荧光PCR法检测畜禽肉中的鸡源性成分

为了建立畜禽肉中鸡源性成分荧光定量PCR检测方法,以鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、兔、鸽和鹌鹑等9种动物线粒体DNA 16S rRNA基因序列为靶位点,通过比对分析设计筛选出鸡特异性引物,以9种动物肌肉DNA为模板进行特异性扩增,确立荧光定量PCR扩增条件;同时将鸡DNA模板浓度进行10倍梯度稀释,一直稀释至108倍,检测所建立的荧光PCR方法的灵敏度;并用此方法对市场上样品进行随机抽检。结果显示:所设计的鸡引物仅对鸡肉DNA模板有典型扩增曲线,Ct值为22.11,对其它动物DNA模板无扩增,特异性较强;当鸡DNA模板稀释倍数达到104倍,即DNA浓度为17.5 pg/μL时,仍有典型扩增曲线,Ct值为30.37,方法灵敏度较高;市场流通环节样品抽检结果显示所抽测样品均合格。可见,建立的基于荧光定量PCR和线粒体DNA 16S rRNA基因的畜禽肉中鸡源性成分检测方法,快速而准确,实用性强。     

利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分

以猪特异性基因序列为靶位点设计特异性引物,以常见畜禽肉包括猪肉、羊肉、兔肉、牛肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等参考动物肌肉DNA为模板,进行荧光定量PCR扩增,建立猪源性成分荧光定量PCR检测方法;并将猪肉DNA模板浓度进行8个梯度稀释,检测其灵敏度。结果显示,该方法能够有效对猪源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高,可快速准确地鉴别畜禽肉中猪源性成分。     

散装即食食品中3种食源性致病菌多重荧光定量PCR检测方法的建立

该研究旨在建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR检测方法，根据沙门氏菌侵染上皮细胞表面蛋白的invA基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因、蜡样芽孢杆菌的cer A基因分别设计3对特异性引物与探针，并对体系中引物探针的浓度以及退火温度等反应条件进行优化筛选，建立多重荧光定量PCR检测方法，同时评估其特异性、灵敏性及重复性，并应用该方法检测散装即食食品样本中致病菌，同时与国标法比对。结果表明，建立的多重荧光定量PCR检测方法能特异性地扩增沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种目标菌，其他菌株均不扩增，灵敏度分别为4×10²、3×10²、2×10² cfu/mL，且批内和批间变异系数均小于2%，重复性和稳定性良好。同时用国标法和多重荧光定量PCR法对100份散装即食食品样本进行检测比对，多重荧光定量PCR法的阳性检出率略高于传统国标法，且检测时间大幅缩短。综上所述，建立的多重荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、快速准确，在食源性致病菌快速筛查方面具有良好...     

采用荧光定量PCR方法快速检测蔬菜中沙门氏菌

为快速检测蔬菜中的沙门氏菌,建立一种荧光定量PCR检测方法。筛选出特异性引物可稳定的扩增沙门氏菌特异性基因inv A。利用循环次数Cq值和菌落数对数的线性关系得出荧光定量PCR方法对沙门氏菌检出最低浓度为18 cfu/m L。利用建立的荧光定量PCR检测方法对大连开发区3个地点采样10种蔬菜共60份样品进行检测,检测结果显示,在60份样品中有5份样品确定存在沙门氏菌,检出率为8.33%。试验证明,荧光定量PCR检测方法具有快速简便和高效特异等优势,并可定量分析,可用于蔬菜中沙门氏菌的快速检测。     

实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌

目的 建立实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法 基于鼠伤寒沙门氏菌II型限制酶基因, 设计引物及Taqman探针, 利用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果 特异性探针可从25种血清型沙门氏菌(共49株)及11株阴性对照菌株中检测出全部的11株鼠伤寒沙门氏菌。以鼠伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验, 菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系, 线性系数(R2)为0.998, 扩增效率90%, 最低检测浓度300 cfu/mL。对已接种鼠伤寒沙门氏菌的4种模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定, 两者结果一致。结论 此方法特异、灵敏、准确, 适于食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。     

