牛轮状病毒NSP5基因SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立检测牛轮状病毒(BRV)快速特异的荧光定量RT-PCR方法,本研究针对BRV NSP5基因设计了一对特异性引物经PCR扩增目的片段,并克隆于pCI载体作为重组质粒标准品(pCI-NSP5),经优化反应条件,建立了基于NSP5基因的BRV荧光定量RT-PCR方法,并对其进行了特异性、敏感性及重复性试验。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法最佳引物浓度为10μmol/L,模板为2μL,退火温度为58℃;特异性试验结果显示,该方法除对BRV的检测结果为阳性外,对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的最低检测限为12拷贝/μL,对BRV的最低检测限为1×10~2TCID50/反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法检测30份BRV接种犊牛的粪便样品,结果 25份呈阳性,而利用VP7基因的常规RT-PCR和病毒分离方法检出的阳性样品分别为20份和25份,表明本研究建立的检测方法的敏感性高于VP7基因的常规RT-PCR方法,而与病毒分离方法的符合率为100%。以上结果表明,本研究建立的BRV NSP5基因荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以用于BRV的快速检测、病原流行病学调查以及疫苗免疫攻毒试验的病毒载量定量等研究。     

牛腺病毒5型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立针对牛腺病毒5型六邻体(Hexon)基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法。根据牛腺病毒5型Hexon基因高度保守区设计引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,对其灵敏度、特异性、重复性进行验证,建立牛腺病毒5型实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法。结果显示,构建的重组质粒pUC57-BAV5,标准曲线在10~2～10~7拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.975 2,建立检测方法的最低检测限为32拷贝/μL;应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、牛呼吸道合胞体病毒无交叉反应;重复性试验表明,同一浓度的20个平行样品的变异系数为1.4%。牛腺病毒5型TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以用于牛腺病毒5型的快速、准确的检测。     

猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。     

鸡传染性支气管炎病毒H52株TaqMan-MGB 荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究建立了一种快速的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52株定量检测方法,为进一步研究疫苗的效价检测和质量监控新方法奠定基础。针对IBV核蛋白(N)基因,设计特异的H52株荧光定量PCR检测引物和TaqMan-MGB探针,优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验,探讨荧光定量RT-PCR与EID₅₀方法测定病毒含量的相关性,并通过体外转录技术对病毒基因拷贝数进行定量分析。该方法特异性强,与其他禽源病毒均无交叉反应;该方法可检测到5.60×10¹拷贝/μL的病毒核酸,与常规PCR相比,敏感性高10倍;重复性试验的变异系数为0.9%~3.2%;与EID₅₀检测结果的相关系数r＝0.934,两种方法在检测H52株病毒效价上具有很好的相关性。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法,适合于对鸡传染性支气管炎病毒H52株病毒含量的快速定量检测。     

内蒙古白绒山羊Hairless基因实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按10³～10⁷拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r²=0.998、r²=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%(10⁷拷贝/反应除外),说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。     

牛病毒性腹泻病毒两种基因型双重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重RT-PCR检测方法,根据BVDV-1(AF091605.1、KF501393.1、MK204904.1、MN513404.1和MG923683.1)和BVDV-2(AF502399.1、MG436782.1、 AF145969.1、KC176777.1和MN513411.1)流行毒株5′-UTR保守序列设计2对特异性引物,通过优化反应条件,建立可同时检测BVDV-1和BVDV-2的双重RT-PCR方法。结果显示,该检测方法重复性好、特异性强,可分别检测出BVDV-1和BVDV-2核酸,与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、猪瘟病毒(CSFV)均不发生交叉反应;最低检测量为1×10~3拷贝/μL和1×10~2拷贝/μL;对达州及周边地区的332份临床样品进行检测,结果表明,该地区BVDV-1阳性率为7.83%,BVDV-2阳性率为0.90%,未检出BVDV-1和BVDV-2混合感染的临床样品。综上所述,建立的双重RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,可用于BVDV的临床诊断和分子流行病学调查。     

BVDV、BRV和BCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCoV)的快速检测方法,根据GenBank中登录的BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因序列设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,建立了同时检测上述3种病毒的TaqMan三重RT-qPCR方法。该方法仅对BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因扩增呈阳性,而对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、魏氏梭菌(A型、B型和D型)、多杀性巴氏杆菌(A型和B型)等犊牛腹泻相关病原扩增均呈阴性;最低检出限为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。利用本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法对29份临床样品进行检测,获得BVDV、BRV、BCoV的4种混合感染型,其中BVDV与BCoV的混合感染率最高(27.6%);与已有单重RT-qPCR方法比较,发现两种方法检测BVDV、BRV和BCoV的符合率分别为100%、96.5%、100%。结果表明,本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、可行性高等优点,可为今后BVDV、BRV和BCoV共感染引起的牛腹泻性疾病的鉴别诊断和流行病学调查提供新技术手段。     

猪源牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种荧光定量PCR检测方法,用于猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDVs)检测,同时能鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV).根据BVDVs与CSFV 5 '-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDVs 5′-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线.以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测.结果显示,该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20％～0.95％;应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7％.本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDVs、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测.     

