Bio-Oss胶原支架材料体外结构及细胞黏附生长观察

目的 观察兔骨髓间充质干细胞(BMSC)在Bio-Oss胶原材料上的生长情况和Bio-Oss胶原作为骨组织工程支架材料的优点.方法 扫描电镜观察Bio-Oss多孔矿化骨及Bio-Oss胶原结构,并与人体松质骨结构进行比较.扫描电镜观察体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSC)在Bio-Oss胶原表面生长、黏附、基质分泌情况.结果 Bio-Oss多孔矿化骨孔隙率为65%,孔径700μm,孔孔之间交通相连,形成网络立体空间结构.BMSCs Bio-Oss胶原复合物培养7d后断面可见BMSC充分伸展,似成纤维细胞形态黏附在Bio-Oss胶原表面,并有细胞重叠.一些细胞和细胞外基质充填于Bio-Oss胶原孔隙中.结论 Bio-Oss胶原骨与人体骨结构相似,是一种很有前途的骨组织工程的支架材料.     

BMSCs复合CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料的生物相容性研究

目的:研究CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料的生物相容性,为骨组织工程提供一种新型复合支架材料。方法:制备CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料。将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料联合培养,体外成骨诱导培养2周,扫描电镜观察细胞黏附情况,MTT法分析细胞增殖情况以评价其组织相容性。结果:扫描电镜示细胞在新型支架上吸附、生长良好。MTT示BMSCs在材料上和单纯诱导的细胞增殖能力基本相同。结论:CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料是一种具有良好生物相容性的支架材料,有望在骨组织工程中得到广泛应用。     

骨髓基质干细胞与黄芪-壳聚糖/聚乳酸支架对犬牙周骨缺损再生的影响

目的:探讨以犬骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)为种子细胞、黄芪-壳聚糖/聚乳酸(astragalus polysaccharides-chitosan/polylactic acid,AP-C/PLA)为支架移植对水平型牙周骨缺损再生的影响。方法:分离并诱导培养自体犬BMSCs细胞,与AP-C/PLA、壳聚糖/聚乳酸(chitosan/polylac-ticacid,C/PLA)支架构建组织工程复合物随机植入10只犬双侧下颌第3,4前磨牙水平型牙周骨缺损处,共40个实验牙位,每组10个牙位,共设4组:空白对照组;AP-C/PLA 培养基对照组;C/PLA BMSCS材料对照组;AP-C/PLA BMSCS实验组。8周后分别收集牙周标本作组织检查和组织学测量。另取2只犬植入AP-C/PLA BMSCS,4周后作组织学检查。结果:体外诱导培养的BMSCs表达Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶活性(alka linephos phatase,ALP);4周实验组缺损部位均有不规则的新骨形成;第8周时,新骨逐渐成熟,各组均有不同程度的牙周再生:实验组牙槽骨修复高度和修复率[(2.90±0.41)mm,57.46%]明显高于空白对照组[(0.83±0.30)mm,15.68%]、培养基对照组[(1.46±0.55)mm,30.13%]、材料对照组[(2.67±0.26)mm,51.87%](P<0.01,P<0.01,P<0.05)。结论:黄芪多糖具有促进牙周缺损部位骨形成作用,以BMSCs为种子细胞、黄芪-壳聚糖/聚乳酸为支架的组织工程复合物修复水平型牙周骨缺损可获得部分的牙周组织再生。     

黄芪-壳聚糖/聚乳酸多孔支架对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的:观察黄芪-壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸多孔支架复合材料对犬骨髓基质细胞(BMSCs)的黏附、生长及分化的影响,寻找较合适的牙周骨组织工程复合物支架材料。方法:将诱导分化的犬BMSCs分别与黄芪-壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸支架体外培养。第5天取材,测定2种材料的吸附率,用扫描电镜观察超微结构,以免疫组织化学检测I型胶原,放射免疫法检测骨钙素的分泌情况。结果:BMSCs与2组材料均能形成良好贴附,黄芪-壳聚糖/聚乳酸复合材料上贴附的细胞吸附率、Ⅰ型胶原及骨钙素的分泌量高于壳聚糖/聚乳酸组。结论:黄芪-壳聚糖/聚乳酸能促进BMSCs生长、分化及基质分泌,是一应用前景良好的组织工程骨构建复合材料。     

