同种异体骨髓基质细胞修复大鼠股骨缺损

目的：评估腺病毒介导的转BMP-2基因的同种异体骨髓基质干细胞的成骨潜能和免疫原性，探索骨缺损修复新途径。方法：将编码骨髓基质干细胞的基因，通过腺病毒介导转染同种异体骨髓基质干细胞后复合藻酸钙凝胶植入骨缺损部位并应用免疫抑制剂FK506。结果：术后8周检查，Adv—hBMP-2转染的同系骨髓基质干细胞-藻酸钙复合体组、Adv—hBMP-2转染的同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙-FK506复合体组以板层骨为主；Adv—hBMP-2转染的同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙复合体组以编织骨和类骨质为主，内有炎症细胞浸润；Adv-βgal转染的同系骨髓基质干细胞一藻酸钙复合体组、Adv-βgal转染的同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙-FK506复合体组、Adv-βgal转染的同种异体骨髓基质干细胞一藻酸钙复合体组无明显新骨形成．缺损区内为纤维结缔组织。结论：Adv—hBMP-2转染同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙一-FK506复合体可促进长骨干节段性骨缺损的修复。     

自体骨髓基质干细胞及可注射藻酸钙凝胶联合Mosaicplasly技术修复山羊膝关节股骨头大面积缺损

背景:目前修复软骨缺损的方法都存在修复组织数量不足,生物力学性能不佳,整合不良及供区并发症等缺陷.对于大面积的骨软骨复合缺损单独应用一种方法尚显不足.目的:观察组织工程方法复合Mosaicplasty技术用于修复大面积骨软骨缺损的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2009-01/09在青岛大学医学院中心实验室完成.材料:体外培养并扩增健康成年雄性山羊的骨髓基质干细胞,收集约3×10~7细胞,加入1 mL藻酸钠溶液重悬形成骨髓基质干细胞一藻酸钙凝胶材料.方法:12只山羊用于制各膝关节股骨髁大面积骨软骨缺损模型,骨髓基质干细胞-Mosaicplasty组使用自制Mosaicplasty器械,植入直径2 mm骨软骨柱镶嵌充填缺损,以自体骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶填充残余缺损和部分供区.Mosaicplasty组单纯用Mosaicplasty修复骨软骨缺损.对照组单纯制造缺损不修复.主要观察指标:①大体观察:术后4,8,16周分别切开关节观察修复效果.②组织学检查:术后16周取修复组织标本,行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色光镜下观察.③电镜观察:取16周修复组织行透射电镜检查.结果;术后16周时骨髓基质干细胞-Mosaicplasty组移植物固定牢固,关节面平滑,移植物间界限消失,新生软骨组织类似于正常软骨,4-16周修复效果逐渐改善,优于其他各组.光镜观察细胞-凝胶新生软骨组织与移植软骨结合紧密,新生软骨细胞排列规整,细胞外基质分布均一.对照组无明显修复.透射电镜观察发现修复新生组织中细胞形态类似软骨细胞,细胞存在于排列紧密的纤维网格中,基质丰富.结论:使用自体骨髓基质干细胞-藻酸钙凝胶材料复合Mosaicplasty技术可促进骨软骨整合,改善其修复效果.     

软骨源形态发生蛋白基因转染自体骨髓间充质细胞修复关节软骨缺损

背景:以支架或干细胞在一定程度上能够修复软骨缺损,但是研究中发现较大块的缺损修复效果还达不到令人满意的程度.基因转染后的干细胞能够不断的释放生长因子有可能够为软骨缺损研究带来突破.目的:进一步验证软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞是否会促进体内兔软骨修复.方法:从兔骨髓内分离获得骨髓间充质干细胞,脂质体感染的方法将软骨源形态发生蛋白基因转染到骨髓间充质干细胞中.实验组移植转染后的细胞;单纯骨髓间充质干细胞组移植未转染的骨髓间充质干细胞;空白对照组缺损区不移植细胞.术后行组织学检测及组织学评分分析修复情况.结果与结论:体内修复过程中,软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞促进了软骨再生.透明软骨填充了软骨缺损区,并且深部区域显示了软骨下成骨.透明软骨的重建区域优于单纯骨髓间充质干细胞移植组.组织学评分实验组高于骨髓间充质干细胞对照组和空白组.提示转染软骨源形态发生蛋白基因的骨髓间充质干细胞能够促进和提高关节软骨的改建和修复.     

