天花粉蛋白突变体TCSFYY163-165CSA的构建表达与纯化

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并在原核系统进行表达及纯化。方法:应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇(FYY163-165),并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模扳,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot法鉴定和Ni-NTA层析纯化。结果:构建了带有TCS突变体基因(TCSFYY163-165CSA)的重组表达质粒,使目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论:成功地构建了TCS突变体基因TCSFYY163-165CSA,并获得高效表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。     

猪溶血素突变体的构建及活性评价

目的:构建无溶血活性的猪溶血素突变体,并对制备蛋白进行功能评价。方法:根据猪溶素的晶体结构,采用定点突变分别将其353位脯氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。重组表达的突变体蛋白采用镍柱亲和层析进行柱上复性后,评价纯化蛋白的溶血活性和免疫原性。结果:获得三种猪溶素突变体,SLY(P353A),SLY(P353L)和SLY(P353V)。溶血试证明SLY(P353V)无溶血活性,蛋白质免疫印迹和动物实验显示SLY(P353V)具有免疫原性。结论:猪溶素突变体SLY(P353V)无溶血活性,有免疫原性。     

天花粉蛋白突变体TCSRL28-29CG的构建、表达与纯化

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并进行表达及纯化。方法:应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇,并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模扳,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行N i-NTA层析纯化。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论:成功地构建了TCS突变体基因TCSRL28-29CG,并获得高效表达。     

HMGA23'-UTR双荧光素酶报告载体构建及与miR-33b-5p的靶向验证北大核心CSCD

目的:构建野生型及突变型HMGA2基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证miR-33b-5p与HMGA2之间的靶向关系。方法:生物信息学相关软件预测miR-33b-5p与HMGA2之间的靶向关系;PCR扩增HMGA2的基因片段,构建HMGA2野生型和突变型双荧光素酶报告载体;将miR-33b-5p和阴性对照物分别与野生型GV272-HMGA2-wt-3’-UTR或突变型GV272-HMGA2-mut-3’-UTR双荧光素酶报告载体共转染293T细胞,然后检测荧光素酶的活性。结果:成功构建野生型及突变型HMGA2基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,双荧光素酶报告系统的结果显示,加入miR-33b-5p可使野生型GV272-HMGA2-wt-3’-UTR的荧光素酶活性降低,但突变型GV272-HMGA2-mut-3’-UTR的荧光素酶活性与对照组相比则未发生显著变化。结论:野生型及突变型HMGA23’-UTR双荧光素酶报告载体构建成功;miR-33b-5p与HMGA2之间存在靶向关系。     

天花粉毒蛋白免疫毒素对黑色素瘤细胞的体外抑制

用单链致核糖体失活蛋白天花粉蛋白(TCS)和抗人黑色素瘤单抗(Ng76)构建了免疫毒素(Ng76—TCS),它对体外培养的人黑色素瘤细胞M21具有强烈的抑制活性,IC_(50)为5.6×10~(-10)mol/L,其毒性比游离的TCS 和Ng76的混合物高2000倍,比TCS 与正常小鼠免疫球蛋白的复合物(NIgG—TCS)高160倍,而它对非靶细胞HeLa 的IC_(50)为7.0×10~(-?)mol/L,毒性较靶细胞低125倍。结果表明,免疫毒素TCS—Ng76对体外培养的黑色素瘤细胞有很强的选择性杀伤作用.     

阴道毛滴虫LAG1基因启动子区克隆及分析

本研究旨在克隆并分析阴道毛滴虫LAG1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控提供实验资料。预测启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,然后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在构建的6种荧光素酶报告基因表达体系及2种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系中,表达载体pGL3-455(-455~ 55bp)、pGL3-417(-417~ 55bp)、pGL3-280(-280~ 55bp)、pGL3-202(-202~ 55bp)、pGL3-81(-81~ 55bp)的荧光素酶表达活性相近,均明显高于表达载体pGL3-47(-47~ 55bp)荧光素酶表达活性,而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近,提示-47~ 55bp区无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-81(-81~ 55bp)有明显的绿色荧光蛋白表达,而pEGFP-47(-47~ 55bp)和空载体pEGFP-1未见表达。因此-81~-47bp区域含有阴道毛滴虫LAG1基因转录所必需的基本启动子序列。     

