猪链球菌2型溶血素的纯化及生物学活性研究

目的:摸索天然和重组猪链球菌2型溶血素的纯化工艺,评价制备蛋白的生物学活性。方法:天然猪溶血素的纯化采用硫酸铵沉淀,阴离子交换层析和疏水层析制备,重组猪溶血素采用镍柱亲和层析进行柱上变复性后,用Th iolproyl-sepharose 6B进一步亲和纯化。通过溶血实验,细胞毒性测定实验评价纯化蛋白的活性。结果:制备的天然和重组猪溶血素纯度均在90%以上,具有较高的溶血活性,较高浓度时能损伤靶细胞,胆固醇能够完全封闭其活性。结论:制备获得的重组猪溶素与天然蛋白具有相近的生物学活性,为进一步研究猪链球菌2型溶血素在猪链球菌致病机制方面的作用奠定了基础。     

高活性的人白细胞介素-3突变体的构建与表达

目的:在大肠杆菌中构建表达高活性的人白细胞介素-3(hIL-3)突变体。方法:通过定点突变的方法构建hIL-3突变体K116V和K116W的表达载体,并实现hIL-3突变体在大肠杆菌中的表达。对所得包涵体蛋白依次溶解、纯化、透析复性。用Westernblot检测hIL-3突变体的特异性。单溶液细胞增殖(MTS)测定hIL-3突变体的生物学活性。结果:hIL-3在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上,主要以包涵体的形式存在。将包涵体溶解在8mol/L脲中,经Ni-NTA-Sepharose柱纯化后纯度达90%以上。MTS法测定hIL-3突变体K116V的活性为野生型的5倍,K116W的生物学活性也有所增加。结论:获得了高活性的hIL-3突变体K116V,有望成为hIL-3的替代品,也证明了hIL-3第116位的赖氨酸残基对于hIL-3的生物学活性很重要。     

突变型天花粉蛋白TCSYFF81-83ACS的生物活性及免疫原性分析

目的:构建一种突变型天花粉蛋白(trichosanthin,TCS),并对其生物活性和免疫原性进行分析。方法:选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点(YFF81-83)进行定点突变,并将所构建的突变体(TCSYFF81-83ACS)在大肠杆菌中进行表达及纯化。随后与野生型TCS(wTCS)比较,分析其DNA酶活性、致核糖体失活活性、免疫原性和急性毒性。结果:初步检测显示,所构建的突变型TCS活性与wTCS活性几乎相当,而其免疫原性有所降低。结论:通过该方法改造TCS是可行的,有可能为抗HIV治疗提供一种高效、低毒、廉价的药物。     

10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶迭代饱和突变与活性位点分析

目的利用迭代饱和突变技术进一步提高10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶双突变体DBAT~(G38R/F301V)的活性;通过丙氨酸扫描确定DBAT活性中心的重要位点。方法利用迭代饱和突变技术在现有双突变体DBAT~(G38R/F301V)的基础上对Ser~(396)进行半饱和突变,筛选对10-去乙酰紫杉醇(DT)催化活性提高的突变体;对获得的高活性突变体蛋白进行催化DT的最适温度和最适pH测定;在最适pH条件下,将其分别用最适反应温度和0℃温育6 h,考察该蛋白的热稳定性;采用生物信息学方法分析活性提高的分子机制。对DBAT底物结合区域尚未进行分析的几个氨基酸进行丙氨酸扫描研究,分析这些位点在DBAT催化10-DAB和DT过程中的作用。结果获得了三突变体DBAT~(G38R/F301V/S396I),其催化DT的活性为DBAT~(G38R/F301V)的1.6倍,该蛋白催化DT的最适条件为37.5℃,pH 7.5;该蛋白在37.5℃静置6 h后催化DT的活力为初始值的30%,在0℃静置6 h后为初始值的70%;丙氨酸扫描结果显示,Asn~(45)在DBAT催化10-DAB和DT时都非常重要,而Asn~(42)、Glu~(350)、Glu~(355)和Lys~(389)位点对催化10-DAB的影响更大。结论将活性口袋内的亲水性氨基酸向疏水性氨基酸突变可能有利于DBAT对DT的催化,但氨基酸侧链的长度和空间构型也是影响催化活性的重要因素;发现Asn~(45)可能是一个潜在的DBAT催化或底物结合位点。     