温敏性壳聚糖水凝胶复合细胞因子修复兔关节软骨缺损☆

背景:单独以细胞因子修复软骨缺损时局部很难保持有效浓度,且维持时间非常有限. 目的:观察负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1温敏性壳聚糖水凝胶修复兔关节软骨缺损的可行性. 方法:通过京尼平的交联作用制备温敏性壳聚糖水凝胶,并负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1.取24只兔制作双侧膝关节软骨全层缺损模型,随机分为3组:结合组软骨下骨钻孔后以负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1的温敏性壳聚糖水凝胶充填软骨缺损,钻孔组行软骨下骨钻孔,对照组不做任何处理. 结果与结论:温敏性壳聚糖水凝胶在37℃凝胶时间为3 min,结构致密,为多孔三维支架,能缓慢释放基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1.结合组软骨修复在组织细胞形态、超微结构、Ⅱ型胶原含量等方面均明显优于钻孔组和对照组(P <0.05).说明负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1温敏性壳聚糖水凝胶结合软骨下骨钻孔能有效修复兔膝关节软骨全层缺损.     

胰岛素样生长因子1基因转染骨髓基质干细胞治疗裸鼠骨缺损

背景:众多的研究已证实胰岛素样生长因子1在成骨细胞的增殖、分化、基质合成中发挥重要的调控作用,并参与调节骨改建及修复的系列过程.目的:观察人胰岛祟样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞对骨损伤修复的促进作用及能否构建出具有良好生物学活性的组织工程人工骨,提高骨缺损修复质量.设计、时间及地点:对比观察,实验于2004-03/2005-05在苏州大学实验动物中心完成.材料:体外将胰岛素样生长因子1基因通过反转录病毒转入骨组织工程种子细胞骨髓基质干细胞,并与具有良好生物学活性的脱钙骨荩质材料复合.方法:BalB/C裸鼠15只制备颅骨8 mm缺损模型,随机数字表法分为3组,每组5只.胰岛素样生长因子1转染细胞组和空载体细胞组将两种不同植入物脱钙骨基质/胰岛素样生长因子1转染细胞和脱钙骨基质/空载体细胞分别植入颅骨缺损部位,空白对照仅造模,不进行任何干预造模后4周处死动物,取出颅骨进行组织学观察.主要观察指标:①反转录-聚合酶链反应检检测转染细胞胰岛素样生长因子 1 mRNA的表达.同时收集转染后细胞上清,用蛋白免疫印迹检测重组胰岛素样生长因子1的表达.②扫描电镜观察细胞/基质材料复合物共培养3,6 d后的生长情况.⑨颅骨缺损模型大体观察.④苏木精-伊红染色观察造模后4周各组颅骨缺损的修复情况.结果:①经反转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测,胰岛素样生长因子 1基因修饰的骨髓基质干细胞中有胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白的表达.②扫描电镜观察转染细胞与脱钙骨基质共培养3d时胰岛素样生长因子1转染细胞组脱钙骨基质材料表面已有大量细胞黏附并向深部空隙长入:6 d时脱钙骨基质表而黏附的细胞处已分泌出大量胶原纤维:而空载体细胞组各时间点黏附细胞数和胶原纤维产生量则均较少.⑨造模后4周各组植入物周围均无明显炎症反应,胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密:而空载体细胞组植入物可推动:空的对照组骨缺损处无新骨形成.④苏木精-伊红染色可见胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密,骨折缺损区有新骨及血管形成:空载体细胞组骨缺损区新骨形成较少:空白对照组缺损末见修复.结论:胰岛素样生长因子1转染的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合物具有较好的骨缺损修复功能.     