组织工程骨提升上颌窦后与种植体骨整合观察

目的 研究冻干骨支架与骨髓基质细胞（BMSCs）复合的组织工程骨进行实验犬上颌窦提升种植体植入后的骨整合情况。方法 应用冻干骨支架与BMSCs复合的组织工程复合物进行实验犬上颌窦提升，分别于即刻和术后3个月（对照）植入种植体，种植体植入3个月后通过大体标本、X线及硬组织切片观察骨整合情况。结果 3个月后即刻种植组和对照组的种植体大体标本、X线及硬组织切片均可见种植体周围包绕着致密的骨组织，未观察到任何间隙和结缔组织长入，种植体与人工骨整合良好，两组间未见明显差别。结论 冻干骨支架与BMSCs复合的组织工程复合物进行实验犬上颌窦提升后植入种植体，即刻与延期植入的种植体均可以与组织工程人工骨发生骨整合，效果良好。     

块状Bio-Oss在上颌窦外提升同期种植体植入术实验研究

[目的]评价块状Bio-Oss在上颌窦提升术中的成骨效果.[方法]建立上颌窦外提升实验犬模型,运用外提升方法施行上颌窦提升手术,植入块状Bio-Oss后同期进行种植体植入术.[结果]手术切口一期愈合,无感染、排斥反应及植入物脱落.术后3个月组织学观察结果可见Bio-Oss与固有骨牢固结合,新生骨生成率为14.5%±4.3%,种植体周围骨爬行高度为(6.8±0.2)mm,骨-种植体结合率为63.1%±7.1%.[结论]块状Bio-Oss提升上颌窦,塑性好,组织相容性好,成骨性能稳定.     

骨髓基质干细胞-藻酸钙复合物构建骨组织的实验研究

目的研究犬骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成骨活性和在犬体内异位成骨能力,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可能性. 方法抽取成年犬骨髓,梯度离心法获取单个核细胞,条件培养液体外培养、诱导、扩增后,进行组织化学、免疫细胞化学染色,透射电镜下观察其成骨活性.将培养的第3代细胞与藻酸钙所形成的复合物植于犬皮下,3月后行组织学检测. 结果体外培养的BMSCs Von Kossa染色可见钙结节,AKP染色及I型胶原、Osf2/Cbfα1、骨钙素免疫细胞化学染色先后呈现阳性;透射电镜下见基质钙化;组织学检测提示细胞-藻酸钙复合物体内培养3月后形成骨样组织. 结论BMSCs在大量扩增的同时,在一定条件下能向成骨细胞分化,细胞与藻酸钙复合物能在具免疫力的哺乳动物皮下形成骨样组织.BMSCs可作为骨组织工程较理想的种子细胞.     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7（BMP-7）的骨髓基质干细胞（BMSCs）,并与纳米羟基磷灰石胶原（nHAC）材料复合培养体外构建组织工程骨。方法用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养。荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;以四唑盐（MTT）实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶（ALP）活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况。结果慢病毒24h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异（P〉0.05）;RT-PCR检测到BMP-7表达,在1300bp处出现特异性条带;ELISA检测24hBMP-7蛋白含量为（150.2±18.3）pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好。结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨。     

骨髓基质干细胞-藻酸钙复合物构建骨组织的实验研究

目的 研究犬骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成骨活性和在犬体内异位成骨能力，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可能性。方法 抽取成年犬骨髓，梯度离心法获取单个核细胞，条件培养液体外培养、诱导、扩增后，进行组织化学、免疫细胞化学染色，透射电镜下观察其成骨活性。将培养的第3代细胞与藻酸钙所形成的复合物植于犬皮下，3月后行组织学检测。结果 体外培养的BMSCs Von Kossa染色可见钙结节，AKP染色及I型胶原、Osf2／Cbfαl、骨钙素免疫细胞化学染色先后呈现阳性；透射电镜下见基质钙化；组织学检测提示细胞一藻酸钙复合物体内培养3月后形成骨样组织。结论 BMSCs在大量扩增的同时，在一定条件下能向成骨细胞分化，细胞与藻酸钙复合物能在具免疫力的哺乳动物皮下形成骨样组织。BMSCs可作为骨组织工程较理想的种子细胞。     

