。方法 :采用 PCR方法从 pc DNA- VEGF165质粒中扩增 VEGF165基因 ,在序列两端分别引入 Eco R 和 Bam H 限制性内切酶识别位点 ,并克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中。结果 :酶切鉴定、PCR扩增以及DNA序列分析表明已经将 VEGF165基因全长序列克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中 ,获得了 p LXSN- VEGF165重组质粒。结论 :成功地构建了人 VEGF c DNA逆转录病毒表达质粒 ,为进一步临床应用 VEGF c DNA转基因治疗奠定了基础     

VEGF165cDNA治疗缺血心肌的实验研究

目的：观察VEGFl65cDNA治疗缺血心肌后心功能、血流动力学、心肌灌注和代谢的变化。方法：健康杂种犬36只，随机分为VEGFl65cDNA和空质粒(pcDNA3：1)组(n＝12)，心肌梗塞组为对照组。Amroid环致慢性心肌缺血模型。VEGFl65基因转染采用直接心肌注射法。结果：基因转染后4周、8周时VEGF165基因组LVEF和CO及前壁、前侧壁、前间壁心肌灌注量、代谢和FDG摄入量明显高于同期心肌梗塞组。结论：VEGFl65基因治疗后4周和8周时心功能显著改善；成活心肌的数量显著增加和/或称成活心肌功能显著恢复。     

反义VEGF165真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。     

人血管内皮生长因子的克隆表达及活性鉴定

【目的】克隆人血管内皮生长因子165基因,并测定蛋白质的表达及鉴定其活性。【方法】用PCR法从人心脏cDNA文库中钓取目的基因VEGF165,插入质粒PUC19中并测序鉴定。构建真核表达重组质粒AdtrackCMV-VEGF165转染293细胞,用RNA斑点杂交和Westernblot方法检测VEGF165基因表达,并通过Miles试验检测VEGF165蛋白活性。【结果】PCR产物为582bp,测序结果表明其序列正确,在RNA和蛋白水平检测到VEGF165基因表达,VEGF165蛋白相对分子质量为22ku,具有生物学活性。【结论】成功地克隆了有表达生物学活性的VEGF165基因。     

带信号肽人VEGF165 cDNA克隆

目的：克隆带信号肽人ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ,以便进一步在真核系统表达人ＶＥＧＦ１６５蛋白或基因治疗。方法：设计引物;从人胎脑ｃＤＮＡ文加ＰＣＲ扩增目的基因;ＤＮＡ片段回收与酶切鉴定;与Ｍ１３ｍｐ１８重组;单链序列测定。结果：克隆片段与人ＶＥＧＦ１６５ｃＤＮＡ序列一致。结论：克隆ＤＮＡ片段为带信号肽人ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ。     

脑梗死大鼠经血管内皮生长因子165基因治疗后热休克蛋白70的表达

目的观察脑梗死大鼠经血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗后热休克蛋白70(HSP70)的表达。方法将25只大鼠随机均分为以下5组:正常对照组(A组);假大脑中动脉闭塞(MCAO)组(B组);MCAO组;空载质粒对照组(D组);hVEGF165基因治疗组(E组)。建模7 d后采用免疫组化的方法观察各组动物脑组织中的HSP70 的表达。结果(1)在皮质中,A、B两组HSP70均低表达(P>0.05);C、D两组表达均较高(P>0.05),与A、B两组相比有较显著的差异(P<0.01);E组表达最强,与各组相比均有显著差异(P<0.01)。(2)在半暗带中,C、D、E各组HSP70 表达均较高,C、D两组间无显著差异(P>0.05),而E组显著高于C、D组(P<0.01)。(3)在梗死灶内,E 组表达较高,显著高于C、D组(P< 0.01)。结论经hVEGF165基因治疗的脑梗死大鼠HSP70表达显著增高,提示VEGF165基因可诱导HSP70的表达。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

VEGF165基因治疗鼠脑梗塞分子机制的初步研究

目的 :探讨血管内皮生长因子 16 5 (VEGF16 5 )基因治疗鼠脑梗塞中的有关分子表达情况 ,为临床研究脑硬塞的分子机制提供依据。方法 :采用改进的线栓法制成Wistar大鼠永久性大脑中动脉闭塞 (MCAO)模型 ,将质粒载体与VEGF16 5 (VascularEndothelialGrowthFactor)基因构成的重组DNA经颅骨注入到梗塞区 ,7d后断头取脑 ,用免疫组化的方法显示脑中的HSP70 (HeatShockProtein)和VEGF蛋白表达情况。结果 :治疗组VEGF和HSP70表达显著增高。结论 :缺血脑组织具有摄取并表达外源性VEGF基因的能力 ,且VEGF基因可诱导HSP70的表达