基于线粒体DNACOⅠ基因鉴别畜禽肉中鸡源性成分

为建立畜禽肉中鸡源性成分的快速检测方法,以线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列为靶点,比较羊、牛、猪、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭、鹅9种动物COⅠ基因的差异位点,设计筛选鸡特异性引物,进行常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和荧光定量PCR检测。结果表明:所设计的引物仅对鸡肉DNA模板有扩增条带和典型扩增曲线,且循环阈(cycle threshold,Ct)值为21.78,对其他动物DNA模板无扩增。方法特异性较强,灵敏度较高,达pg级,可以用于畜禽肉与肉制品中鸡源性成分的快速、有效、准确检测。     

羊乳制品中牛乳成分的荧光定量PCR检测方法研究

选取牛、羊线粒体12S rRNA基因的特异性引物,以新鲜牛、羊乳样品提取模板DNA,建立了基于DNA结合染料(SYBR Green I)的实时荧光定量PCR方法,用于羊乳制品中牛乳成分的掺假鉴别检测。结果表明,该方法最低可检出新鲜羊奶中掺入2.5%的牛乳成分,并应用于11份市售羊乳制品样本中的牛、羊源性成分的鉴别。基于DNA结合染料的定量PCR检测无需电泳分离和设计标记DNA探针,具有快速、灵敏、低成本和高通量等优点,可以作为羊乳及其深加工制品中牛乳源性成分掺入检测的有效手段之一。     

利用双重PCR同时检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌方法的建立

建立能够同时检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的双重聚合酶链式反应(Polymerse chain reaction,PCR)的方法。分别根据沙门氏菌和克罗诺杆菌16S rDNA序列设计特异性引物Cro和InvA。对待检奶粉样本进行预增菌后,提取菌液基因组DNA作为模板,进行双重PCR扩增,对其特异性、灵敏度和抗杂菌干扰能力进行评估。结果表明:两对引物分别可特异性扩增出140、630bp的目的条带。双重PCR同时检测婴幼儿配方奶粉样本中两种食源性致病菌的方法具有较高灵敏度,在经过4h预增菌后可检测到初始浓度为100CFU/g的克罗诺杆菌和初始浓度为100CFU/g的沙门氏菌,且在高浓度杂菌干扰下,灵敏度无下降。在人工污染奶粉样本检测中,两种致病菌的检出准确率均达95%以上。初步建立了能同步、快速、准确、灵敏地检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的双重PCR方法。     

乳中志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为了快速、有效的检测乳中的志贺氏菌,建立一种特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,对提取的志贺氏菌DNA模板进行PCR扩增,对目的基因进行克隆和测序,然后利用荧光定量PCR方法,对志贺氏菌进行检测,确定其扩增条件。建立的方法特异性强,检测的灵敏度可达到10-6 ng/μL。利用建立的方法可检测乳中2.84 cfu/mL的志贺氏菌。该方法为快速、准确检测乳中的志贺氏菌提供了参考。     

肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对沙门氏菌invA基因设计一对特异引物,建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性检测.结果表明,所建立的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法,特异性良好,组间组内重复性良好,沙门氏菌检测下线为101CFU/mL.本研究建立了沙门氏菌特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR检测方法,为沙门氏菌的快速诊断奠定了基础.     

沙门氏菌重组酶聚合酶检测方法的建立及应用

摘 要：建立一种重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification,RPA）检测沙门氏菌（Salmonella）的方法。本研究依据沙门氏菌侵袭蛋白A基因（invA）的保守序列设计特异性引物,通过对反应时间的优化,建立的RPA方法在38?℃水浴锅中恒温反应20?min,即可实现对目的片段的有效扩增;除沙门氏菌外,其他26?种食源性致病菌均无扩增,具有良好的特异性;以沙门氏菌基因组DNA作为模板,该方法的检测灵敏度为1.1×10－3?ng/μL,与本研究应用的实时荧光聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,PCR）方法一致;人工污染实验表明,当羊肉、鸡肉和西兰花样品污染量为4?CFU/25?g,增菌8?h,即可通过RPA方法检出沙门氏菌。在人工污染实验中,RPA和PCR检测结果一致。本研究建立的沙门氏菌的RPA检测方法特异性强、操作简单、为食源性致病菌的鉴定提供了一种新的方向。     