钙调蛋白突变体CaM_(D130G)和CaM_(D96V)的制备提取与纯化

目的制备纯化钙调蛋白突变体CaM_(D130G)和CaM_(D96V)的蛋白,为后续体外实验研究提供高浓度高纯度的突变体蛋白奠定基础。方法采用基因重组将重组质粒pGEX-6P-3/GST-CaM_(D130G)和pGEX-6P-3/GST-CaM_(D96V)转化入大肠杆菌,在大肠杆菌中诱导表达相应的蛋白,再采用超声破碎法制备融合蛋白,并且采用Precission protease进行酶切,SDS-PAGE确认制备蛋白的浓度与纯度,Pull-down assay的方法检测蛋白的活性。结果本研究制备了较高浓度与纯度的钙调蛋白突变体CaM_(D130G)和CaM_(D96V)蛋白,CaM_(D130G)蛋白能浓度依赖性地与心肌钙通道蛋白片段CT1结合,而CaM_(D96V)蛋白能浓度依赖性地与心肌钙通道蛋白片段pre-IQ结合,制备的CaM_(D130G)和CaM_(D96V)蛋白具有很好的活性。结论基因重组、超声破碎的方法能制备高浓度、高纯度以及高活性的突变体CaM_(D130G)和CaM_(D96V)蛋白,为进一步研究奠定坚实的基础。     

链霉亲和素突变体凝胶柱的制备及生物素修饰蛋白纯化

目的对链霉亲和素(SA)进行定点突变,降低与生物素之间的亲和力,制备SA突变体琼脂糖凝胶柱,并摸索最适洗脱条件,以达到纯化生物素修饰蛋白的目的。方法原核表达SA突变体蛋白使用Ni-NTA纯化树脂进行纯化,将SA突变体蛋白与溴化氰活化琼脂糖凝胶4FF(CNBr-activated Bestarose TM 4FF)偶联制备凝胶柱。生物素修饰蛋白与凝胶柱孵育后,以不同浓度NaOH对生物素修饰蛋白进行洗脱回收,ELISA检测SA突变体蛋白亲和力。通过Western blot法、考马斯亮蓝染色检测纯化效果。结果成功表达并纯化五种SA突变体,并制备凝胶柱。ELISA结果计算得到SA突变体对生物素修饰蛋白的亲和常数相较野生型SA均有所降低。将生物素修饰蛋白与五种凝胶柱相结合,通过Western blot法和考马斯亮蓝染色结果筛选出SA突变体M2凝胶柱可以在10 mmol/L NaOH洗脱条件下,纯化出生物素修饰蛋白,并且SA突变体M2凝胶柱能够对生物素修饰蛋白进行再次纯化。结论成功制备了SA突变体琼脂糖凝胶柱,为生物素修饰蛋白的纯化提供了可行性方案。     

葡萄球菌肠毒素B突变体(K172E)的制备和抗肿瘤活性分析

目的 :制备葡萄球菌B型肠毒素 (SEB)突变体 ,观察其抗肿瘤活性变化。方法 :将诱导表达的SEB突变体重组蛋白包涵体进行变性复性和分离纯化 ,并对其肿瘤抑制活性与野生型SEB进行比较。观察突变体蛋白的抑瘤效果。结果 :建立了可行的包涵体复性条件和纯化方法 ,获得的突变体蛋白具有明显的抗肿瘤作用 ,其抑瘤活性比野生型SEB至少高 10倍。结论 :获得的突变体SEB K172E的抗肿瘤效果经体外实验证实优于野生型SEB ,有可能成为一种较具潜力的抗肿瘤药物     

负载K-ras抗原的DCs诱导CTLs对胰腺癌的体外杀伤作用

目的:研究负载K-ras (12-Val)抗原的树突状细胞(DCs)活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对胰腺癌的体外杀伤作用.方法:联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子( rhGM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导培养外周血DCs.表达K-ras突变体的胰腺癌细胞株全瘤、单纯K-ras突变体多肽和K-ras突变体表位肽阳离子纳米颗粒分别致敏DCs.流式细胞仪测定DCs表面标志;~3H-TdR掺入法检测细胞增殖,~(125)I-UdR法检测CTL杀伤效应,ELISA试剂盒检测IL-12和IFN-γ.结果:与单纯K-ras(12-Val)突变体多肽相比,K-ras(12-Val)突变体表位肽阳离子纳米颗粒在低浓度时即可被DCs有效提呈(P＜0.05);负载全瘤抗原的DCs诱导产生的CTL与负载单纯K-ras(12-Val)突变体多肽、K-ras(12-Val)突变体表位肽阳离子纳米颗粒诱导组相比对Patu8988(K-ras+)及SW1990(K-ras-)胰腺癌细胞均有明显杀伤活性(P＜0.05),负载单纯K-ras(12-Val)突变体多肽、K-ras(12-Val)突变体表位肽阳离子纳米颗粒的DCs诱导产生的CTL对Patu8988(K-ras+)细胞株有特异性杀伤活性(P＜0.05),而对SW1990(K-ras-)细胞株无杀伤作用(P＞0.05).结论:低浓度K-ras(12-Val)突变体表位肽阳离子纳米颗粒作用后,在短时间即可被DCs有效提呈,且诱导产生的CTL对表达K-ras(12-Val)突变体的胰腺癌细胞株有特异性杀伤活性.     