藻酸钙复合材料构建组织工程化骨修复大鼠股骨缺损

背景：骨形态发生蛋白2可诱导骨髓基质细胞向成骨或软骨系分化。既往多采用外源性给药方法，但其在体内易被代谢，骨诱导时间短，用量大，需反复使用，且成本高。 目的：观察藻酸钙与携带人骨形态发生蛋白2及β半乳糖苷酶基因的重组腺病毒的大鼠骨髓基质细胞复合构建组织工程化骨修复大鼠股骨缺损的效果。 设计、时间及地点：随机分组设计、动物对照观察实验，于2005-10／2006-12在河南省重点分子实验室完成。 材料：F344近交系大鼠12只和Wistar大鼠12只用于提取骨髓基质细胞，另外F344近交系大鼠48只用于制备股骨缺损模型。方法：扩增携带人骨形态发生蛋白2及β半乳糖苷酶基因的重组腺病毒（Adv-hBMP-2及Adv-β gal），培养大鼠骨髓基质细胞，分为Adv-hBMP-2转染组、Adv-β gal转染组和未转染组。腺病毒转染后与藻酸钠复合形成藻酸钙凝珠。建立大鼠股骨干中段连同骨膜截去6mm的缺损模型。F344近交系大鼠48只按随机数字表法分为6组，每组8只。缺损处分别植入不同的细胞复合物。同系细胞2组，供体为F344近交系大鼠：第1组Adv-hBMP-和Adv-β gal转染的骨髓基质细胞，应用FK506肌肉注射。第2组Adv-hBMP-2和Adv-β gal转染的骨髓基质细胞，未用FK506。同种异体细胞4组，供体为Wistar大鼠：第3组Adv-hBMP-2转染的骨髓基质细胞，应用FK506。第4组Adv-hBMP-2转染的骨髓基质细胞，未用FK506。第5组Adv-β gal转染的骨髓基质细胞，应用FK506。第6组Adv-β gal转染的骨髓基质细胞，未用FK506。FK506肌肉注射共3周，前2周每天1次，后1周隔天1次，每次剂量为1mg／kg。 主要观察指标：①转染后9d观察各组碱性磷酸酶染色阳性情况。②转染后3，6，9，12，15d进行碱性磷酸酶活性定量检测。③转染后21d行Von Kossa染色观察各组钙结节形成情况。④植入后2，4，6，8周摄x射线片检查观察各组新生骨痂和骨缺损愈合情况。⑤植入后8周在大鼠原骨缺损区取材，有明显成骨组织切片在低倍下显微照像并计算新生骨在骨缺损区域所占面积的百分数。 结果：Adv—hBMP-2转染组碱性磷酸酶染色可见多数细胞红染呈阳性，Adv—β gal转染组及未转染组染色阳性细胞少见。Adv-hBMP-2转染组各时间点碱性磷酸酶活性均高于Adv—β gal转染组及未转染组（P〈0．05），Adv—β gal转染组与未转染组间各时点差异均无显著性意义（P〉0．05）。Adv—hBMP-2转染组转染21d后Von Kossa染色显示钙结节形成，其他组未见钙结节。植入后2周起第1，3，4组X射线检查有明显骨痂形成，第1，3组骨痂密度高于第4组。第2，5，6组植入后各时段均无明显骨痂，缺损未愈合。植入后8周，第1，3组组织学检查表明以板层骨为主，第4组以编织骨和类骨质为主，内有炎症细胞浸润；第2，5，6组无明显新骨形成，缺损区内为纤维结缔组织。组织形态计量学分析表明第1，3组修复性新骨占原骨面积百分数大于第4组（P〈0．05）。 结论：Adv—hBMP-2转染同种异体骨髓基质细胞与藻酸钙复合体可用于修复大鼠股骨干节段性骨缺损。     