TFF1基因启动子双荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

目的:构建含有野生型或突变型人三叶因子1(Trefoil factor 1,TFF1)基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并研究雌激素对上述启动子转录活性的影响。方法:设计人野生型和突变型TFF1基因启动子的引物,扩增回收片段,将其克隆到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中构建重组质粒,经双酶切和测序鉴定后转染胆囊癌GBC-SD细胞,24h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的表达活性。结果:成功构建了野生型pGL3-TFF1质粒和雌激素应答元件(Estrogen response elements,ERE)位点突变的pGL3-TFF1-△ERE突变质粒,激活蛋白1(Activating protein-1,AP-1)位点突变的pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒。经双荧光素酶报告基因检测分析,pGL3-TFF1质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒均具有基础转录活性,与对照组比较(P0.001)。雌激素能进一步增强野生型TFF1启动子质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒的启动子转录活性(P0.01),而对pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒的活性无影响(P0.05)。结论:本研究成功构建了野生型以及突变型TFF1启动子质粒,发现非经典雌激素受体结合部位——激活蛋白1(AP-1)位点对雌激素诱导的TFF1启动子转录活性增强发挥决定性作用。     

三氯生联合纳米银用于增强抗菌效果的研究

目的设计合成一类新型的三氯生-纳米银(TCS-Ag NPs)联合抗菌剂,对其理化性质进行表征,并研究其体外抗菌活性。方法通过半胱氨酸(Cys)上的巯基将甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(Gly-Gly-Cys)三肽修饰的三氯生(TCS)连接到纳米银(Ag NPs)上,得到TCS-Ag NPs。利用核磁氢谱(~1H-NMR)和高分辨质谱(HRMS)对三氯生-戊二酸酐-甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(TCS-GA-Gly-Gly-Cys)进行结构确证;通过动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)分析纳米粒的粒径和形貌;通过紫外-可见吸收光谱表征纳米粒的光学性质;采用扫描电子显微镜(SEM)和全波长多功能酶标仪分别定性和定量地研究TCS-Ag NPs对金黄色葡萄球菌的增殖抑制效果。结果 TCS-Ag NPs粒径为45 nm左右的球形纳米粒。TCS-Ag NPs的ζ-电位为(-26.6±1.9)mV。TCS-Ag NPs对金黄色葡萄球菌的增殖抑制呈现质量浓度依赖性,在0.5~20.0μg/mL的Ag质量浓度及0.4~16.0μg/mL的TCS质量浓度范围内,其抑菌效果均好于Ag NPs和游离TCS。结论TCS-Ag NPs是一种有效的纳米抗生素,能发挥广谱抗菌剂Ag NPs和抗生素TCS的协同抗菌效果,对细菌进行联合杀伤。     

HBV PC区和BCP区变异与Peg-IFNα-2b疗效的关系及治疗前后的变化

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)前核心区(PC区)G1896A和基本核心启动子区(BCP区)A1762T/G1764A突变与聚乙二醇化干扰素α-2b(Peg-IFNα-2b)治疗应答的关系及相关变异在治疗前后的变化。方法:69例HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者,接受48周Peg-IFNα-2b治疗并随访24周。PCR扩增每位患者第0周和第72周HBV PC和BCP区并测序分析突变情况,同时监测患者第0、4、8、12、24、36、48、60和72周HBsAg、HBeAg、丙氨酸转氨酶(ALT)和HBV的DNA水平。结果:共14例患者检测为野生型(20.29%),55例患者检测为突变型(79.71%)。野生型较突变型HBeAg基线水平更高(P=0.024)。患者基线和72周时野生型、PC突变型、BCP突变型和PC+BCP突变型所占构成比发生明显变化(P=0.004)。野生型、PC突变型、BCP突变型和PC+BCP突变型患者在72周的HBeAg血清转换率和联合应答率差异均无统计学意义。结论:PC区和BCP区突变对HBeAg阳性B/C基因型CHB患者Peg-IFNα-2b治疗应答无明显影响,但治疗前后各突变所占构成比发生明显变化。     

重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性.方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性.结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104 IU/mg.结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当.为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础.     