EXPERIMENTAL STUDY ON TRANSPLANTATION OF BMP-2 GENE TRANSFECTED AUTOGENOUS BONE MESENCHYMAL STEM CELLS FOR PROMOTING BONE REGENERATION IN RABBIT MANDIBULAR DISTRACTION OSTEOGENESIS

目的:检测骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因mRNA及其蛋白的表达,探讨BMP-2基因修饰自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对兔下颌骨牵张成骨新骨形成的促进作用.方法:取新西兰白兔36只随机分为3组,每组12只.建立牵张成骨动物模型,在固定期第2天,实验组于牵张间隙注射200 μL的BMP-2基因修饰的自体BMSCs液;对照组注射等量自体BMSCs液;空白组注射等量生理盐水.分别于固定2,6周通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、免疫组化等手段检测BMP-2基因mRNA及其蛋白的表达情况.结果:实验组牵张间隙新生骨组织均可见BMP-2基因mRNA和其蛋白强阳性表达.结论:BMP-2基因修饰的自体BMSCs移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成.     

PLGA/CPC支架材料复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的体外效果评价

目的：探讨聚乳酸聚羟基乙酸/磷酸钙骨水泥(PLGA/CPC)复合骨髓基质干细胞（BMSCs）构建组织工程骨的可行性,为预防剩余牙槽嵴萎缩和促进骨再生提供科学理论指导。方法：采用溶剂浇铸-粒子沥滤技术结合相分离法制备PLGA/CPC支架材料;体外分离、培养、纯化大鼠BMSCs;第3代BMSCs经Dil染色后接种于复合支架材料。实验分为实验组（PLGA/CPC +BMSCs）和对照组（单纯BMSCs）。扫描电镜和激光共聚焦观察支架材料的孔隙率及BMSCs在支架上的黏附情况;CCK-8和碱性磷酸酶(AKP)法检测2组细胞增殖和分化。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均为200~300 μm,支架材料与细胞黏附性较好;原代BMSCs前3 d增殖较慢,3～6 d增殖较快,6 d后增殖较慢;BMSCs表面抗原CD44和CD105均呈阳性表达;茜素红和Ⅰ型胶原染色,BMSCs有良好的成骨活性;Dil染色,细胞标记率达90%以上,标记物对细胞形态无明显影响。CCK-8和AKP法检测,实验组和对照组BMSCs增殖率和AKP活性差异无统计学意义（P>0.05）。结论：PLGA/CPC是理想的组织工程支架材料。     

BMP-2基因修饰自体BMSCs移植促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究

目的:检测骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因mRNA及其蛋白的表达,探讨BMP-2基因修饰自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对兔下颌骨牵张成骨新骨形成的促进作用。方法:取新西兰白兔36只随机分为3组,每组12只。建立牵张成骨动物模型,在固定期第2天,实验组于牵张间隙注射200μL的BMP-2基因修饰的自体BMSCs液;对照组注射等量自体BMSCs液;空白组注射等量生理盐水。分别于固定2,6周通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、免疫组化等手段检测BMP-2基因mRNA及其蛋白的表达情况。结果:实验组牵张间隙新生骨组织均可见BMP-2基因mRNA和其蛋白强阳性表达。结论:BMP-2基因修饰的自体BMSCs移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成。     

富血小板纤维蛋白在犬上颌窦底提升中促骨缺损修复的作用

目的 探讨富血小板纤维蛋白(PRF)在犬上颌窦底提升中促进骨缺损修复的作用.方法 随机将6只犬的左右上颌窦分为实验侧和对照侧.实验侧上颌窦底提升术时植入羟基磷灰石(HA)-PRF复合物,对照侧植入HA颗粒,分别于术后8、12周处死3只犬,取上颌骨作为标本,环境扫描电镜及组织学观察成骨情况.结果 8周时,实验侧材料降解较少,新骨形成不成熟;对照侧材料未见明显降解,新骨形成少.12周时,实验侧材料几乎降解完全,新骨形成已成熟;对照侧材料部分降解,有新骨形成,尚不成熟.结论 PRF在上颌窦提升中促进新骨形成,提高新骨质量,有利于骨组织的愈合.     