实时荧光定量RT-PCR检测猪水疱病病毒的研究

按照猪水疱病病毒结构蛋白VP1基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了实时荧光定量RT-PCR技术,对猪水疱病病毒进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,实时荧光TaqManRT-PCR可检测到每个反应相当于1×102拷贝病毒RNA;与FMDV、VSV等其他水疱性病毒不发生交叉反应;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.993;与常规的RT-PCR比较,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。     

非洲猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

建立一种TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)保守结构蛋白P72基因的检测。参照GenBank登录的ASFV P72相关基因序列,设计合成1对特异性引物与1个TaqMan探针,通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ASFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,对该方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,该方法能有效扩增1.0×10~0～1.0×10~9拷贝/μL ASFV-P72标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0×10~0拷贝;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%。结果表明,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于临床样本中ASFV的检测,从而更好地对ASF疫情进行监测和诊断。     

猪博卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的猪博卡病毒(PBoV)序列,通过VP1/2基因设计引物和Taq Man探针建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法与PPV、PRRSV及PCV均无交叉反应,具有较高特异性,在107 copies/mL～101 copies/mL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.997,最低可检测到101copies/mL的阳性质粒。说明所建立的PBoV实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好和精确性高等优点。     

小鼠IL-6、iNOS TaqMan荧光定量PCR 检测方法的建立及应用

为探讨脑心肌炎病毒(EMCV)感染后IL-6、iNOS基因的表达水平,从分子水平深入研究EMCV的致病机制,分别针对小鼠IL-6、iNOS及管家基因β-actin 的基因序列设计特异性引物和探针,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-6、iNOS和β-actin的TaqMan real-time PCR检测方法。该方法线性关系好,IL-6、iNOS和β-actin标准曲线的相关系数均达到0.998;敏感性高,初始模板的检出下限均达到1×10¹拷贝/μL;特异性强,只有以总RNA反转录成的cDNA为模板,并加入特异性引物和探针的反应才检测到荧光信号;重复性好,组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株感染小鼠的脑、心脏中IL-6、iNOS mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,本研究建立的TaqMan real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于小鼠IL-6、iNOS基因的检测及定量分析。     

猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×10⁸至2.0×10²拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。     

.基于TaqMan探针的牛布氏杆菌实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据牛布氏杆菌BM28保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105~5.0×101拷贝范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝每微升。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

小鼠β-actin mRNA荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立定量检测小鼠β-actin mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为小鼠相关基因表达水平的分析提供方法。根据GenBank中登录的小鼠β-actin mRNA序列,针对保守区域设计并合成1对引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ技术的小鼠β-actin mRNA荧光定量PCR方法。结果表明,该方法扩增效率高(97.7%),定量线性范围广(9.3×10²~9.3×10⁷拷贝/反应),可重复性强,无非特异性扩增和引物二聚体,最小检出量为9.3拷贝/反应。试验结果为β-actin作为内参基因用于小鼠相关基因转录水平分析提供了基础。     

基于TaqMan探针的虎制品实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据虎线粒体细胞色素b核苷酸保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定虎制品的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,5.0×10⁵~ 5.0×10¹拷贝/μL范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝/μL。对豹、狮子、猫等7种非虎哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在虎制品的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用

根据GenBank公布的猪瘟病毒基因组5′非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR方法。试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著。与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2×102病毒基因组拷贝数。利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交叉免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体Sn和CD163TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)允许细胞表面的Sn和CD163受体的方法,本研究设计针对Sn和CD163基因的特异性引物和荧光探针,建立了检测PRRSV Sn和CD163受体的荧光定量RT-PCR方法.结果显示,该方法在检测101 copies/μL～108 copies/μL模板范围内具有良好的线性关系.标准曲线的相关系数r值均大于0.996,扩增效率分别为100％和107％;该检测方法对Sn和CD163的检测下限均为10拷贝,敏感性高;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于5％,具有良好的重复性.利用该方法对PRRSV感染肺泡巨噬细胞(PAM) 72 h后Sn和CD163受体mRNA的转录水平进行了检测,结果表明Sn和CD163受体的转录 水平显著上调.本研究为PRRSV病毒感染后两种主要受体变化趋势的研究提供了有效的检测方法.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR和RT-LAMP快速检测方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是世界各地重要猪病毒性病原之一,每年给养猪业造成重大损失。本试验建立了应用TaqMan-LNA的荧光定量RT-PCR和逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)2种PRRSV检测方法。结果表明荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测下限分别为10²和10¹ 拷贝数/μL,都具有良好的特异性。临床样本检测结果同样表明2种方法都具有良好的特异性和灵敏度。本试验所建立的TaqMan-LNA荧光定量RT-PCR和RT-LAMP可有效的应用于PRRSV的检测。