藻酸钙复合材料构建组织工程化骨及软骨的实验

背景：软骨组织工程的两个关键问题是种子细胞和支架材料，保证支架材料上有足够数量的功能细胞是体内形成骨和软骨组织的基础。目的：对经体外培养的骨髓基质干细胞与藻酸钙载体及生长因子复合形成的组织工程性骨及软骨进行形态学观察。设计：细胞形态对比，观察12周实验结果。单位：郑州大学骨科研究所，上海第二医科大学骨科实验室。对象：实验于2001—09／2002—06在上海第二医科大学骨科实验室完成。3月龄雄性新西兰大白兔9只，平均体质量3．2kg。方法：复合材料分别为：①藻酸钙。②藻酸钙＋骨髓基质细胞。③藻酸钙＋骨髓基质细胞＋类胰岛素生长因子Ⅰ。④藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β。⑤藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β＋类胰岛素生长因子Ⅰ。将5种组合注射于同一个体新西兰火白兔背部不同部位皮下组织中，每组各注射2处，共10处，每处0.2mL，分别做好标记。按组分别于术后4，8，12周取材，各时间点处死动物3只，取兔背部皮下增殖物进行骨和软骨组织生成物观察，应用苏木精-伊红、甲苯胺蓝、Masson、番红-O染色技术。主要观察指标：兔背部皮下增殖物的组织学观察。结果：兔背部皮下增殖物的组织学观察结果：4周时可见藻酸钙＋骨髓基质细胞＋类胰岛素生长因子Ⅰ、藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β、藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β＋类胰岛素生长因子Ⅰ组有岛状软骨样组织形成，软骨细胞包绕于碱性基质中，8周时复合物中形成大量的类软骨结构，并部分向骨组织转化，细胞周围有大量的基质分泌，部分软骨细胞呈簇状分布。12周时藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β＋类胰岛素生长因子Ⅰ组软骨组织基本转变为骨组织，并开始吸收。结论：骨髓基质细胞-藻酸钙-生长因子复合材料能形成软骨及骨组织。藻酸钙适合骨髓基质细胞生长，是一种良好的骨及软骨组织工程载体。     

温敏性壳聚糖水凝胶复合细胞因子修复兔关节软骨缺损

背景：单独以细胞因子修复软骨缺损时局部很难保持有效浓度,且维持时间非常有限。目的：观察负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1温敏性壳聚糖水凝胶修复兔关节软骨缺损的可行性。方法：通过京尼平的交联作用制备温敏性壳聚糖水凝胶,并负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1。取24只兔制作双侧膝关节软骨全层缺损模型,随机分为3组：结合组软骨下骨钻孔后以负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1的温敏性壳聚糖水凝胶充填软骨缺损,钻孔组行软骨下骨钻孔,对照组不做任何处理。结果与结论：温敏性壳聚糖水凝胶在37℃凝胶时间为3min,结构致密,为多孔三维支架,能缓慢释放基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1。结合组软骨修复在组织细胞形态、超微结构、Ⅱ型胶原含量等方面均明显优于钻孔组和对照组（P〈0.05）。说明负载基质细胞衍生因子1β、转化生长因子β1温敏性壳聚糖水凝胶结合软骨下骨钻孔能有效修复兔膝关节软骨全层缺损。     

生物材料与软骨组织工程：本刊中文部

5同种异体脱钙骨基质复合自体骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损 推荐理由：课题前期研究观察到不同脱钙时间对骨髓基质干细胞的增殖产生影响,其中脱钙6h的脱钙骨基质具有最好的细胞相容性,故实验采用脱钙6h的脱钙骨基质作为支架材料,复合骨髓基质干细胞移植修复关节软骨缺损,结果显示修复全层关节软骨缺损的效果良好。     

同种异体脱钙骨基质复合自体骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损

背景:脱钙骨基质具有良好的生物相容性,是临床常用的骨缺损修复材料.骨髓基质干细胞具有向骨及软骨细胞分化的潜能,适合骨软骨缺损修复.目的:观察同种异体脱钙骨基质复合自体骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损的效果.方法:27只兔均建立骨软骨缺损模型,造模后随机分为3组:复合材料组钻孔植入复合自体骨髓基质干细胞培养8 d的脱钙骨基质块,单纯脱钙骨基质组钻孔单纯植入脱钙骨基质块,模型对照组钻孔后不植入任何材料.取材后对修复组织进行大体观察、组织学观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定,并参照Wakitani评分标准对修复组织进行评分.结果与结论:植入后12周,复合材料组修复组织呈透明软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨及软骨下骨结合良好;单纯脱钙骨基质组有部分软骨样修复;而模型对照组仅有少量纤维性修复.植入后12周,复合材料组、单纯脱钙骨基质组修复组织Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性,修复细胞表达Ⅱ型胶原,为软骨细胞;模型对照组呈阴性表达.植入后4,8,12周,复合材料组修复效果评分均显著优于单纯脱钙骨基质组、模型对照组(P<0.01).说明自体骨髓基质干细胞复合同种异体脱钙骨基质支架材料修复兔全层关节软骨缺损的效果良好.