山羊IL-18成熟蛋白在昆虫细胞/杆状病毒中的表达及其活性分析

目的:在昆虫细胞/杆状病毒中表达山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白,并对其生物学活性进行分析。方法:将编码山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白的基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual上,构建重组质粒pFastBac Dual-gIL18,将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18,在Cellfectin作用下,将Bacmid-gIL18转染昆虫细胞sf9,收获感染后不同时间段的细胞,进行SDS-PAGE、Western blot检测和生物学活性分析。结果:重组蛋白获得正确表达具有良好的免疫原性;生物学活性分析表明,重组蛋白能够促进淋巴细胞增殖、诱导淋巴细胞分泌IFN-γ。结论:用昆虫细胞/杆状病毒系统成功表达了gIL-18成熟蛋白,且具有良好的免疫原性和生物学活性,从而为进一步研究gIL-18作为免疫调节剂和免疫佐剂在生产上的应用奠定了基础。     

新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测

目的检测新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性。方法采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出最佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性。结果成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是最多的。经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性。结论融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。     

SmB/B’抗原表位的表达及其免疫原性研究

为了构建SmB/B’抗原表位的真核表达载体 ,通过体内、外进行表达并研究其免疫原性 ,采用异硫氰酸胍一步法提取BALB/c小鼠脾脏总RNA ,通过RT PCR方法克隆了含编码SmB/B’抗原表位的目的DNA ,构建了其真核表达质粒pcDNA3 fSmB/B’ ,体外转染HeLa细胞检测其表达及与抗体结合活性。体内采用基因免疫的方法对其免疫原性进行研究。结果 :成功构建pcDNA3 fSmB/B’真核表达质粒 ,Westernblot显示其在真核细胞内可有效表达且与抗SmB/B’抗体具有结合活性 ,经基因免疫实验组小鼠皆产生抗SmB/B’抗体。构建的SmB/B’抗原表位真核表达载体可在体内、外有效表达 ,且表达的抗原表位具有免疫原性     

家蚕过敏原Profilin的表达、纯化、免疫学鉴定及其生物信息学分析

目的:克隆表达家蚕(Bombyx mori)Profilin蛋白,鉴定其免疫原性并进行B细胞抗原表位预测和构建分子进化树。方法:从NCBI上获取家蚕Profilin蛋白的基因序列,合成该基因并构建到pet-28a表达载体上,重组质粒转化至E.coli BL21,IPTG诱导基因表达,通过亲和层析获取高纯度蛋白;用Western blot方法对重组蛋白进行过敏原性鉴定;通过DNAStar软件分析其潜在的B细胞抗原表位;应用MEGA5.05进行序列比对,并构建分子进化树。结果:成功表达出重组蛋白,且重组蛋白与家蚕过敏患者血清有一定的Ig E结合。结论:成功克隆表达出具有免疫原性的Profilin蛋白,并成功预测出其B细胞抗原表位和构建出分子进化树。     

血红素加氧酶-1重组载体的构建及在胃癌细胞中的初步研究

目的 构建人血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)及其突变体的真核表达载体,观察其在胃腺癌细胞中HO-1表达和活性变化,研究HO-1活性变化的胃腺癌细胞对顺铂抗药能力的变化,为进一步研究HO-1对肿瘤细胞影响机制奠定基础.方法 根据GenBank中HO-1 cDNA序列设计引物,调取基因并克隆人pcDNA3.1(+)质粒中,构建表达人野生型HO-1与突变型HO-1(HO-1G143H)的重组质粒.脂质体介导重组质粒转染胃腺癌细胞BGC823,用RT-PCR和Western印迹法分别检测细胞中HO-1 mRNA的表达和蛋白表达水平,体外测定HO-1活性变化,应用顺铂进行体外抗药性实验.结果 酶切鉴定和测序证实,HO-1真核表达载体构建成功;转染质粒后的BGC823,HO-1的mRNA和蛋白的表达水平明显上升;转入野生型质粒的细胞HO-1活性上升,转入突变型质粒的细胞HO-1活性下降;HO-1活性下降BGC823细胞抗顺铂杀伤能力增强.结论 构建了HO-1野生型与突变型真核表达载体;将其转入胃腺癌细胞,引起了HO-1的mRNA和蛋白表达的增加和活性变化;体外实验表明,HO-1活性下降的BGC823细胞抗顺铂能力增强.     

