FAD2和γ-TMT基因双价种子特异表达载体的构建及对花生的转化

根据已发表的γ-TMT基因序列（GenBank AF104220）,从拟南芥（Arabidopsis thaliana）的cDNA中分离得到γ-TMT基因,根据已发表的油菜（Brassica napus）种子贮藏蛋白基因特异表达的2S启动子（登录号J02798）序列,从油菜DNA中分离得到2S启动子。为了同时提高花生中维生素E和油酸含量,构建得到了双价种子特异表达载体pCAMBIA1300AT,它带有FAD2基因反义RNA干扰体和γ-TMT基因的种子特异表达单元。该载体已登录在GenBank上（登录号FJ362601）。通过农杆菌C58介导转化花生品种闽花6号,获得PCR阳性的转化植株。     

人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA（amiRNA）干扰载体（该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因）转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强（P〈0.05）。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。     

油菜BnROP1同源基因沉默导致拟南芥雄性不育

基于油菜杂合双显性雄性核不育系和拟南芥全基因组芯片的表达谱分析结果,选择了一个油菜差异表达基因,其对应的拟南芥同源基因为At3G51300（AtROP1）,采用荧光定量PCR方法,对油菜中该基因（BnROP1）在根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊、角果中的表达模式进行了分析,在此基础上构建了AtROP1基因的microRNA干扰载体,通过农杆菌介导的拟南芥转化,获得12株转基因苗。T1转基因植株大多出现角果数量减少或不结实、无花粉、花药萎缩以及小孢子数量大大减少的表型。对转基因T2多个株系的荧光定量PCR分析说明,目标基因的干扰是有效的,靶基因的表达水平都显著下调。说明转基因植株的雄性不育表型和ROP1基因的表达沉默有关,ROP1基因不仅控制了花粉管的极性和伸长,还和小孢子的正常发育密切相关。     

高油酸甘蓝型油菜油酸积累动态

为了解高油酸甘蓝型油菜突变种质的特点,分析了两组材料营养器官和生殖器官中油酸积累的动态变化。结果表明：营养器官油酸相对含量从高到低排序为根、茎、叶。不同生育期营养器官油酸含量变化表现为：根中,成熟期高,其次是苗期,然后是越冬期、蕾薹期、返青期,花期最低;茎中,成熟期最高,其次是返青期,花期较少,苗期、越冬期和蕾薹期最少;叶中,蕾薹期最高,花期次之,苗期、越冬期和返青期最少。油菜开花2周内,角果中油酸积累以果皮为主,第3周起则转为以种子为主。果皮中油酸相对含量在开花后3周达到最大值。油菜营养器官中的油酸与成熟种子中的油酸相对含量均呈显著正相关（r=0.81＊）。除花期外,各生育期营养器官与生殖器官中的油酸相对含量呈极显著正相关（r=0.92＊＊）。表型结果说明供试品系的油酸调控基因是组成型表达,育种上可通过检测营养器官油酸含量来预测和筛选种子高油酸含量的材料。     

VEGF基因油体表达系统构建及对拟南芥的遗传转化

为研究油体系统在植物中表达外源蛋白的优势,以油菜总DNA 为模板,通过PCR 得到油菜油体(Ycoil)及启动子序列(Ycprm)。同时,将多对合成的寡核苷酸链,通过PCR 方法拼接得到血管内皮生长因子全长基因(VEGF)。以此为基础,构建Ycoil、Ycprm、VEGF 融合表达载体p1390Ycprm-Ycoil-VEGF。将重组质粒转入农杆 菌GV3101,并用花浸染法对拟南芥进行浸染。在含潮霉素(20mg/L)的1/2MS 培养基上筛选转基因拟南芥种子(T0),获得了T1 代抗性植株,通过PCR 检测、SDS-PAGE 检测和Western blotting 检测,结果表明油菜油体及血管内皮生长因子的融合基因已经转入拟南芥中,并成功得到表达,转化率约为0.1%。     