通过矿化提高蛋白疫苗稳定性的研究

目的:通过原位矿化的方式制备肺炎链球菌蛋白质的磷酸钙矿化颗粒,并评价其在蛋白酶和热处理后的稳定性。方法:通过分子克隆技术表达并纯化蛋白野生型溶血素(WT-PLY)和其无溶血活性突变体(ΔA146PLY),在富含Ca~(2+)和PO_4~(3-)的弱碱性溶液(pH=7.5)中进行生物矿化,制备磷酸钙矿化的蛋白颗粒;通过TEM、FESEM、EDS等分析矿化颗粒的大小、形貌及表面成分;通过抗蛋白酶K降解实验、溶血实验等分析矿化疫苗的稳定性;通过体外细胞实验和体内动物实验评估热处理后矿化蛋白疫苗的保护效应。结果:在1 ml矿化体系中含有360μg蛋白、8.8μmol Ca~(2+)、8.8μmol Mg~(2+)和5.28μmol PO_4~(3-)的条件下,均可制备出WT-PLY和ΔA146PLY的矿化颗粒,BCA检测其包封率分别为44.4%和52.2%;矿化颗粒WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP在蛋白酶K处理15 min内其抗酶解活性高于其可溶性蛋白;矿化颗粒WT-PLY@CaP在55℃处理5 min和45℃处理60 min后,其溶血活性较其可溶性蛋白高;矿化颗粒ΔA146PLY@CaP在55℃处理5 min和45℃处理60 min后仍保持与未处理蛋白一致的免疫活性。结论:生物矿化有助于提高蛋白稳定性。这为疫苗蛋白及其他蛋白制品稳定性的提高提供了一种简便易行的矿化方法。     

调节破骨细胞分化的RANK特异性基序的再确认

目的： 进一步确认核转录因子NF-κB受体激动剂（RANK）蛋白中调节破骨细胞(OC)分化的特异性基序(motif),为阐明OC分化机制提供理论依据。方法: 分别突变RANK蛋白膜内部分第533-540之间的8个氨基酸（突变前氨基酸序列为DIIVVYVS,突变后氨基酸序列为ELLAAFAA）,用定点突变方法构建8个由肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)和RANK跨膜部分和膜内部分共同组成的TNFR1/RANK突变嵌合体(TNFR1/RANK-533-TNFR1/RANK-540),每1个突变体在其RANK膜内部分含1个突变氨基酸。用包装细胞plat E分别将各突变体包装成逆转录病毒,通过逆转录病毒感染分别将这些突变体转染到TNFR1/TNFR2基因敲除小鼠的骨髓巨噬细胞(BMM)中。用TNF-ɑ和单核细胞集落刺激因子（M-CSF）刺激、观察转染哪种突变体的BMM不能诱导OC形成,不能诱导OC形成的突变体所包含的突变前氨基酸就是RANK调节OC分化的关键氨基酸,多个关键氨基酸组成的片段就是RANK特异性motif。结果: 转染TNFR1/RANK-533、TNFR1/RANK-539和TNFR1/RANK-540的BMM均能分化成OC,表明氨基酸D533、V539、S540突变后对OC分化无影响;转染TNFR1/RANK-534的BMM有极少数能分化成OC,表明氨基酸I534突变后对OC分化有部分影响;而转染TNFR1/RANK-535、TNFR1/RANK-536、TNFR1/RANK-537和TNFR1/RANK-538的BMM均不能分化成OC,表明氨基酸I535、V536 、V537和Y538突变后对OC分化起关键影响。结论: I534、I535、V536 、V537和Y538这5个氨基酸组成的片段（534-IIVVY-538）可能就是RANK调节OC分化的特异性motif。