重症肌无力治疗性单价IgG抗体基因的构建

目的:构建一株对重症肌无力(MG)具有特异性免疫治疗作用的单价IgG类抗体基因.方法:应用定点突变技术,将致病性抗乙酰胆碱受体(AChR)抗体IgG637的重(H)链第322位氨基酸进行K322A突变,获得的突变型抗体IgG637/K322A基因再进行H链互补决定区3(CDR3)缺失突变,获得突变型抗体IgG637/K322A/CDR3ΔPLKP基因.经转化大肠杆菌XL1-Blue进行增殖后,转染哺乳类细胞CHO-k1进行表达,表达产物经ELIAS检测与补体C3的结合活性,经RIA检测与特异性抗原人AChR的结合活性.突变抗体H链再经杵(T366Y)臼(Y407T)突变,以利于异源H链的配对.结果:突变型抗体IgG637/K322A丧失了与补体C3结合的能力,突变型抗体IgG637/K322A/CDR3ΔPLKP丧失了与人AChR结合的能力.测序证实已经获得了预想的杵臼突变序列.结论:已经成功的制备了无补体激活能力的单价IgG类抗AChR抗体基因.     

溶藻弧菌抗独特型抗体单链抗体在毕赤酵母中的表达

目的构建溶藻弧菌抗独特型抗体的单链抗体(scFv)基因的毕赤酵母分泌型表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法从分泌溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中克隆该抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因(GenBank accession No:DQ011530和DQ011531),并通过基因重组为scFv基因。然后将其克隆入毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K中,经序列测定后,电转化入毕赤酵母菌SMD1168中,将经表型筛选和G418抗性筛选的重组酵母菌株进行PCR鉴定。以甲醇进行诱导表达,表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。结果获得毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K-scFv,经G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株,ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。结论构建溶藻弧菌抗独特型抗体的scFv基因的真核表达载体并成功表达,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

靶向EGFR二聚化界面的肿瘤多肽疫苗P64k-EGFR262-328的构建及免疫原性分析

目的 构建靶向EGFR二聚化界面的肿瘤多肽疫苗P64k-EGFR262-328并分析其免疫原性.方法 采用重叠延伸PCR来扩增P64k-EGFR262-328融合基因,克隆至pMD18-T,经测序鉴定后与pET-21b构建重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3).目的蛋白经IPTG诱导表达后用Source Q阴离子层析和Ni-NTA亲和层析纯化,纯化的融合蛋白乳化后免疫BALB/c小鼠分析其免疫原性.结果 获得了2031 bp的融合基因,IPTG诱导后获得了相对分子质量(Mr)70 000大小的目的蛋白,经两步柱层析后,融合蛋白达到了95％以上的纯度,并在小鼠体内产生了高达1:16 000以上的抗体滴度.结论 成功制备了肿瘤多肽疫苗P64k-EGFR262-328.     

人EPHB2基因启动子的初步鉴定

目的为进一步研究人EPHB2基因的表达调控机制,初步鉴定、分析该基因的启动子。方法在对人EPHB2基因的生物信息学分析的基础上,在EPHB2基因的转录起始位点已明确的前提下,克隆了该基因的5′侧翼区,并对该区进行功能分析,分别构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒,将它们瞬时转染293细胞,检测其荧光素酶活性。结果EPHB2的5′侧翼区的-138～ 83区域的启动子活性不高,而从-425～ 83开始显著升高,-1174～ 83区域的启动子活性又出现明显降低。结论人EPHB2基因启动子的较小区域位于其5′侧翼区的-425～-139区域。另外,在-1174～-970区域可能存在着沉默子。     

肺炎链球菌毒力相关基因licC的活性研究

目的:克隆、表达肺炎链球菌LicC及LicC3′端25个氨基酸缺失片段(记作△LicC)基因;分析、比较目标蛋白活性,证实LicC部分缺失对其活性的影响。方法:通过基因重组技术构建重组质粒pQE80-licC、pQE80-△licC,转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,自建生物荧光技术测定酶活性。结果:成功构建重组表达载体,获得可溶性LicC和LicC截短体蛋白,活性测定表明LicC截短体活性显著低于LicC(P0.05)。结论:自建生物荧光技术测定LicC活性准确、可靠;证实LicC3′端25个氨基酸对其活性有重要影响;提示抑制LicC活性有可能成为一种有效的杀灭耐药肺炎链球菌的措施。