RNAi沉默淀粉分支酶sbe3基因对水稻直链淀粉的影响

本研究利用RNAi技术,通过RT-PCR方法克隆出水稻淀粉分支酶sbe3基因片断,经两步组装法将sbe3基因片断分别正向、反向组装入pRNAi-ubi,成功构建sbe3基因RNAi转化载体pRNAi-ubi/sbe3。在农杆菌介导下,对粳稻中花11未成熟胚诱导的愈伤组织进行转化,通过PCR、Southern杂交鉴定获得一批转基因植株。半定量RT-PCR鉴定出转化苗T1代种子中sbe3基因表达被明显抑制,但只引起转基因水稻胚乳中直链淀粉含量少量的提高,说明采用RNAi仅沉默sbe3基因对水稻胚乳直链淀粉含量没有显著影响。     

甘蓝型油菜Bnl9070的表达与同源基因At2g19070的amiRNAi研究

基于原芯片杂交结果,油菜杂合双显性雄性核不育系差异表达基因Bnl9070与拟南芥At2g19070基因高度同源,在油菜可育株雄蕊中高量表达,不育株雄蕊中表达量极低。从雄性不育基因At2g19070入手,利用amiR—NAi（人工微RNA干扰）技术对其两个RNA区段分别设计靶标,转化拟南芥。在多个转基因拟南芥植株和后代中普遍观察到小孢子数量减少、成熟花粉萎缩失去活力、不结实或者少结实的不育表型。两个靶标的干扰使转基因拟南芥出现了类似的表型,基因表达抑制率都在90％以上,干扰效果好,暗示amiRNAi技术在靶标选择上具有一定的灵活性。At2g19070基因的干扰对Bnl9070的功能研究有借鉴作用。     

2,4-表油菜素内酯对烟苗幼茎生长及相关基因表达的影响

为研究油菜素内酯（Brassinolide,BR）对烟草主茎生长的影响,利用外源2,4-表油菜素内酯（2,4-Epibrassinolide,EBR）,设置0.5×10^-7 mol/L（T1）、0.5×10^-5mol/L（T2）两个浓度,以蒸馏水（CK）为对照对烟草幼苗进行喷施。分析了不同处理的烟草幼苗株高,节距及解剖结构特征,检测了茎中与细胞分裂和细胞大小调控相关基因以及与油菜素内酯（BR）、生长素（IAA）和赤霉素（GA）合成相关基因的表达量。结果表明,喷施EBR对烟草幼苗节距和株高有显著促进作用,并随处理浓度升高,促进作用增强。观察石蜡切片发现EBR处理后茎皮层薄壁细胞数目增多,单细胞面积减小。EBR处理后,细胞周期调控基因NtCYCD3表达上调,细胞大小调控基因NtARF6、NtARF16表达下调;BR信号受体基因NtBRI1,NtBIN2表达上调,BR转录因子NtBES1T表达下调;BR、IAA和GA的关键生物合成基因NtDWF4、NtYUCCA8、NtGA3ox-2表达量均上调。说明喷施EBR可促进内源BR、IAA和GA的合成基因表达,通过促进节间细胞分裂、抑制细胞大小促进烟草幼苗茎的生长。     

滇牡丹ω-3脂肪酸脱氢酶基因克隆与功能分析

ω-3脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸亚麻酸生物合成途径的关键酶。依据转录组数据设计特异性引物,使用RT-PCR方法从滇牡丹克隆得到1个FAD3基因的c DNA全长序列,命名为Pd FAD3(Gene Bank登录号为KX289610)。生物信息学分析结果表明Pd FAD3基因片段序列全长2 134 bp,包含完整的c DNA开放阅读框,编码含有450个氨基酸残基的蛋白质;Blast比对结果显示该蛋白质属于FAD蛋白质家族;系统进化树分析结果显示与芍药属芍药组植物芍药亲缘关系较近;该蛋白质属于跨膜蛋白质,亲水性较低;RT-PCR结果显示其在种子中的表达随着种子成熟出现双峰型的表达量变化,与目前所报道的其他物种的FAD3表达情况相似。为进一步研究其调控机理提供理论依据及获得含高不饱和脂肪酸转基因滇牡丹品种奠定理论基础。     