多重实时荧光定量PCR快速检测婴幼儿奶粉中沙门氏菌、克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌

目的建立多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR,multiplex qPCR)快速检测奶粉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和克罗诺杆菌3种常见致病菌的方法。方法筛选目标菌株的特异性引物与探针,优化反应体系,建立稳定的多重q PCR反应体系。通过阳性菌株加标的方式验证体系的特异性,并确定人工污染奶粉的检出限。结果各对引物探针对目标菌株均能扩增,多重实时荧光PCR未发现交叉反应,对17株非目标菌进行检测均未检出,人工污染奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的检出限均为10~3 CFU/mL,金黄色葡萄球菌的检出限为10~4 CFU/mL。结论本研究方法可实现婴幼儿奶粉样品中3种致病菌qPCR高效率检测。     

Taqman MGB PCR定量检测水产品中沙门氏菌的方法建立

建立采用Taqman MGB实时荧光PCR法快速定量检测水产品中沙门氏菌。根据沙门氏菌fimY基因保守序列,设计引物和Taqman MGB探针,建立Taqman MGB实时PCR定量检测体系。采用本方法对24株共14种血清型沙门氏菌和17株与沙门氏菌亲缘关系比较近,以及在样品中能同时存在的常见食源性致病菌菌株进行PCR扩增。结果显示：所有的沙门氏菌菌株结果均为阳性,而非沙门氏菌菌株检测结果均为阴性,反应特异性为100%。本方法的纯菌最低检测低限为13CFU/ml,样品江瑶贝和蚬子肉中添加肠炎沙门氏菌的最低检测低限为130CFU/ml;香螺肉中添加肠炎沙门氏菌的最低检测低限为1300CFU/ml。定量关系式为y=－3.381418lnx+45.115715,R2= 0.964878。整个实验2h即可完成,可应用于水产品中沙门氏菌污染状况调查及快速检测。     

食源性致病菌多重实时荧光PCR检测扩增内标的构建及评价

多重实时荧光PCR在食源性致病菌检测中具有重要的作用,扩增内标(IAC)可用来指示其检测过程中可能出现的假阴性检测结果。采用来源于人类腺病毒基因的一段序列设计IAC,并对其检测特异性、扩增效率以及与目的致病菌基因组DNA的抗干扰扩增能力进行了评估。结果表明,本IAC引物在供试菌株中均没有非特异性扩增结果,扩增效率达99.44%,而且对供试沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌O157:H7(Escherichiacoli O157:H7)以及单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重实时荧光PCR扩增没有任何干扰,在食源性致病菌多重检测技术的建立中具有广泛的应用前景。     

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法快速检测沙门氏菌

为建立检测沙门氏菌的快速、特异、灵敏的荧光定量PCR方法,以沙门氏菌inv A基因为目的基因设计引物,并进行特异性、灵敏度和重复性实验。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法具有极强的特异性,其中沙门氏菌检出限为86copies/m L,标准曲线的相关系数为0.999,扩增效率为104%,不同浓度质粒重复性扩增实验Ct值的变异系数均3%,符合WHO对中等实验室提出的标准(CV 3%),显示了良好的重复性。结果表明该方法具有快速、简单、灵敏度高、特异性强等优点,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。     

肉制品中鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

目的 建立TaqMan探针实时荧光PCR法快速检测肉制品中鸭源性成分的分析方法。方法 以鸭生长激素(growth hormone, GH)基因为靶基因, 基于特异性保守序列设计引物和TaqMan探针, 优化反应体系和反应条件, 建立了鸭源性成分实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。结果 所建立的real-time PCR方法特异性强, 仅对鸭基因组DNA出现特异性扩增曲线, 对牛、羊、猪等其他异源性动物基因组DNA均无扩增曲线; 灵敏性高, 以鸭基因组DNA为模板, 检出限为1.0 pg; 重复性好, 不同浓度基因组DNA测定的Ct值变异系数小于4%。使用建立的real-time PCR方法对200份市售肉制品进行检测, 在11份肉制品中检出鸭源性成分, 同现行行业标准SN/T 3731.5—2013检测结果一致。结论 本研究所建立的real-time PCR方法检测具有特异性强、敏感性高、快速高效等特点, 适用于肉制品中鸭源性成分快速检测。     