BMP4/SDF-1壳聚糖缓释体联合BMSCs修复骨缺损的可行性分析

目的探讨骨形成蛋白4/基质细胞衍生因子1(BMP-4/SDF-1)释体联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)修复骨缺损的可行性。方法冷冻干燥和乳化交联法制备BMP-4/SDF-1壳聚糖缓释体,通过电镜扫描观察缓释体形态,酶联免疫吸附测定法检测BMP-4和SDF-1的缓释作用;体外分离培养兔BMSCs,Transwell检测缓释体对BMSCs的趋化作用,单核细胞直接细胞毒性实验检测细胞因子缓释体对兔BMSCs的增殖作用,定量聚合酶链反应检测成骨相关指标[碱性磷酸酶(ALP)/骨钙素(OCN)]茜素红染色观察带有细胞因子的缓释体对BMSCs矿化结节形成能力。结果空白组、BMP-4组、SDF-1组、BMP-4/SDF-1组的兔BMSCs增殖随着时间的增长而逐渐升高,且BMP-4/SDF-1组的兔BMSCs增殖率显著高于其他各组,差异有统计学意义(P<0.05)。将共培养的兔BMSCs小室进行结晶紫染色发现,BMP-4/SDF-1组细胞穿膜数目相对空白组、BMP-4组、SDF-1组显著增多(P<0.05)。复合缓释体与兔BMSCs共培养7 d后BMP-4/SDF-1组ALP和OCN表达均明显高于其他组,差异有统计学意义(P<0.05)。BMP-4/SDF-1矿化结节较空白组、BMP-4组和SDF-1组明显增多。结论制备兔骨缺损模型,将SDF-1/BMP-2壳聚糖换实体与兔骨髓间充质干细胞联合植入兔局部骨缺损处,促进黏附增殖,诱导成骨分化填补骨缺损,BMP-4/SDF-1壳聚糖缓释体支架可以作为理想的骨缺损修复材料。     

可同时释放两种骨形态发生蛋白复合支架的制备

目的 研制一种可同时释放骨形态发生蛋白2 (BMP-2)和骨形态发生蛋白7(BMP-7)的生物活性复合支架,以应用于骨组织工程的研究.方法 分别采用复乳溶剂挥发法和相分离法制备负载BMP-2和BMP-7的聚乳酸/羟基乙酸-聚乙二醇(PGLA-PEG)微球和三维多孔的聚己内酯(PCL)支架.然后采用改良的二氯甲烷熏蒸法将PGLA-PEG微球黏附在PCL支架上,形成同时负载BMP-2和BMP-7的复合支架,并检测BMP-2和BMP-7的缓释效果.将人成骨细胞系hFOB1.19分别种植在复合支架和传统支架中,研究支架上的细胞增殖能力和成骨分化能力.结果 制备的复合支架能同时缓慢地释放BMP-2和BMP-7.细胞培养第10天,复合支架上的细胞活性优于传统支架(P＜0.01),细胞形态正常.复合支架上细胞的碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素、骨桥蛋白3种成骨基因的mRNA水平均高于传统支架(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功研制出一种可同时释放BMP-2和BMP-7的生物活性复合支架,并可用于骨组织工程的研究.     

鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞异位成骨性能

目的:观察鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能. 方法:获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞,体外分离、扩增、诱导后接种于鸵鸟羟基磷灰石支架. 支架/细胞复合物植入裸鼠背部皮下,支架单纯植入作为对照. 植入后3, 6 wk取材,通过大体、组织学观察评价成骨活性. 结果:支架/细胞复合物植入后3 wk,以软骨为主的大量未成熟骨在材料表面及孔隙内形成;植入后6 wk,更多的成熟骨形成. 在支架材料和骨组织的邻接区域见成骨细胞及破骨细胞,部分区域有血管和多核巨细胞分布,可见软骨内成骨方式. 结论:支架/细胞复合物显示良好的成骨活性,鸵鸟羟基磷灰石陶瓷可以用于骨组织工程支架材料.     