花粉管通道法验证花生Oleosin基因启动子的特异性表达

油体蛋白（Oleosin）是一类覆盖在油体表面且仅在种子中特异表达的低分子质量蛋白,能维护油体的稳定性。本研究利用花生Oleosin基因的启动子替换了pCAMBIA1301的35S启动子,构建了重组表达载体pCAMBIA1301-Oleosin-pro,利用花粉管通道法导入花生。对T0代转基因植株进行了PCR鉴定和GUS组织化学染色,结果显示：50株转基因植株有9株能扩增出目的条带,阳性率为18%,9株阳性转基因植株中有5株的子叶能被GUS染色。对GUS染色成阳性的转基因植株的子叶进行切片观察,结果显示Oleosin基因启动子驱动的GUS基因在油体蛋白中表达。     

降温方式对鸭梨采后FAD及LOX基因表达及其褐变的影响

为了研究急速降温处理与缓慢降温处理时,FAD与LOX基因表达量对鸭梨果心褐变的影响,以适时（9月中旬）采收鸭梨为材料,对鸭梨贮藏中果心部位脂肪酸含量、ω-3脂肪酸去饱和酶（ω-3 fatty acid desaturase,ω-3FAD）基因表达量、脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）活力及基因表达量进行测定。结果表明：贮藏期间,急速降温处理组果心褐变指数明显高于缓慢降温处理组,并且急速降温处理组受到低温胁迫,机体产生抗冷机制,导致果心不饱和脂肪酸（尤其是亚麻酸）含量,ω-3FAD1、FAD2表达量与LOX活力均有不同程度的增加,并且低温激活LOX基因表达,加速膜脂过氧化,降低鸭梨品质。因此,对于适时采收的鸭梨,应采取缓慢降温的方式进行贮藏,以提高鸭梨贮藏品质。     

转TaDREB3基因大豆的品质等同性分析

将抗逆基因TaDREB3转入大豆品种东农50,得到3个稳定遗传的株系,并将T4株系种子播于大田中。对3个转TaDREB3基因株系及非转基因对照株系的种子分别进行蛋白质、油份、脂肪酸、异黄酮等品质性状的等同性分析,研究转化外源基因TaDREB3后大豆原有品质性状是否有改变。结果表明：3个转基因株系和对照植株相比,蛋白质含量、油分含量和脂肪酸含量均差异不显著;转基因株系1的大豆黄素虽然和对照差异显著,但是异黄酮总含量和对照没有显著性差异。说明TaDREB3基因的导入并没有改变大豆的品质性状。     

Enrichment of carotenoids in flaxseed (Linum usitatissimum) by metabolic engineering with introduction of bacterial phytoene synthase gene crtB

Linseed flax (Linum usitatissimum L.) is an industrially important oil crop, which includes large amounts of alpha-linolenic acid (18:3) and lignan in its seed oil. We report here the metabolic engineering of flax plants to increase carotenoid amount in seeds. Agrobacterium-mediated transformation of flax was performed to express the phytoene synthase gene (crtB) derived from the soil bacterium Pantoea ananatis (formerly called Erwinia uredovora 20D3) under the control of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S constitutive promoter or the Arabidopsis thaliana fatty acid elongase 1 gene (FAE1) seed-specific promoter. As a result, eight transgenic flax plants were generated. They formed orange seeds (embryos), in which phytoene, alpha-carotene, and beta-carotene were newly accumulated in addition to increased amounts of lutein, while untransformed flax plants formed light-yellow seeds, in which only lutein was detected. Interestingly, despite the control of the CaMV 35S promoter, the expression of crtB was not observed in the leaves but in the seeds in the transgenic flax plants. Total carotenoid amounts in these seeds were 65.4-156.3 microg/g fresh weight, which corresponded to 7.8- to 18.6-fold increase, compared with those of untransformed controls. These results suggest that the flux of phytoene synthesis from geranylgeranyl diphosphate was first promoted by the expressed crtB gene product (CrtB), and then phytoene was consecutively decomposed to the downstream metabolites alpha-carotene, beta-carotene, and lutein, as catalyzed by endogenous carotenoid biosynthetic enzymes in seeds. The transgenic flaxseeds enriched with the carotenoids could be valuable as nutritional sources for human health.