实时荧光定量PCR检测食品中常见食源性致病菌

建立一种快速、准确检测食品中常见食源性致病菌的方法。通过对食品样品提取基因组DNA和实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative)条件的优化,建立了沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌和副溶血弧菌这六种食源性致病菌的实时荧光定量PCR检测方法。通过食品样品的检测,同时进行了传统方法验证。研究建立的实时荧光定量PCR鉴定方法具有良好的重复性和准确性,能够2d出具检测报告,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品快速检测,具有很好的推广应用前景。     

基于G-四链体的PCR-RCA双重扩增技术检测沙门氏菌

将聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）与滚环扩增技术（rolling circle amplification,RCA）联用,并把G-四链体互补序列嵌入到RCA扩增所需的哑铃环状模板上,通过PCR和RCA的双重扩增及特异性结合G-四链体的硫黄素T荧光信号增强的作用,达到基于G-四链体的PCR-RCA技术检测沙门氏菌（Salmonella）的目的。在优化的检测体系下,确定了沙门氏菌基因组DNA浓度对数与486 nm波长处的荧光信号强度具有良好的线性关系,回归方程为y=2.101x＋2.872 3（R2=0.992 5）,线性范围为17 fg/μL～1.7 ng/μL。根据实验的特异性分析,表明此方法适用于沙门氏菌属的检测,对人工污染沙门氏菌牛奶样品进行检测,检出限为4.28 CFU/mL。该方法具有特异性强、灵敏度高、检出限低等优点,为实现食源性致病菌的快速检测提供新的方法。     

食品中沙门氏菌FTA膜结合跨越式滚环等温扩增检测方法的建立

为实现食品中沙门氏菌的简便和快速现场检测,本研究采用FTA膜(Flinders technology associates,FTA)结合跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)方法(FTA-SRCA)建立一种新型的沙门氏菌检测方法。利用FTA膜快速提取模板DNA,根据沙门氏菌的inv A基因设计及筛选引物,建立FTA-SRCA反应体系。扩增反应在能够实现集约化检测的凹孔板中进行,反应结束后添加荧光染料观察结果。确定了该方法的特异性、灵敏度和人工污染样品的检出限,并对60个实际样品进行检测,评估其敏感性、特异性和符合率。结果表明:检测的17株沙门氏菌均为阳性结果,29株非沙门氏菌均为阴性结果,特异性良好。FTA-SRCA方法的灵敏度为6.81×100 CFU/m L,比PCR方法高100倍,比SRCA方法高10倍。对于人工污染的牛奶样品检测,FTA-SRCA方法的检出限为3.22×100CFU/m L,比PCR方法低1000倍,比SRCA方法低10倍。检测实际样品的敏感性、特异性和符合率分别为100.00%,94.64%,95.00%。本研究建立的FTA-SRCA方法具有操作简便快速、成本低廉、特异性强、灵敏度高、检出限低等优点,可用于食品中沙门氏菌的大批量集约化快速现场检测。     

鲜猪肉中沙门和金葡菌荧光定量PCR检测

通过结合两种技术-免疫磁分离技术与双重荧光定量PCR技术,建立同时、快速对鲜猪肉进行沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测方法。利用偶联有特异性抗体免疫磁球,在37℃的条件下能够有效地从250 m L循环体系中边富集边捕获目标菌。利用特异性的引物与探针,对两种食源性致病菌进行双重荧光定量PCR同时检测。本研究方法针对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测限分别达到3.6 CFU/g和9.2 CFU/g。方法总体灵敏度、特异性和准确度达到98.8%、100%以及98.9%。本研究建立的免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法比国标方法更快速和高效,适用于鲜猪肉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测。