可长时间缓释骨形态发生蛋白2的聚己内酯复合支架的制备及应用

目的 制备一种可长时间缓释骨形态发生蛋2(BMP-2)的聚己内酯(PCL)复合支架,并通过检测其对人源骨髓间充质于细胞(BMSC)成骨分化的影响探讨其在骨组织工程中的应用.方法 将磷脂(PL)和BMP-2混合形成的BMP-2/PL混合物(B/P)分散在二氯甲烷中,与PCL混合后,采用相分离法制备负载BMP-2的三维PCL-B/P复合支架和PCL-B传统支架,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两种支架的BMP-2缓释效果.将BMSC种植在PCL-B传统支架和PCL-B/P复合支架中,分别采用CCK-8法和实时定量PCR(qPCR)检测两种支架上BMSC的增殖和成骨分化能力.结果 与PCL-B传统支架对比,PCL-B/P复合支架对BMP-2缓释效果更佳,缓释时间更长,可达22 d.在BMSC培养的第7、14和21天,PCL-B/P复合支架上BMSC的增殖能力均优于PCL-B传统支架(P＜0.05),且PCL-B/P复合支架上BMSC中碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原蛋白、骨钙、骨桥蛋白3种成骨基因mRNA的表达均高于PCL-B传统支架(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功地制备出一种可长时间缓释BMP-2的高分子三维PCL-B/P复合支架,其较PCL-B传统支架能更好地诱导BMSC的增殖和成骨分化.     

可降解骨组织工程支架材料修复兔下颌骨缺损的实验研究

[目的]研究比较两种可降解骨组织工程支架材料:A,聚消旋乳酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸和磷酸三钙共混物;B,聚消旋乳酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸和生物玻璃共混物与对照组聚消旋乳酸修复兔下颌骨缺损的效果,以期为骨组织工程提供理想的支架材料.[方法]24只成年新西兰兔双侧下颌骨下缘形成15mm×6mm×5mm全层骨质缺损,每一缺损作为一个实验单位,术后2周、4周、8周、12周取材行大体标本、X片观察、组织学观察、电镜观察.[结果]复合支架材料与聚消旋乳酸相比,成骨时间早,成骨面积多,血管增生明显,同期成骨量有明显差异(P<0.05).[结论]可降解支架材料生物相容性好,效果明显优于聚消旋乳酸,是一种较为理想的骨组织工程生物支架材料.     

兔骨髓基质细胞与聚DL-乳酸/羟基磷灰石生物相容性的实验研究

目的检测聚DL-乳酸/羟基磷灰石（PDLLA/HA）复合材料的特性,探讨骨髓基质细胞（BMSCs）与PDLLA/HA的生物相容性,为筛选骨组织工程的支架材料提供依据.方法将BMSCs与PDLLA/HA复合体外培养,通过形态学的观察、细胞增殖率及ALP活性的测定,观察PDLLA/HA对培养细胞的影响.结果复合培养时BMSCs能在PDLLA/HA上贴附、繁殖,其生长及功能不受影响.结论 PDLLA/HA具有良好的细胞相容性,能作为骨组织工程种子细胞的支架材料.     

掺锶磷酸钙骨水泥材料生物学性能的动物实验

目的: 评价新型磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)的生物相容性以及成骨效果,为其进一步的临床应用提供实验数据。方法: 选择新西兰大白兔30只,以其双后腿外侧髁(60个)为实验对象,随机分为CPC组、CPC+Bio-Oss组、Bio-Oss组和空白对照组4组,在兔双侧后腿外侧髁制造直径6 mm、深7 mm的骨缺损模型,按照组别分别植入CPC、Bio-Oss、CPC+Bio-Oss混合物(CPC与Bio-Oss骨粉质量比为4 ∶1)。实验动物分别在手术第4周、第12周、第24周处死,取骨缺损周围组织,HE染色进行组织学评价,并计算新骨生成率(bone ingrowth fraction,BIF); 利用免疫组织化学染色,计算阳性区域平均光密度(mean optical density,MOD), 检测术后第4周各组样本BMP-2和COL-Ⅰ的表达情况,评价各组样本在不同时间点的骨愈合情况。结果: HE染色发现,在相同时间点,与空白对照组相比, CPC组、CPC+Bio-Oss组、Bio-Oss组的BIF值明显较高(P<0.01), 其中,CPC组BIF低于Bio-Oss组和CPC+Bio-Oss组(P<0.01),CPC+Bio-Oss组与Bio-Oss组相比差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组织化学染色结果显示,与空白对照组相比,CPC组BMP-2和COL-Ⅰ的MOD值较高,但低于Bio-Oss组和CPC+Bio-Oss组(P<0.01), CPC+Bio-Oss组BMP-2和COL-Ⅰ的MOD与Bio-Oss组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论: 新型磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性,可以促进早期成骨,成骨效果稳定,长期有效。